p16/MTS1基因缺失在急性淋巴细胞白血病发病中的作用
作者：汪惠园 夏瑞祥 汪 渊 焦增富 鲁云霞 赵 萍 周 波 蔡学杰
单位：汪惠园 夏瑞祥 蔡学杰 安徽医科大学附属医院血液内科，合肥 230022；汪 渊 鲁云霞 安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032；焦增富 淮南矿务局潘二谢三综合办医院，淮南 232001；赵 萍 安庆市立医院内科，安庆 246003；周 波 安徽省巢湖市中医院内科，巢湖 238000
关键词：白血病；淋巴细胞；急性；遗传学；基因；p16
安徽医科大学学报990604 摘要 目的 探讨多肿瘤抑制基因缺失(p16/MTS1)在急性淋巴细胞白血病(ALL)发病中的作用。 方法 采用PCR 方法，对30 例完全缓解的ALL p16/MTS1基因的缺失情况进行了研究，并结合患者的临床结果进行分析。 结果 15例ALL患者有p16基因缺失，并发现高危组患者p16基因缺失发生率明显增加(P<0.05)，p16基因缺失的高危组患者有高的复发率(P<0.05)。结论 提示p16基因缺失和ALL患者的预后相关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R733.71
Deletion of p16/MTS1 gene in acute lymphocytic leukemia
Wang Huiyuan, Xia Ruixiang, Wang Yuan et al
(Dept of Hematology, The First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate the relationship between deletions of multiple tumor suppressor gene-p16/MTS1 and acute lymphocytic leukemia(ALL). Methods p16 gene was analysed by polymerase chain reaction in 30 cases of acute lymphocytic leukemia and correlated with clinical results. Results p16 gene deletions were found in 15 samples, and high risk patients had a markedly higher probability of p16 gene deletion(P<0.05) and the high risk patients with p16 deletion showed higher relapse. Conclusion The deletion of p16 gene is associated with prognosis of ALL.
, http://www.100md.com
MeSH leukemia, lymphocytic, acute/genet; genes, p16
体细胞获得性遗传缺陷导致细胞发生恶性转化，在这些特异性遗传改变中，肿瘤抑制基因的缺陷被认为是关键因素之一。在正常细胞的扩增中，多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1, MTS1)编码的蛋白(p16)作为一个负性调节因子与周期素D结合，对成视网膜细胞瘤蛋白(pRB)磷酸化起调节作用，因此它被认为是一个重要的肿瘤抑制基因。在ALL中，p16基因的缺失率为25%～83%〔2，3〕。据文献报道， p16基因缺失与否和ALL，特别与高危组患者之间的关系尚未得出确切的结论〔4〕。我们对40例ALL患者进行了p16基因纯合性缺失的研究，在完全缓解的30例患者中探讨其与临床预后的关系。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 标本选择 安徽医科大学附院血液科自1997年3月～1998年6月间诊断为ALL的住院患者40例，对完全缓解的30例患者进行预后分析。患者的主要临床资料见表1。患者的危险程度根据公认的临床资料〔5〕进行分类，入选病例诱导缓解和巩固治疗采用标准方案。
表1 临床参数及分类结果 参数
n
参数
n
病人总数
30
L1型
6
男性
, 百拇医药
22
非L1型
24
女性
8
高危组
26
年龄1～10岁
0
标准危险组
4
≥20岁
21
, http://www.100md.com p16缺失组
15
WBC≥25000
19
无p16缺失组
15
<25000
11
1.2 白血病基因组DNA的提取 按常规方法抽提白血病细胞DNA〔6〕，用dH2O稀释至50 mg.L-1。
1.3 PCR分析 根据p16基因外显子2序列设计引物〔1〕，3′端引物为TGG CTC TGA CCA TTC TGT ，5′端为AGC TTT GGA AGC TCT CAG 。CDK4的引物3′端为 CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGG ，5′端为GGA GGT CGG TAC CAG AGT G。将100 ng基因组DNA加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris,50 mmol.L-1 KCl,2 mmol.L-1 MgCl2,200 μmol.L-1 dNTPS,0.5 μmol.L-1引物，0.10 DMSO和3U Taq DNA聚合酶)中，p16和CDK4为单独反应体系。97℃ 5 min热启动，95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 5min结束反应，取8 μl进行琼脂糖电泳。
, 百拇医药
1.4 统计分析 采用2×2列联表，相关性检验用χ2检验。2 结果
根据p16基因DNA序列所设计的特异性核苷酸引物经PCR仪扩增后进行琼脂糖电泳，以未出现386bp特异性扩增条带、且出现CDK4扩增条带者为纯合性缺失。为排除污染每次均设p16正常和阳性对照。我们用此法检测40例急淋患者化疗前外周血标本，包括完全缓解患者30例，完全缓解患者30例中发现15例患者有p16基因缺失。电泳结果如图1所示。
图1 p16基因的缺失分析
M： 100bpDNA Marker； 1： 正常对照；
2： 阳性对照； 3～9： ALL标本
我们对30例完全缓解患者的p16基因缺失情况进行分析，临床资料见表1。本组病人缓解率为0.75，其中p16基因缺失组完全缓解率为0.714，平均白细胞数为26.4×109.L-1,中位年龄为26.5岁，FAB分型非L1型ALL比例为13/15，高危组患者比例为15/15；p16基因未缺失组完全缓解率为0.78，平均白细胞数为24.5×109.L-1,中位年龄为28岁，FAB分型非L1型ALL比例为11/15，高危组患者比例为11/15。两组在完全缓解率，平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例，高危组患者比例上差异均无显著性(P>0.05)。本研究发现高危组患者p16基因缺失发生率明显增高(P<0.05)。
, 百拇医药
表2列举了按p16基因缺失和无缺失分类，不同危险组病人的复发情况。10例复发患者从完全缓解到复发的时间为6～24个月，平均为15.1个月。经比较表明：p16基因缺失的高危组患者有高的复发率，无缺失的高危组有较低的复发率(P<0.05)。
表2 病人复发情况(按p16缺失及危险性分组) 组 别
n
复发例数
复发率(%)
p16缺失
15
高危组
15
8
, 百拇医药
53.30
标准危险组
0
0
无p16 缺失
15
高危组
11
2
18.81
标准危险组
4
0
, http://www.100md.com
3 讨论
Cayuela等对163例白血病患者进行p16/MTS1基因纯合子缺失的研究,发现在ALL中p16基因的纯合子缺失率约0.83。儿童ALL中p16基因的纯合子缺失与不良临床预后相关〔7〕。考虑到外显子2缺失可反映p16基因缺失，我们对30例CR的ALL p16基因外显子2进行PCR分析，30例ALL待检外周血标本(原始+幼稚细胞)≥0.90，且所用模板量极小，仅0.1 μg,污染可能性极小。我们探讨p16基因在ALL中的发生率，并与患者的临床结果进行了联系。按p16基因缺失与否分组，两组在完全缓解率，平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例，高危组患者比例上差异无显著性(P>0.05)。其中平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例是ALL临床预后因素。在单因素分析中，p16基因缺失与显著增加的复发率有相关性(P<0.05)。
我们报告了p16基因缺失与临床预后间有较强的相关性，这与Kees等〔7〕的观点一致,即高危组患者p16基因缺失的发生率显著增加(P=0.01),p16基因缺失的高危组患者复发率高，相反p16基因未缺失的高危组患者复发率低。
, http://www.100md.com
现认为ALL患者的年龄和白细胞数是较可靠的预后因素。近来免疫表型，染色体表型〔8〕也被证明是独立于临床特征之外的预后因素，对于判断疾病的恶性程度有帮助。本组研究样本量小，因此需要做更多的病例观察，可是我们研究的结果是根据p16缺失阳性发现得出的，尽管样本量小，但显示p16基因缺失与预后相关。
在今后的工作中，我们需要扩大病例数，此外尚需观察p16基因缺失对患者生存期的影响。
基金项目：安徽省教委自然科学研究基金资助(JL-96-077)，安徽医科大学博士基金资助
作者简介：汪惠园，男，34岁，副主任医师
参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993；366(6456):704～707
, 百拇医药
2 Ogawa S, Hirano N, Sato N et al. Homozygous loss of the cyclindependent Kinase 4-inhibitor(p16) gene in human Leukemias. Blood, 1994；84(8):2431～2435
3 Cayuela JM,Hebert J, Sigaux F.Homozygous MTS1(p16 INK4A) deletion in Primary tumar cells of 163 leukemia patients. Blood, 1995；85(3):854
4 Takeuchi S,Bartram CR, Seriu T et al. Analysis of a family of cyclindependent kinase inhibitors P15/MTS2/ink4b, p16/MTS1/ink4a and P18 genes in acute lymphoblastic leukemia of childhood. Blood, 1995；86(2):755～760
, 百拇医药
5 Robert B, Andrew J, Fletcher MB et al. 默克诊疗手册. 第2版， 北京：牛津大学出版社、人民卫生出版社，1992：1190～1990
6 周 青,刘 虎,汪 渊等. 肝细胞肿瘤患者癌组织中HBx基因的检测. 疾病控制杂志， 1999；3(1):10～11
7 Kees UR, Burton PR, Chang LL et al. Homozygous deletion of the p16/MTS1 gene in pediatric acute lymphoblastic leukemia is associated with unfavorable clinical outcome. Blood, 1997；89(11):4161～4166
8 Pui CH. Childhood leukemia. N Engl J Med, 1995；332(24):1618～1630
1999-08-05收稿，1999-10-25修回, 百拇医药
单位：汪惠园 夏瑞祥 蔡学杰 安徽医科大学附属医院血液内科，合肥 230022；汪 渊 鲁云霞 安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032；焦增富 淮南矿务局潘二谢三综合办医院，淮南 232001；赵 萍 安庆市立医院内科，安庆 246003；周 波 安徽省巢湖市中医院内科，巢湖 238000
关键词：白血病；淋巴细胞；急性；遗传学；基因；p16
安徽医科大学学报990604 摘要 目的 探讨多肿瘤抑制基因缺失(p16/MTS1)在急性淋巴细胞白血病(ALL)发病中的作用。 方法 采用PCR 方法，对30 例完全缓解的ALL p16/MTS1基因的缺失情况进行了研究，并结合患者的临床结果进行分析。 结果 15例ALL患者有p16基因缺失，并发现高危组患者p16基因缺失发生率明显增加(P<0.05)，p16基因缺失的高危组患者有高的复发率(P<0.05)。结论 提示p16基因缺失和ALL患者的预后相关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R733.71
Deletion of p16/MTS1 gene in acute lymphocytic leukemia
Wang Huiyuan, Xia Ruixiang, Wang Yuan et al
(Dept of Hematology, The First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate the relationship between deletions of multiple tumor suppressor gene-p16/MTS1 and acute lymphocytic leukemia(ALL). Methods p16 gene was analysed by polymerase chain reaction in 30 cases of acute lymphocytic leukemia and correlated with clinical results. Results p16 gene deletions were found in 15 samples, and high risk patients had a markedly higher probability of p16 gene deletion(P<0.05) and the high risk patients with p16 deletion showed higher relapse. Conclusion The deletion of p16 gene is associated with prognosis of ALL.
, http://www.100md.com
MeSH leukemia, lymphocytic, acute/genet; genes, p16
体细胞获得性遗传缺陷导致细胞发生恶性转化，在这些特异性遗传改变中，肿瘤抑制基因的缺陷被认为是关键因素之一。在正常细胞的扩增中，多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1, MTS1)编码的蛋白(p16)作为一个负性调节因子与周期素D结合，对成视网膜细胞瘤蛋白(pRB)磷酸化起调节作用，因此它被认为是一个重要的肿瘤抑制基因。在ALL中，p16基因的缺失率为25%～83%〔2，3〕。据文献报道， p16基因缺失与否和ALL，特别与高危组患者之间的关系尚未得出确切的结论〔4〕。我们对40例ALL患者进行了p16基因纯合性缺失的研究，在完全缓解的30例患者中探讨其与临床预后的关系。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 标本选择 安徽医科大学附院血液科自1997年3月～1998年6月间诊断为ALL的住院患者40例，对完全缓解的30例患者进行预后分析。患者的主要临床资料见表1。患者的危险程度根据公认的临床资料〔5〕进行分类，入选病例诱导缓解和巩固治疗采用标准方案。
表1 临床参数及分类结果 参数
n
参数
n
病人总数
30
L1型
6
男性
, 百拇医药
22
非L1型
24
女性
8
高危组
26
年龄1～10岁
0
标准危险组
4
≥20岁
21
, http://www.100md.com p16缺失组
15
WBC≥25000
19
无p16缺失组
15
<25000
11
1.2 白血病基因组DNA的提取 按常规方法抽提白血病细胞DNA〔6〕，用dH2O稀释至50 mg.L-1。
1.3 PCR分析 根据p16基因外显子2序列设计引物〔1〕，3′端引物为TGG CTC TGA CCA TTC TGT ，5′端为AGC TTT GGA AGC TCT CAG 。CDK4的引物3′端为 CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGG ，5′端为GGA GGT CGG TAC CAG AGT G。将100 ng基因组DNA加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris,50 mmol.L-1 KCl,2 mmol.L-1 MgCl2,200 μmol.L-1 dNTPS,0.5 μmol.L-1引物，0.10 DMSO和3U Taq DNA聚合酶)中，p16和CDK4为单独反应体系。97℃ 5 min热启动，95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 5min结束反应，取8 μl进行琼脂糖电泳。
, 百拇医药
1.4 统计分析 采用2×2列联表，相关性检验用χ2检验。2 结果
根据p16基因DNA序列所设计的特异性核苷酸引物经PCR仪扩增后进行琼脂糖电泳，以未出现386bp特异性扩增条带、且出现CDK4扩增条带者为纯合性缺失。为排除污染每次均设p16正常和阳性对照。我们用此法检测40例急淋患者化疗前外周血标本，包括完全缓解患者30例，完全缓解患者30例中发现15例患者有p16基因缺失。电泳结果如图1所示。
图1 p16基因的缺失分析
M： 100bpDNA Marker； 1： 正常对照；
2： 阳性对照； 3～9： ALL标本
我们对30例完全缓解患者的p16基因缺失情况进行分析，临床资料见表1。本组病人缓解率为0.75，其中p16基因缺失组完全缓解率为0.714，平均白细胞数为26.4×109.L-1,中位年龄为26.5岁，FAB分型非L1型ALL比例为13/15，高危组患者比例为15/15；p16基因未缺失组完全缓解率为0.78，平均白细胞数为24.5×109.L-1,中位年龄为28岁，FAB分型非L1型ALL比例为11/15，高危组患者比例为11/15。两组在完全缓解率，平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例，高危组患者比例上差异均无显著性(P>0.05)。本研究发现高危组患者p16基因缺失发生率明显增高(P<0.05)。
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表2列举了按p16基因缺失和无缺失分类，不同危险组病人的复发情况。10例复发患者从完全缓解到复发的时间为6～24个月，平均为15.1个月。经比较表明：p16基因缺失的高危组患者有高的复发率，无缺失的高危组有较低的复发率(P<0.05)。
表2 病人复发情况(按p16缺失及危险性分组) 组 别
n
复发例数
复发率(%)
p16缺失
15
高危组
15
8
, 百拇医药
53.30
标准危险组
0
0
无p16 缺失
15
高危组
11
2
18.81
标准危险组
4
0
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3 讨论
Cayuela等对163例白血病患者进行p16/MTS1基因纯合子缺失的研究,发现在ALL中p16基因的纯合子缺失率约0.83。儿童ALL中p16基因的纯合子缺失与不良临床预后相关〔7〕。考虑到外显子2缺失可反映p16基因缺失，我们对30例CR的ALL p16基因外显子2进行PCR分析，30例ALL待检外周血标本(原始+幼稚细胞)≥0.90，且所用模板量极小，仅0.1 μg,污染可能性极小。我们探讨p16基因在ALL中的发生率，并与患者的临床结果进行了联系。按p16基因缺失与否分组，两组在完全缓解率，平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例，高危组患者比例上差异无显著性(P>0.05)。其中平均白细胞数,中位年龄，FAB分型非L1型ALL比例是ALL临床预后因素。在单因素分析中，p16基因缺失与显著增加的复发率有相关性(P<0.05)。
我们报告了p16基因缺失与临床预后间有较强的相关性，这与Kees等〔7〕的观点一致,即高危组患者p16基因缺失的发生率显著增加(P=0.01),p16基因缺失的高危组患者复发率高，相反p16基因未缺失的高危组患者复发率低。
, http://www.100md.com
现认为ALL患者的年龄和白细胞数是较可靠的预后因素。近来免疫表型，染色体表型〔8〕也被证明是独立于临床特征之外的预后因素，对于判断疾病的恶性程度有帮助。本组研究样本量小，因此需要做更多的病例观察，可是我们研究的结果是根据p16缺失阳性发现得出的，尽管样本量小，但显示p16基因缺失与预后相关。
在今后的工作中，我们需要扩大病例数，此外尚需观察p16基因缺失对患者生存期的影响。
基金项目：安徽省教委自然科学研究基金资助(JL-96-077)，安徽医科大学博士基金资助
作者简介：汪惠园，男，34岁，副主任医师
参考文献
1 Serrano M,Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993；366(6456):704～707
, 百拇医药
2 Ogawa S, Hirano N, Sato N et al. Homozygous loss of the cyclindependent Kinase 4-inhibitor(p16) gene in human Leukemias. Blood, 1994；84(8):2431～2435
3 Cayuela JM,Hebert J, Sigaux F.Homozygous MTS1(p16 INK4A) deletion in Primary tumar cells of 163 leukemia patients. Blood, 1995；85(3):854
4 Takeuchi S,Bartram CR, Seriu T et al. Analysis of a family of cyclindependent kinase inhibitors P15/MTS2/ink4b, p16/MTS1/ink4a and P18 genes in acute lymphoblastic leukemia of childhood. Blood, 1995；86(2):755～760
, 百拇医药
5 Robert B, Andrew J, Fletcher MB et al. 默克诊疗手册. 第2版， 北京：牛津大学出版社、人民卫生出版社，1992：1190～1990
6 周 青,刘 虎,汪 渊等. 肝细胞肿瘤患者癌组织中HBx基因的检测. 疾病控制杂志， 1999；3(1):10～11
7 Kees UR, Burton PR, Chang LL et al. Homozygous deletion of the p16/MTS1 gene in pediatric acute lymphoblastic leukemia is associated with unfavorable clinical outcome. Blood, 1997；89(11):4161～4166
8 Pui CH. Childhood leukemia. N Engl J Med, 1995；332(24):1618～1630
1999-08-05收稿，1999-10-25修回, 百拇医药