正常皮肤CD1a+ DC、Somatostatin+ DC的免疫表达研究
作者：夏 青 张学军
单位：安徽医科大学皮肤性病学教研室，合肥 230032
关键词：树突状细胞；免疫学；Somatostatin+树突状细胞；CD1a+树突状细胞
安徽医科大学学报990605摘要 目的 探讨正常皮肤CD1a+树突状细胞(CD1a+ DC)、Somatostatin+树突状细胞(Somatostatin+ DC)的免疫表达和分布特点。方法 应用免疫组化SABC法检测10例正常人皮肤中CD1a+ DC、Somatostatin+ DC的定位定量情况，分别采取BCIP/NBT、AEC和双标法染色；双标记研究包括CD1a、Somatostatin、S-100、HLA-DR四种抗体。结果 CD1a+ DC主要分布于表皮棘细胞层，具有4个树突结构，大小与角朊细胞相近，每毫米表皮数量在2～28个之间，在毛囊外根鞘中上部位和皮脂腺开口处可见密度相当的CD1a+ DC，CD1a+ DC复合表达S-100和HLA-DR，不表达Somatostatin；Somatostatin+ DC主要集中于真皮网状层和乳头部位，每毫米真皮中约为4～16个。结论 朗格汉斯细胞(LC)表达CD1a和S-100，但表达CD1a的DC未必都是LC，表皮和真皮中存在不同类型的DC，Somatostatin+ DC可能是皮肤中DC一个特独的亚型。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R75；R392.3
Study on the expression of CD1a+ DC、somatostatin+ DC in normal skin
Xia Qing, Zhang Xuejun
(Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To explore the expression and the distribution of CD1a+ DC、Somatostatin+ DC in normal skin. Methods By double-labelling immunohistochemical technology, the author has mapped and quantified the distribution of CD1a+ DC、somatostatin+ DC. They were stained with BCIP/NBT、AEC and double-lobelling. The antibodies included anti-CD1a、S-100、HLA-DR and somatostatin. Results The results showed that CD1a+ DC mainly distributed within the spinous and basal layers of the epidermis. The average number of dendritic structure was about 4. The number of DC in outer root sheath and sebaceous gland as well as epidermis was 2～28/mm. CD1a+ DC coexpressed S-100 and HLA-DR except somatostatin. Somatostatin+ DC majorly concentrated in the papillary and upper reticular dermis, and it was a subgroup of dermal dendritic cell. The number of sometostation+ DC in dermal is 4 to 16. Conclusion LC coexpressed CD1a or LC and not all DCs expressing CD1a are LC. A variety of DCs existed in epidermis and dermis. Somatostatin+ DC is a subgroup of dendritic cells in skin.
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MeSH dendritic cell/ immunology; somatostatin+ dendritic cell; CD1a+ dendritic cell
研究发现正常人皮肤中存在多种树突状细胞(DC)，除朗格汉斯细胞(LC)外还有黑色素细胞、Merkel细胞、组织单核巨噬细胞、未定类细胞、真皮树突状细胞(DDC)等，它们成为皮肤免疫系统重要组成部分，一些皮肤病的病理反应可能开始于DC。我们通过用免疫组化SABC法对10例正常人皮肤标本进行研究，探讨表达CD1a或生长抑素(Somatostatin)的树突状细胞的免疫表达特点和分布情况以及CD1a+与神经肽S-100、Somatostatin之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 10例皮肤标本均为1999年5～9月安徽医科大学第一附属医院整形外科手术后多余皮肤，所取标本均无炎症、肿瘤等皮损症状，离体30 min内行OCT包埋，-20℃以下冷冻保存；10例中男性9例，其中3例头皮，3例腹部皮肤，1例为右上睑皮肤，1例前臂皮肤，1例右上臂皮肤；女性1例，为右乳房皮肤。年龄3～66岁，平均24岁；SABC双标免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物公司，CD1a鼠单抗为Pharmingen公司产品，Somatostatin兔抗体为Zymed Laboratories, INC产品，S-100鼠单抗为Sigma化学公司产品，HLA-DR鼠单抗为Maxim Biotech, Inc产品。
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1.2 方法 采取SABC免疫组化方法。用LEICA CM 1100型冷冻切片机切片，切片厚4 μm，连续切片，平均每例切片12张，风干后在纯丙酮加H2O2液(浓度为0.5%)中室温下固定30 min，立即进行检测或冷冻保存备用。一抗CD1a的浓度为1∶50，HLA-DR、S-100、Somatostatin均为即用型试剂。染色程序：经0.01 mol*L-1 TBS漂洗2 min×3次，可加入过碘酸处理后滴入正常封闭血清室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗，直接滴入经适当稀释的一抗，4℃冰箱中过夜或37℃恒温箱中孵育45 min，经TBS漂洗后滴加生物素化二抗，20℃～37℃ 20 min，漂洗后根据染色方法不同分别滴加SABC-AP、SABC-POD，或先后滴加这两种试剂而采取双标染色方法。滴加SABC-AP经BCIP/NBT显色，滴加SABC-POD经AEC显色；双标法：在滴加SABC-AP行BCIP/NBT显色后滴加双标阻断液，再按AEC染色方法步骤进行染色。本实验采取BCIP/NBT、AEC、以及双标法三种标记方法。部分AEC染色的标本经苏木精复染后经水溶性封片剂封片观察。阴性对照以TBS代替一抗。
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1.3 阳性判断标准 SABC-AP经BCIP/NBT显色呈紫蓝色或深蓝色即为阳性细胞，SABC-POD经AEC显色呈红色即为阳性细胞，双标染色方法为绛红色或蓝红相间即为阳性细胞，以上方法染色中阴性对照组均无显色及背景无显色为特异性阳性必需条件。
1.4 组织定量方法 采用测试网格(10×10)，在高倍(10×40)视野下对免疫组化阳性细胞进行计数，随机选取10个以上不重复无重叠的视野，测定每毫米真、表皮平均阳性细胞数。对毛囊及皮脂腺以每个毛囊或皮脂腺单位计数。
2 结果
2.1 CD1a+ DC的免疫表达 本实验研究中CD1a+ DC阳性细胞主要分布于表皮棘细胞层，具有数个树突形状的胞膜突起(见图1)，每个阳性细胞树突的数目为4个左右，细胞大小与角朊细胞相近，数量在2～28/mm个之间；在毛囊外根鞘部位可见树枝状形态的、不规则的阳性细胞，大小比棘细胞层中阳性细胞稍小，密度相近，平均每个毛囊约12个，且主要位于毛囊的中上段，毛球部几乎见不到CD1a阳性细胞；皮脂腺开口处可见相对集中的CD1a+阳性细胞，密度约与毛囊中上段相近，细胞较小，而在皮脂腺其他部位鲜能见到CD1a细胞。人体不同部位的皮肤有所不同(见表1)，在头皮中CD1a阳性细胞偏多，与其具有较多的毛囊和皮脂腺有关，头皮表皮中CD1a+细胞亦比腹部皮肤多，上肢CD1a+阳性细胞比头皮中略少，眼上睑皮肤中CD1a+阳性细胞最少。本实验通过BLIP/NBT、AEC先后标记方法，连续切片对照，研究发现CD1a+DC复合表达S-100，部分表达HLA-DR，而不表达Somatostatin。
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表1 正常皮肤不同部位的CD1a+DC数量(
±s) 部位
n
视野
CD1a+DC
头部
3
30
16±12
胸腹部
4
, http://www.100md.com 40
13±8
上肢
2
20
12±7
睑部
1
10
8±2
毛囊
3
6
11±4
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皮脂腺
1
2
10±2
图1 AEC显色CD1a+ DC的分布(×400)
2.2 Somatostatin+ DC的免疫表达 本实验中2例头皮中出现Somatostatin+细胞，主要集中在真皮层，或表现为真皮乳头层片状沉积，真皮网状层亦可见阳性染色沉积，表皮中偶见阳性细胞，每毫米真皮中为4～16个或呈数个小片块状，细胞形态不规则，具有多个突起。见图2。1例前臂中可见少量这种阳性细胞，其它标本未见阳性细胞。CD1a与神经递质Somatostatin、S-100之间关系，作者将通过双标法进一步研究。
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图2 AEC显色Somatostatin+ DC的分布(×400)
3 讨论
表达CD1a的树突状细胞主要为LC，但Nestle等〔1〕报道DDC中约12%～40%表达CD1a，且部分分布于表皮；LC表达HLA-DR，但HLA-DR+ DC并不都表达CD1a；Gillian等〔2〕报道毛囊是LC的主要贮存库，本研究证实毛囊外根鞘中上段有密度与表皮相近的DC。Grassi等〔3〕认为单核源性LC可能是树突状细胞的前体，当它相遇外来抗原，迁移至淋巴结和组织过程中经历表型和功能上的改变而成为成熟DDC。有文献报道LC、树突状细胞如单核巨噬细胞被认为来源于同一个骨髓CD34+干细胞，CD34+CLA+干细胞在体外适当条件下培养可转变为CD1a+DC；也有文献报道DDC是DC的一个独特分支，直接来源于局部组织，表达FⅫa；不论何种表型特点的DC都具有共同特点：树突状胞质结构和不同程度的抗原递呈作用。因此，对CD1a+细胞的表达特点进行深入研究可帮助认识这些树突状细胞类型和来源。本实验中CD1a+ DC多在表皮内，真皮中可见极少阳性细胞，且表达S-100，因此多为LC，这些细胞主要分布于棘细胞层、毛囊和皮脂腺开口处。不同部位CD1a+DC分布不尽相同，头皮中较多。本研究证实LC大多位于表皮且表达CD1a，与其它树突状细胞免疫学表型不同，它在抗原递呈中起重要作用。
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90年代文献表明LC与神经系统关系密切，LC表达神经蛋白S-100，LC表面可能有Somatostatin受体。Talme等〔4〕报道正常人非皮损表皮很少表达Somatostatin，而在真皮中可见Somatostatin+ DC；在银屑病皮损的真皮网状层上部和乳头中、表皮的棘细胞层和基底层亦可见到此类细胞；一些Somatostatin+ DC位于基底膜带，其树突状结构伸入表皮。本研究在正常人的真皮网状层中发现散在的阳性细胞，每毫米真皮数量在4～16个，亦可见小片状沉积，表皮中较少。而阴性对照组中未见有阳性细胞或沉积。有研究认为Merkel细胞分泌Somatostatin，这种神经肽类物质在皮肤免疫活动中具有重要的调节作用，而本实验中表皮Somatostatin+细胞是否为Merkel细胞尚待证实。显然，树突状细胞与神经肽类物质关系密切，作者将通过双标法进一步探究CD1a+DC与S-100、Somatostatin之间的关系。而真皮中Somatostatin+ DC又确实代表DC的一个亚型。Somatostatin+ DC不同于LC，亦不同于DDC，在病理情况下尤为明显，其独特的免疫表型和所处位置证明其有别于CD1a+DC和Merkel细胞，它可能是DDC的一个独特亚型。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委课题基金资助(99j10122)
作者简介：夏 青，男，31岁，医学编辑，在职研究生
张学军，男，44岁，博士，教授，安徽医科大学学报常务副主编，中华皮肤科学会委员，国际皮肤科学会会员委员会委员
参考文献
1 Nestle FO, Zheng XG, Thompson CB et al. Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic and functionally distrinctive subsets. Journal of Immunology, 1993;151(11):6536～6545
, http://www.100md.com
2 Gillian AC, Kremer IB, Yoshida Y et al. The human hair follicle: a major-reservoir of CD1a+ Langerhanes cells which repopulate epidermis after acute low dose UVB. J Invest Dermatol, 1997;109(2):257
3 Grassi F, Dezutter DC, Mcllroy D et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from birbeck granules. J Leukoc Biol, 1998;64(4):93～484
4 Talme T, Schultzberg M, Sundgvist KG et al. Colocalization of Somatostatin-and HLA-DR-like immunoreactivity in dendritic cells of psoriatic skin (see comments). Acta Derm Venereol, 1997;77(5):42～338
1999-09-24收稿，1999-10-22修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学皮肤性病学教研室，合肥 230032
关键词：树突状细胞；免疫学；Somatostatin+树突状细胞；CD1a+树突状细胞
安徽医科大学学报990605摘要 目的 探讨正常皮肤CD1a+树突状细胞(CD1a+ DC)、Somatostatin+树突状细胞(Somatostatin+ DC)的免疫表达和分布特点。方法 应用免疫组化SABC法检测10例正常人皮肤中CD1a+ DC、Somatostatin+ DC的定位定量情况，分别采取BCIP/NBT、AEC和双标法染色；双标记研究包括CD1a、Somatostatin、S-100、HLA-DR四种抗体。结果 CD1a+ DC主要分布于表皮棘细胞层，具有4个树突结构，大小与角朊细胞相近，每毫米表皮数量在2～28个之间，在毛囊外根鞘中上部位和皮脂腺开口处可见密度相当的CD1a+ DC，CD1a+ DC复合表达S-100和HLA-DR，不表达Somatostatin；Somatostatin+ DC主要集中于真皮网状层和乳头部位，每毫米真皮中约为4～16个。结论 朗格汉斯细胞(LC)表达CD1a和S-100，但表达CD1a的DC未必都是LC，表皮和真皮中存在不同类型的DC，Somatostatin+ DC可能是皮肤中DC一个特独的亚型。
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中国图书资料分类法分类号 R75；R392.3
Study on the expression of CD1a+ DC、somatostatin+ DC in normal skin
Xia Qing, Zhang Xuejun
(Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To explore the expression and the distribution of CD1a+ DC、Somatostatin+ DC in normal skin. Methods By double-labelling immunohistochemical technology, the author has mapped and quantified the distribution of CD1a+ DC、somatostatin+ DC. They were stained with BCIP/NBT、AEC and double-lobelling. The antibodies included anti-CD1a、S-100、HLA-DR and somatostatin. Results The results showed that CD1a+ DC mainly distributed within the spinous and basal layers of the epidermis. The average number of dendritic structure was about 4. The number of DC in outer root sheath and sebaceous gland as well as epidermis was 2～28/mm. CD1a+ DC coexpressed S-100 and HLA-DR except somatostatin. Somatostatin+ DC majorly concentrated in the papillary and upper reticular dermis, and it was a subgroup of dermal dendritic cell. The number of sometostation+ DC in dermal is 4 to 16. Conclusion LC coexpressed CD1a or LC and not all DCs expressing CD1a are LC. A variety of DCs existed in epidermis and dermis. Somatostatin+ DC is a subgroup of dendritic cells in skin.
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MeSH dendritic cell/ immunology; somatostatin+ dendritic cell; CD1a+ dendritic cell
研究发现正常人皮肤中存在多种树突状细胞(DC)，除朗格汉斯细胞(LC)外还有黑色素细胞、Merkel细胞、组织单核巨噬细胞、未定类细胞、真皮树突状细胞(DDC)等，它们成为皮肤免疫系统重要组成部分，一些皮肤病的病理反应可能开始于DC。我们通过用免疫组化SABC法对10例正常人皮肤标本进行研究，探讨表达CD1a或生长抑素(Somatostatin)的树突状细胞的免疫表达特点和分布情况以及CD1a+与神经肽S-100、Somatostatin之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 10例皮肤标本均为1999年5～9月安徽医科大学第一附属医院整形外科手术后多余皮肤，所取标本均无炎症、肿瘤等皮损症状，离体30 min内行OCT包埋，-20℃以下冷冻保存；10例中男性9例，其中3例头皮，3例腹部皮肤，1例为右上睑皮肤，1例前臂皮肤，1例右上臂皮肤；女性1例，为右乳房皮肤。年龄3～66岁，平均24岁；SABC双标免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物公司，CD1a鼠单抗为Pharmingen公司产品，Somatostatin兔抗体为Zymed Laboratories, INC产品，S-100鼠单抗为Sigma化学公司产品，HLA-DR鼠单抗为Maxim Biotech, Inc产品。
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1.2 方法 采取SABC免疫组化方法。用LEICA CM 1100型冷冻切片机切片，切片厚4 μm，连续切片，平均每例切片12张，风干后在纯丙酮加H2O2液(浓度为0.5%)中室温下固定30 min，立即进行检测或冷冻保存备用。一抗CD1a的浓度为1∶50，HLA-DR、S-100、Somatostatin均为即用型试剂。染色程序：经0.01 mol*L-1 TBS漂洗2 min×3次，可加入过碘酸处理后滴入正常封闭血清室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗，直接滴入经适当稀释的一抗，4℃冰箱中过夜或37℃恒温箱中孵育45 min，经TBS漂洗后滴加生物素化二抗，20℃～37℃ 20 min，漂洗后根据染色方法不同分别滴加SABC-AP、SABC-POD，或先后滴加这两种试剂而采取双标染色方法。滴加SABC-AP经BCIP/NBT显色，滴加SABC-POD经AEC显色；双标法：在滴加SABC-AP行BCIP/NBT显色后滴加双标阻断液，再按AEC染色方法步骤进行染色。本实验采取BCIP/NBT、AEC、以及双标法三种标记方法。部分AEC染色的标本经苏木精复染后经水溶性封片剂封片观察。阴性对照以TBS代替一抗。
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1.3 阳性判断标准 SABC-AP经BCIP/NBT显色呈紫蓝色或深蓝色即为阳性细胞，SABC-POD经AEC显色呈红色即为阳性细胞，双标染色方法为绛红色或蓝红相间即为阳性细胞，以上方法染色中阴性对照组均无显色及背景无显色为特异性阳性必需条件。
1.4 组织定量方法 采用测试网格(10×10)，在高倍(10×40)视野下对免疫组化阳性细胞进行计数，随机选取10个以上不重复无重叠的视野，测定每毫米真、表皮平均阳性细胞数。对毛囊及皮脂腺以每个毛囊或皮脂腺单位计数。
2 结果
2.1 CD1a+ DC的免疫表达 本实验研究中CD1a+ DC阳性细胞主要分布于表皮棘细胞层，具有数个树突形状的胞膜突起(见图1)，每个阳性细胞树突的数目为4个左右，细胞大小与角朊细胞相近，数量在2～28/mm个之间；在毛囊外根鞘部位可见树枝状形态的、不规则的阳性细胞，大小比棘细胞层中阳性细胞稍小，密度相近，平均每个毛囊约12个，且主要位于毛囊的中上段，毛球部几乎见不到CD1a阳性细胞；皮脂腺开口处可见相对集中的CD1a+阳性细胞，密度约与毛囊中上段相近，细胞较小，而在皮脂腺其他部位鲜能见到CD1a细胞。人体不同部位的皮肤有所不同(见表1)，在头皮中CD1a阳性细胞偏多，与其具有较多的毛囊和皮脂腺有关，头皮表皮中CD1a+细胞亦比腹部皮肤多，上肢CD1a+阳性细胞比头皮中略少，眼上睑皮肤中CD1a+阳性细胞最少。本实验通过BLIP/NBT、AEC先后标记方法，连续切片对照，研究发现CD1a+DC复合表达S-100，部分表达HLA-DR，而不表达Somatostatin。
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表1 正常皮肤不同部位的CD1a+DC数量(
±s) 部位n
视野
CD1a+DC
头部
3
30
16±12
胸腹部
4
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13±8
上肢
2
20
12±7
睑部
1
10
8±2
毛囊
3
6
11±4
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皮脂腺
1
2
10±2
图1 AEC显色CD1a+ DC的分布(×400)
2.2 Somatostatin+ DC的免疫表达 本实验中2例头皮中出现Somatostatin+细胞，主要集中在真皮层，或表现为真皮乳头层片状沉积，真皮网状层亦可见阳性染色沉积，表皮中偶见阳性细胞，每毫米真皮中为4～16个或呈数个小片块状，细胞形态不规则，具有多个突起。见图2。1例前臂中可见少量这种阳性细胞，其它标本未见阳性细胞。CD1a与神经递质Somatostatin、S-100之间关系，作者将通过双标法进一步研究。
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图2 AEC显色Somatostatin+ DC的分布(×400)
3 讨论
表达CD1a的树突状细胞主要为LC，但Nestle等〔1〕报道DDC中约12%～40%表达CD1a，且部分分布于表皮；LC表达HLA-DR，但HLA-DR+ DC并不都表达CD1a；Gillian等〔2〕报道毛囊是LC的主要贮存库，本研究证实毛囊外根鞘中上段有密度与表皮相近的DC。Grassi等〔3〕认为单核源性LC可能是树突状细胞的前体，当它相遇外来抗原，迁移至淋巴结和组织过程中经历表型和功能上的改变而成为成熟DDC。有文献报道LC、树突状细胞如单核巨噬细胞被认为来源于同一个骨髓CD34+干细胞，CD34+CLA+干细胞在体外适当条件下培养可转变为CD1a+DC；也有文献报道DDC是DC的一个独特分支，直接来源于局部组织，表达FⅫa；不论何种表型特点的DC都具有共同特点：树突状胞质结构和不同程度的抗原递呈作用。因此，对CD1a+细胞的表达特点进行深入研究可帮助认识这些树突状细胞类型和来源。本实验中CD1a+ DC多在表皮内，真皮中可见极少阳性细胞，且表达S-100，因此多为LC，这些细胞主要分布于棘细胞层、毛囊和皮脂腺开口处。不同部位CD1a+DC分布不尽相同，头皮中较多。本研究证实LC大多位于表皮且表达CD1a，与其它树突状细胞免疫学表型不同，它在抗原递呈中起重要作用。
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90年代文献表明LC与神经系统关系密切，LC表达神经蛋白S-100，LC表面可能有Somatostatin受体。Talme等〔4〕报道正常人非皮损表皮很少表达Somatostatin，而在真皮中可见Somatostatin+ DC；在银屑病皮损的真皮网状层上部和乳头中、表皮的棘细胞层和基底层亦可见到此类细胞；一些Somatostatin+ DC位于基底膜带，其树突状结构伸入表皮。本研究在正常人的真皮网状层中发现散在的阳性细胞，每毫米真皮数量在4～16个，亦可见小片状沉积，表皮中较少。而阴性对照组中未见有阳性细胞或沉积。有研究认为Merkel细胞分泌Somatostatin，这种神经肽类物质在皮肤免疫活动中具有重要的调节作用，而本实验中表皮Somatostatin+细胞是否为Merkel细胞尚待证实。显然，树突状细胞与神经肽类物质关系密切，作者将通过双标法进一步探究CD1a+DC与S-100、Somatostatin之间的关系。而真皮中Somatostatin+ DC又确实代表DC的一个亚型。Somatostatin+ DC不同于LC，亦不同于DDC，在病理情况下尤为明显，其独特的免疫表型和所处位置证明其有别于CD1a+DC和Merkel细胞，它可能是DDC的一个独特亚型。
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基金项目：安徽省教委课题基金资助(99j10122)
作者简介：夏 青，男，31岁，医学编辑，在职研究生
张学军，男，44岁，博士，教授，安徽医科大学学报常务副主编，中华皮肤科学会委员，国际皮肤科学会会员委员会委员
参考文献
1 Nestle FO, Zheng XG, Thompson CB et al. Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic and functionally distrinctive subsets. Journal of Immunology, 1993;151(11):6536～6545
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2 Gillian AC, Kremer IB, Yoshida Y et al. The human hair follicle: a major-reservoir of CD1a+ Langerhanes cells which repopulate epidermis after acute low dose UVB. J Invest Dermatol, 1997;109(2):257
3 Grassi F, Dezutter DC, Mcllroy D et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from birbeck granules. J Leukoc Biol, 1998;64(4):93～484
4 Talme T, Schultzberg M, Sundgvist KG et al. Colocalization of Somatostatin-and HLA-DR-like immunoreactivity in dendritic cells of psoriatic skin (see comments). Acta Derm Venereol, 1997;77(5):42～338
1999-09-24收稿，1999-10-22修回, 百拇医药