日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆
作者：汪学龙 沈际佳 蒋作君
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：血吸虫；日本；谷胱甘肽转移酶类；克隆；分子；真核遗传载体
安徽医科大学学报990602 中国图书资料分类法分类号 R383.24
摘要 目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体pBK CMV中，以便对其进行核酸疫苗的研究。方法 特定寡核苷酸引物的设计和合成，TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫RNA，RT-PCR法扩增GST基因编码序列，将扩增产物连接pGEM-T克隆载体，再亚克隆到真核表达载体pBK CMV中。结果 RT-PCR法特异性扩增出SjGST编码基因片段，其大小约为670 bp，经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEM-T-GST和pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMV-GST重组质粒的成功构建，为进一步表达GST及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。
, 百拇医药
Subcloning of glutathione-S-transferase gene of Schistosoma
japonicum in eukaryocyte expression vector
Wang Xuelong, Shen Jijia, Jiang Zuojun
(Dept of Pathobiology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective Glutathione-S-Transferase (GST) gene of Schistosoma japonicum(SjGST) was subcloed into eukaryocyte expression vector pBK CMV in order to study its nucleic acids vaccine.Methods The design and synthesis of specific oligonucleotide primers; Potential use total RNA was isolated from adult worms of S. japonicum using TRIZOL reagent; Coding region gene of SjGST was amplified by RT-PCR technique; The product from PCR was firstly cloned into pGEM-T vector and subcloned into eukaryocyte expression vector pBK CMV via BamH1 and kpn1 sites;The resulting construct was determined by restriction analysis and PCR methods.Results The coding region gene of SjGST was specifically amplified by PCR, the size of fragment was 670 base pairs. The cloning plasmid construct (pGEM-T-GST) and expression plasmid (pBK CMV-GST) contained the amplified fragment.Conclusion The results demonstrat that pBK CMV-GST is successfully constructed and provides the basis for further study on GST expression and its immunological diagnosis and prevention.
, 百拇医药
MeSH Schistosoma japonicum,immunol; glutathione transferases; cloning, molecular; geneticvectors
日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。目前虽有高效低毒的化疗药物吡喹酮，但其不能阻止再次感染、存在副反应以及虫体对药物抗性的出现等，故抗血吸虫疫苗的研究日益受到重视。血吸虫谷胱甘肽转移酶(SjGST)是血吸虫生理功能所需的解毒酶，其免疫动物可降低机体虫荷及成虫的生殖能力，延缓或阻止虫卵发育成熟，是血吸虫疫苗的侯选分子之一〔1～3〕。而DNA疫苗具有亚单位疫苗的完全性和减毒活疫苗诱导全面免疫反应的高效性〔4〕。同时，谷胱甘肽转移酶业已被证明可被病人血清中抗体所识别，具有一定的免疫诊断价值。为此，本试验将SjGST编码区基因亚克隆到真核表达载体pBK CMV中，现将结果报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 日本血吸虫成虫 含尾蚴的钉螺购自中国预防医学科学院寄研所，逸出尾蚴，感染家兔，45天时剖杀，经门静脉系统灌注收集成虫。
1.2 主要试剂及酶类 RNA提取试剂盒(TRIZOL Reagent)，第一链cDNA合成试剂盒GIBCO公司产品；Taq DNA 聚合酶，dNTP，PCR纯化试剂盒，pGEM-T载体系统为Promega公司产品；T4 DNA连接酶、BamHⅠ、kpnⅠ和λDNA/HindⅢ限制性内切酶为华美公司产品；XL1-blue大肠杆菌菌株、pBK CMV真核表达载体由本校分子生物学实验室惠赠；其余试剂为国产分析纯。
1.3 引物 根据日本血吸虫菲律宾株GST cDNA核苷酸序列〔5〕设计并合成一对引物：
P1： 5′-TAAGGATCCCATGTCCCCTATACTAGG-3′
, 百拇医药
P2： 5′-AGCGGTACCTTATTTTGGAGGATGGTC-3′
两条引物的5′端分别引入限制性内切酶BamHⅠ和kpnⅠ酶切位点。引物由中科院上海植物生理研究所合成。
1.4 成虫总RNA的提取和cDNA第一链合成 分别按试剂盒(Cat NO 10296-010和18089-011)提供程序进行。
1.5 PCR 10×PCR缓冲液10 μl，10 mmol dNTP 10 μl,P1和P2各1 μl,SjcDNA第一链合成物10 μl,Taq聚合酶2 μl,加水至总体积100 μl,置HeMa480扩增仪(珠海黑马公司)上,在下列条件下扩增:94℃ 1 min，54℃ 1 min, 72℃ 1.5 min，总36个循环,再72℃延伸20 min，琼脂糖凝胶电泳观察分析PCR结果。PCR产物的纯化按试剂盒说明进行。
, 百拇医药
1.6 血吸虫GST基因的克隆与鉴定 以近4∶1摩尔比将目的基因DNA和pGEM-TDNA于4℃连接过夜。按文献制备感受态细胞XL1-blue，将连接物转染细胞〔6〕，然后再将反应物涂布于LB/Amp/IPTG/X-gal平板, 37℃培养过夜。挑取单个白色菌落,置LB/Amp液体培养基中培养,次日小量提取质粒DNA(pGEM-T-GST), 质粒同时进行BamHⅠ和kpnⅠ双酶切和以质粒为模板的PCR,引物与反应条件同前。酶切和PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。
1.7 GST基因片段的分离回收与亚克隆 pGEM-T-GST和pBK CMV同时用BamHⅠ和kpnⅠ双酶切，电泳后在紫外灯下切下含目的基因的凝胶，装进处理过的透析袋中，继续电泳60 min，收集袋中液体，苯酚抽提、乙醇沉淀回收GST基因和pBK CMV载体的酶切片段。两者经T4 DNA连接酶作用过夜，按步骤1.6制备感受态细胞，DNA转染细胞，重组克隆的筛选，酶切与PCR进行鉴定。(见图1)
, 百拇医药
图1 质粒pGEM-T-GST和pBK CMV-GST的构建
2 结果
2.1 SjGST基因PCR扩增 以日本血吸虫总RNA逆转录合成SjcDNA第一链，以此为模板，用特异引物P1、P2经PCR扩增出一条近670bp的特异条带(见图2),与预期结果相符。
图2 PCR产物的10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳
1： PCR产物， 2：λDNA/HindⅢ Marker
2.2 重组pGEM-T-GST酶切及PCR鉴定 重组pGEM-T-GST质粒经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切后,可见一条与PCR产物一致的DNA片段, 以质粒为模板进行PCR扩增,亦可获得一条与cDNA为模板一致的PCR产物(见图3),表明重组pGEM-T-GSTDNA构建成功。
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图3 pGEM-T-GST和pBKCMV-GST的酶切分析和PCR鉴定
1：pGEM-T-GST BamHⅠ和kpnⅠ双酶切， 2：pGEM-T-GST为模板的PCR扩增，3：pBKCMV-GST BamHⅠ和kpnⅠ双酶切，4：pBKCMV-GST为模板的PCR扩增，5：λDNA/HindⅢ Marker
2.3 pBK CMV-GST真核表达质粒的构建与鉴定 pGEM-T-GST经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切后回收的目的基因被亚克隆到pBK CMV的相应的多克隆酶切位点，形成重组真核表达质粒pBK CMV-GST，其中目的基因正向位于强启动子CMV的下游。该质粒经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切和PCR，均产生一大小约为670bp的DNA片段(见图3)。
3 讨论
核酸疫苗是指含某种蛋白质编码基因的重组表达质粒，通过肌肉注射等途径将其接种动物后，外源基因可在宿主细胞内表达目的蛋白并诱导免疫应答。抗疟疾、黑热病等的DNA疫苗的动物实验已取得可喜结果，Sedegah等〔7〕给鼠肌肉注射编码约氏疟原虫环子孢子蛋白的质粒DNA，用子孢子攻击感染后的肝期原虫负荷下降86%；接受过2或3次疫苗注射的小鼠中，疫苗对68%小鼠具有保护作用。Xu等〔8〕将含编码利什曼原虫GP63基因的重组pcDNA1直接免疫BALB/c小鼠，发现免疫小鼠已产生高度抵抗力。
, http://www.100md.com
日本血吸虫DNA疫苗的研究也已取得一定进展。Yang等〔9〕给小鼠肌肉注射携带血吸虫副肌球蛋白(Sj97)基因的质粒DNA，诱导小鼠产生特异性抗Sj97抗体。李柳哲等〔10〕将重组有血吸虫表膜蛋白23×103 u的质粒给小鼠肌肉注射，攻击感染后，发现实验小鼠减虫率达到33.1%，减卵率为49.59%。
本实验先体外扩增SjGST编码基因，并将其插入pGEM-T克隆载体，再亚克隆入真核表达载体pBK CMV中，筛选后用双酶切及用重组质粒为模板的PCR予以证实。本研究为SjGST的诱导表达和重组质粒DNA经不同途径免疫小鼠的抗血吸虫保护作用等的研究正在进行当中。
基金项目：安徽省自然科学基金资助课题(编号 97410042)、安徽省卫生厅科研基金部分资助
作者简介：汪学龙，男，35岁，副教授
, 百拇医药
蒋作君，男，44岁，博士，教授，硕士生导师，教研室主任
参考文献
1 Bergquist NR, Colley DG. Schistosomiasis vaccines: research to development. Parasitol Today， 1998;14(2):99
2 Liu SX, Song GC, Xu YX et al. Immunization of mice with recombinant Sjc26GST induces a pronounced anti-fecundity effect after experimental infection with Chinese Schistosoma japonicum. Vaccine， 1995;13(6):603
3 Carpron AG, Riveau JM, Graych B et al. Development of a vaccine strategy against human and bovine schistosomiasis. Trop Geog Med， 1994;46(4):242
, http://www.100md.com
4 Waine GJ, McManus DP. Nucleic acids: Vaccines of the future. Parasitol Today， 1995; 11(3):113
5 Smith DB, Johnson KS. Single step purification of polypeptides expression in Escherichia coli as fusions with glutathione -S- transferase. Gene， 1988；67(1):31
6 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:19
, 百拇医药 7 Sedegah M, Hedstrom R, Hobart P et al. Protection against Malaria by immunization with plasmid DNA encoing cirumsporozoite protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(21):9866
8 Xu D, Liew FY. Protection against Leishmaniasis by injection of DNA encoding a major surface glycoprotein, gp63,of L. Major. Immunol, 1995; 84(2):173
9 Yang W, Waine GJ, Scott JC et al. Antibodies to Schistosoma japonicum(Asian blood fluke) paramyosin induced by Nucleic acids vaccination. Biochem Biophys Res Commun, 1995;212(3):1029
10 李柳哲，石佑恩. 日本血吸虫表面膜抗原23kDa的亚克隆鉴定与表达. 中国人兽共患病杂志,1999；15(3)：37
1999-10-21收稿, http://www.100md.com
单位：安徽医科大学病原生物学教研室，合肥 230032
关键词：血吸虫；日本；谷胱甘肽转移酶类；克隆；分子；真核遗传载体
安徽医科大学学报990602 中国图书资料分类法分类号 R383.24
摘要 目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体pBK CMV中，以便对其进行核酸疫苗的研究。方法 特定寡核苷酸引物的设计和合成，TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫RNA，RT-PCR法扩增GST基因编码序列，将扩增产物连接pGEM-T克隆载体，再亚克隆到真核表达载体pBK CMV中。结果 RT-PCR法特异性扩增出SjGST编码基因片段，其大小约为670 bp，经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEM-T-GST和pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMV-GST重组质粒的成功构建，为进一步表达GST及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。
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Subcloning of glutathione-S-transferase gene of Schistosoma
japonicum in eukaryocyte expression vector
Wang Xuelong, Shen Jijia, Jiang Zuojun
(Dept of Pathobiology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective Glutathione-S-Transferase (GST) gene of Schistosoma japonicum(SjGST) was subcloed into eukaryocyte expression vector pBK CMV in order to study its nucleic acids vaccine.Methods The design and synthesis of specific oligonucleotide primers; Potential use total RNA was isolated from adult worms of S. japonicum using TRIZOL reagent; Coding region gene of SjGST was amplified by RT-PCR technique; The product from PCR was firstly cloned into pGEM-T vector and subcloned into eukaryocyte expression vector pBK CMV via BamH1 and kpn1 sites;The resulting construct was determined by restriction analysis and PCR methods.Results The coding region gene of SjGST was specifically amplified by PCR, the size of fragment was 670 base pairs. The cloning plasmid construct (pGEM-T-GST) and expression plasmid (pBK CMV-GST) contained the amplified fragment.Conclusion The results demonstrat that pBK CMV-GST is successfully constructed and provides the basis for further study on GST expression and its immunological diagnosis and prevention.
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MeSH Schistosoma japonicum,immunol; glutathione transferases; cloning, molecular; geneticvectors
日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。目前虽有高效低毒的化疗药物吡喹酮，但其不能阻止再次感染、存在副反应以及虫体对药物抗性的出现等，故抗血吸虫疫苗的研究日益受到重视。血吸虫谷胱甘肽转移酶(SjGST)是血吸虫生理功能所需的解毒酶，其免疫动物可降低机体虫荷及成虫的生殖能力，延缓或阻止虫卵发育成熟，是血吸虫疫苗的侯选分子之一〔1～3〕。而DNA疫苗具有亚单位疫苗的完全性和减毒活疫苗诱导全面免疫反应的高效性〔4〕。同时，谷胱甘肽转移酶业已被证明可被病人血清中抗体所识别，具有一定的免疫诊断价值。为此，本试验将SjGST编码区基因亚克隆到真核表达载体pBK CMV中，现将结果报道如下。
1 材料与方法
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1.1 日本血吸虫成虫 含尾蚴的钉螺购自中国预防医学科学院寄研所，逸出尾蚴，感染家兔，45天时剖杀，经门静脉系统灌注收集成虫。
1.2 主要试剂及酶类 RNA提取试剂盒(TRIZOL Reagent)，第一链cDNA合成试剂盒GIBCO公司产品；Taq DNA 聚合酶，dNTP，PCR纯化试剂盒，pGEM-T载体系统为Promega公司产品；T4 DNA连接酶、BamHⅠ、kpnⅠ和λDNA/HindⅢ限制性内切酶为华美公司产品；XL1-blue大肠杆菌菌株、pBK CMV真核表达载体由本校分子生物学实验室惠赠；其余试剂为国产分析纯。
1.3 引物 根据日本血吸虫菲律宾株GST cDNA核苷酸序列〔5〕设计并合成一对引物：
P1： 5′-TAAGGATCCCATGTCCCCTATACTAGG-3′
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P2： 5′-AGCGGTACCTTATTTTGGAGGATGGTC-3′
两条引物的5′端分别引入限制性内切酶BamHⅠ和kpnⅠ酶切位点。引物由中科院上海植物生理研究所合成。
1.4 成虫总RNA的提取和cDNA第一链合成 分别按试剂盒(Cat NO 10296-010和18089-011)提供程序进行。
1.5 PCR 10×PCR缓冲液10 μl，10 mmol dNTP 10 μl,P1和P2各1 μl,SjcDNA第一链合成物10 μl,Taq聚合酶2 μl,加水至总体积100 μl,置HeMa480扩增仪(珠海黑马公司)上,在下列条件下扩增:94℃ 1 min，54℃ 1 min, 72℃ 1.5 min，总36个循环,再72℃延伸20 min，琼脂糖凝胶电泳观察分析PCR结果。PCR产物的纯化按试剂盒说明进行。
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1.6 血吸虫GST基因的克隆与鉴定 以近4∶1摩尔比将目的基因DNA和pGEM-TDNA于4℃连接过夜。按文献制备感受态细胞XL1-blue，将连接物转染细胞〔6〕，然后再将反应物涂布于LB/Amp/IPTG/X-gal平板, 37℃培养过夜。挑取单个白色菌落,置LB/Amp液体培养基中培养,次日小量提取质粒DNA(pGEM-T-GST), 质粒同时进行BamHⅠ和kpnⅠ双酶切和以质粒为模板的PCR,引物与反应条件同前。酶切和PCR产物经琼脂糖电泳鉴定。
1.7 GST基因片段的分离回收与亚克隆 pGEM-T-GST和pBK CMV同时用BamHⅠ和kpnⅠ双酶切，电泳后在紫外灯下切下含目的基因的凝胶，装进处理过的透析袋中，继续电泳60 min，收集袋中液体，苯酚抽提、乙醇沉淀回收GST基因和pBK CMV载体的酶切片段。两者经T4 DNA连接酶作用过夜，按步骤1.6制备感受态细胞，DNA转染细胞，重组克隆的筛选，酶切与PCR进行鉴定。(见图1)
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图1 质粒pGEM-T-GST和pBK CMV-GST的构建
2 结果
2.1 SjGST基因PCR扩增 以日本血吸虫总RNA逆转录合成SjcDNA第一链，以此为模板，用特异引物P1、P2经PCR扩增出一条近670bp的特异条带(见图2),与预期结果相符。
图2 PCR产物的10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳
1： PCR产物， 2：λDNA/HindⅢ Marker
2.2 重组pGEM-T-GST酶切及PCR鉴定 重组pGEM-T-GST质粒经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切后,可见一条与PCR产物一致的DNA片段, 以质粒为模板进行PCR扩增,亦可获得一条与cDNA为模板一致的PCR产物(见图3),表明重组pGEM-T-GSTDNA构建成功。
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图3 pGEM-T-GST和pBKCMV-GST的酶切分析和PCR鉴定
1：pGEM-T-GST BamHⅠ和kpnⅠ双酶切， 2：pGEM-T-GST为模板的PCR扩增，3：pBKCMV-GST BamHⅠ和kpnⅠ双酶切，4：pBKCMV-GST为模板的PCR扩增，5：λDNA/HindⅢ Marker
2.3 pBK CMV-GST真核表达质粒的构建与鉴定 pGEM-T-GST经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切后回收的目的基因被亚克隆到pBK CMV的相应的多克隆酶切位点，形成重组真核表达质粒pBK CMV-GST，其中目的基因正向位于强启动子CMV的下游。该质粒经BamHⅠ和kpnⅠ双酶切和PCR，均产生一大小约为670bp的DNA片段(见图3)。
3 讨论
核酸疫苗是指含某种蛋白质编码基因的重组表达质粒，通过肌肉注射等途径将其接种动物后，外源基因可在宿主细胞内表达目的蛋白并诱导免疫应答。抗疟疾、黑热病等的DNA疫苗的动物实验已取得可喜结果，Sedegah等〔7〕给鼠肌肉注射编码约氏疟原虫环子孢子蛋白的质粒DNA，用子孢子攻击感染后的肝期原虫负荷下降86%；接受过2或3次疫苗注射的小鼠中，疫苗对68%小鼠具有保护作用。Xu等〔8〕将含编码利什曼原虫GP63基因的重组pcDNA1直接免疫BALB/c小鼠，发现免疫小鼠已产生高度抵抗力。
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日本血吸虫DNA疫苗的研究也已取得一定进展。Yang等〔9〕给小鼠肌肉注射携带血吸虫副肌球蛋白(Sj97)基因的质粒DNA，诱导小鼠产生特异性抗Sj97抗体。李柳哲等〔10〕将重组有血吸虫表膜蛋白23×103 u的质粒给小鼠肌肉注射，攻击感染后，发现实验小鼠减虫率达到33.1%，减卵率为49.59%。
本实验先体外扩增SjGST编码基因，并将其插入pGEM-T克隆载体，再亚克隆入真核表达载体pBK CMV中，筛选后用双酶切及用重组质粒为模板的PCR予以证实。本研究为SjGST的诱导表达和重组质粒DNA经不同途径免疫小鼠的抗血吸虫保护作用等的研究正在进行当中。
基金项目：安徽省自然科学基金资助课题(编号 97410042)、安徽省卫生厅科研基金部分资助
作者简介：汪学龙，男，35岁，副教授
, 百拇医药
蒋作君，男，44岁，博士，教授，硕士生导师，教研室主任
参考文献
1 Bergquist NR, Colley DG. Schistosomiasis vaccines: research to development. Parasitol Today， 1998;14(2):99
2 Liu SX, Song GC, Xu YX et al. Immunization of mice with recombinant Sjc26GST induces a pronounced anti-fecundity effect after experimental infection with Chinese Schistosoma japonicum. Vaccine， 1995;13(6):603
3 Carpron AG, Riveau JM, Graych B et al. Development of a vaccine strategy against human and bovine schistosomiasis. Trop Geog Med， 1994;46(4):242
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4 Waine GJ, McManus DP. Nucleic acids: Vaccines of the future. Parasitol Today， 1995; 11(3):113
5 Smith DB, Johnson KS. Single step purification of polypeptides expression in Escherichia coli as fusions with glutathione -S- transferase. Gene， 1988；67(1):31
6 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:19
, 百拇医药 7 Sedegah M, Hedstrom R, Hobart P et al. Protection against Malaria by immunization with plasmid DNA encoing cirumsporozoite protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(21):9866
8 Xu D, Liew FY. Protection against Leishmaniasis by injection of DNA encoding a major surface glycoprotein, gp63,of L. Major. Immunol, 1995; 84(2):173
9 Yang W, Waine GJ, Scott JC et al. Antibodies to Schistosoma japonicum(Asian blood fluke) paramyosin induced by Nucleic acids vaccination. Biochem Biophys Res Commun, 1995;212(3):1029
10 李柳哲，石佑恩. 日本血吸虫表面膜抗原23kDa的亚克隆鉴定与表达. 中国人兽共患病杂志,1999；15(3)：37
1999-10-21收稿, http://www.100md.com