兔骨骼肌肌球蛋白轻链的分离纯化
作者：鲁云霞 周青 汪惠园 刘虎 朱华庆 汪渊
单位：鲁云霞 周青 刘虎 朱华庆 汪渊(安徽医科大学分子生物学实验室和生物化学教研室，合肥 230032)；汪惠园(安徽医科大学第一附属医院血液内科，合肥 230022)
关键词：肌球蛋白轻链；分离和提纯
安徽医科大学学报000104 摘要 目的 从兔骨骼肌中提取肌球蛋白轻链，为下一步研究肌肉收缩原理提供可磷酸化的底物。方法 用离心、透析、柱层析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和电泳转移等方法纯化兔骨骼肌肌球蛋白轻链。结果 提取纯化得到较纯的肌球蛋白，进一步得到轻链混合液和各种轻链纯品，经紫外吸收检测及SDS-PAGE证实其分子量分别为25000(MLC1)、19000(MLC2)和16500(MLC3)，均与文献报道基本一致。结论 研究所用的方法可行，所得到的肌球蛋白及其轻链样品较纯，可用于下一步实验。
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自由词 可磷酸化的底物；柱层析；兔骨骼肌
中图分类号 R341.22；R349.3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0014-04
Isolation and purification of
skeletal muscle myosin light chains from rabbit
Lu Yunxia, Zhou Qing,Wang Huiyuan et al
(Laboratory of Molecular Biology and Dept
of Biochemistry of Anhui Medical University,Hefei 230032)
, 百拇医药
Abstract Objective To obtain myosin light chains (MLC) from rabbit skeletal muscle in order to provide phosphorylatable substrate for muscle contraction. Methods The centrifugation, dialsis,ion exchange chromatography,SDS-PAGE and electrophoresis transferring were used to obtain MLC. Results Pure myosins and all kinds of light chains were obtained and their behaviors are similar with those references reported. Their molecular weight are 25000(MLC),19000(MLC2) and 16500(MLC3) respectively. Conclusion The methods are practicable and the purified MLC can be used for further study.
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MeSH myosin light chains/isolation and purification
Free words phosphorylatable substrate; SDS-PAGE; rabbit skeletal muscle
肌球蛋白(EC3613)，又称ATP磷酸水解酶，通过催化水解ATP提供肌肉收缩所需能量。目前已从很多动物的肌肉或非肌肉组织甚至血小板细胞中分离纯化出相应的肌球蛋白〔1〕。其中兔骨骼肌肌球蛋白是研究肌肉收缩机制中运用最为广泛的一种蛋白。不论是何种来源的肌球蛋白均由轻链和重链组成，其中轻链又分为调节轻链和必需轻链两种，前者可由肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)在Ca2+及钙调蛋白(calmodulin)存在时催化其磷酸化而导致肌动蛋白与肌球蛋白反应进而引发肌肉收缩〔2，3〕。我们提纯的兔骨骼肌肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)即是为下一步研究肌肉收缩原理提供可磷酸化的底物，同时也为进一步免疫学实验提供较纯的免疫原。
, 百拇医药
1 材料
1.1 实验动物 健康成年♂白兔，由安徽医科大学动物实验中心提供(皖医实动准字01)，取其腿肌和背肌，新鲜制备或-80℃保存备用。
1.2 试剂 DEAE纤维素(DE-52)为Whatman进口分装，ATP为美国Sigma公司产品，DTT为上海生物工程公司产品(进口分装)，其余均为国产分析纯或化学纯试剂。
1.3 仪器 DE-52柱层析在WXJ-9388核酸蛋白检测仪及配套仪器上进行，测定蛋白质紫外吸收值在国产UV-754分光光度计上进行。
2 方法
2.1 兔骨骼肌肌球蛋白粗提液的制备〔4〕 以下所有实验步骤均在4℃下进行。将兔骨骼肌去除脂肪和结缔组织，生理盐水洗净，剪成小块后绞碎，用溶液A(0.3 mol.L-1 KCl，0.15 mol.L-1磷酸钾缓冲液，0.02 mol.L-1 EDTA，0.005 mol.L-1 MgCl2 0.01 mol.L-1焦磷酸钠，0.001 mol.L-1 ATP，pH6.5)搅拌抽提15 min，4倍体积的冷水稀释终止抽提，3层纱布过滤去除肉渣。抽提液再用冷水稀释至其离子强度约为0.04，放置至少3 h后，虹吸去除上清液，离心(7000 r.min-1)15 min收集沉淀蛋白，用适量溶液B(1.0 mol.L-1 KCl，0.025 mol.L-1 EDTA，0.06 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)溶解，对溶液C(0.6 mol.L-1 KCl，0.025 mol.L-1磷酸钾缓冲液，0.01 mol.L-1 EDTA， 0.001 mol.L-1 DTT，pH6.5)透析过夜，向透析液中缓慢加入等体积的冷去离子水，搅拌30 min后离心(10000 r.min-1)10 min去除肌动球蛋白，上清液用冷水稀释至离子强度约为0.04，静置过夜后离心，沉淀重新溶解在溶液D(3.0 mol.L-1 KCl，0.01 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)中，对溶液E(0.6 mol.L-1 KCl,0.05 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)透析过夜得肌球蛋白粗提液。
, 百拇医药
2.2 肌球蛋白的纯化〔5〕 将肌球蛋白粗提液稀释至5～10 g.L-1，对溶液F(0.16 mol.L-1 KCl，20 mmol.L-1 Tris-HCl,pH 8.2)充分透析，离心(12000 r.min-1)15 min去沉淀，上清液加在用上述缓冲液充分平衡的15 cm×3 cm DE-52层析柱顶，用同一缓冲液洗 脱至流出液的A280值可忽略不计为止；改用溶液G(0.3 mol.L-1 KCl，20 mmol.L-1 Tris-HCl，pH8.2)洗脱；最后用溶液H(1.5 mol.L-1 KCl,20 mmol.L-1 Tris-HCl,pH8.2)洗脱，流速控制在30 ml.h-1，每管约10 ml，分别收集各洗脱峰，并测其A280和A260值，合并含肌球蛋白量高的各管进行浓缩。
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2.3 ATP酶活性测定 采用Fiske和Subbarow修改的方法，测定反应中无机磷的释放量〔6〕，根据需要加入Ca2+激活之。
2.4 肌球蛋白轻链的制备〔7〕 向溶于0.6 mol.L-1 KCl的肌球蛋白溶液(30～40 g.L-1)中加入等体积的溶液I(8 mol.L-1尿素，50 mmol.L-1 Tris-HCl,10 mmol.L-1 EDTA，5 mmol.L-1 DTT,pH8.0)，室温下搅拌1 h(以下步骤均在4℃进行)后，加入10倍体积的冷水，离心(14000 r.min-1)15 min弃沉淀(含重链)，上清液即为轻链混和液，上样于事先用50 mmol.L-1 Tris-HCl、2×10-4 mol.L-1 DTT、pH 8.0溶液充分平衡的60 cm×2 cm DE-52柱，洗脱去除尿素，然后改用1.0 mol.L-1 KCl、50 mmol.L-1 Tris-HCl、pH 8.0的溶液洗脱得到轻链混和液。
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2.5 肌球蛋白及其轻链的鉴定及纯化 用不连续的垂直板SDS-PAGE法，浓缩胶为1 g.L-1 SDS-60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶，分离胶为1 g.L-1 SDS-120 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶，电泳条件为：电压50 V×30 min,电压100 V至指示剂溴酚蓝迁移至下端约1 cm处，电泳约2.5 h。以肌球蛋白纯化各阶段的溶液作样品，在同一板上电泳作比较，再将轻链混和液作样品，电泳染色后切下各轻链区带，用电泳转移法(80V×5 h)得到相应的纯品。
2.6 蛋白浓度测定 Lowry法和紫外吸收法。
3 结果
3.1 肌球蛋白的纯化 如图1所示，经洗脱共可得到三个峰，其中峰1 A280/A260=1.72，峰2 A280/A260=0.91，峰3 A280/A260=0.48，结果表明峰1是蛋白峰，且较纯；而峰2和峰3均混有不同数量的核酸。此外测峰1各管的ATPase活性证明它正是肌球蛋白。
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3.2 肌球蛋白的ATP酶活性 由表1可知，肌球蛋白逐步被纯化，但纯化倍数不高(2.89倍)。
3.3 肌球蛋白轻链的制备 如图2所示，作者曾用两种不同层析柱(15 cm×3 cm和60 cm×2 cm)制备轻链，结果发现细长柱的分辨率较高，得到的蛋白峰高且窄，而用粗短柱得到的蛋白峰较宽(结果未显示)。
图1 肌球蛋白的柱层析洗脱曲线
表1 肌球蛋白纯化各阶段的ATPase活性
体积
(ml)
蛋白
(mg)
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Ca2+-ATPase
活性
(mmol Pi.L-1)
Ca2+-ATPase
比活性(mmol
Pi.min-1.g-1)
第一次冷水稀释液
1400
7420
4922
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0.662
第一次离心透析液
45
520
403
0.775
第二次离心液
80
259
333
1.286
上柱样液
52
, 百拇医药
201
385
1.913
图2 MLC的柱层析洗脱曲线
3.4 肌球蛋白及其轻链的电泳图谱 图3为肌球蛋白纯化各阶段的SDS-PAGE，可见杂蛋白逐渐减少，而肌球蛋白的重链和轻链分别在板胶的上下端。图4为将轻链混和液电泳染色后的区带切下作电泳转移，再以得到的各轻链纯品作样品再次电泳，通过与已知分子量的标准蛋白相比较，得出三条轻链的分子量分别为25000(MLC1)、19000(MLC2)和16500(MLC3)。
3.5 MLC的紫外吸收光谱 将经尿素裂解、DE-52柱层析去除尿素后的MLC混和液在240～320 nm测定其紫外吸收光谱，如图5所示，A280/A260=0.49，说明A260>A280。
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图3 肌球蛋白纯化各阶段的SDS-PAGE图谱
1 第一次冷水稀释液； 2 第一次离心透析液；3 第二次离心液； 4 柱层析后洗脱液；5 柱层析前上样液； 6 SDS-PAGE低分子量蛋白标准
图4 MLC纯化蛋白的SDS-PAGE图谱
1 MLC混合样品； 2和3 MLC1；4 MLC2； 5 MLC3； 6 SDS-PAGE低分子量蛋白标准
4 讨论
纯化肌球蛋白有两个原则，一是在离子强度约为0.3时选择性沉淀肌球蛋白并通过离心除去；二是用冷水稀释至离子强度为0.04，此时肌球蛋白不溶，通过至少两次这样的过程去除血清蛋白和其它杂蛋白。即使这样肌球蛋白粗提液中仍然包含10%～15%的杂质，通过DEAE纤维素作为层析介质在pH 7～8之间可有效地纯化肌球蛋白。我们得到的洗脱峰有三个，其中峰1经证明为肌球蛋白，峰2可能是腺苷酸脱氨酶〔5〕，峰3A280/A260接近纯核酸比值，表明我们所用的柱层析方法至少除去了核酸的污染。肌球蛋白与其它蛋白不同之处在于它具有水解ATP的酶活性，但肌肉细胞中还有其它一些酶(如Mg2+-激活肌肉ATPase等)均能水解ATP释放出无机磷酸，因此测定ATP酶活性并非是确定肌球蛋白纯化效率的最好方法。MLC分子中含有大量的苯丙氨酸〔7〕，故有较高的A260值，也造成了MLC所特有的紫外吸收光谱。我们测定了从240～320 nm MLC紫外吸收值的变化，结果与文献报道基本一致。我们用SDS-PAGE结合电泳转移技术得到了兔骨骼肌肌球蛋白的三种轻链，其分子量与文献报道一致。其中MLC2是可磷酸化的调节轻链(简称P-轻链)，因能被DTNB从肌球蛋白中解离而经常被称为DTNB轻链。我们提纯的该轻链既可作为底物来研究MLCK与肌肉收缩及动脉粥样硬化的关系，也能作为免疫原进行免疫学实验。
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图5 MLC的紫外吸收光谱
基金项目：中华人民共和国教育部优秀年轻教师研究基金(99044312)、国家自然科学研究基金(39870324)和安徽省教委科学研究基金(99JL0090)
作者简介：鲁云霞，女，30岁，硕士，讲师；
汪 渊，男，41岁，教授，硕士生导师
1，Adelstein RS, Pollard TD, Kuehl WM. Isolation and characterization of myosin and two myosin fragments from human blood platelets. Proc Natl Acad Sci USA,1971;68:2703
2，Paul BH. Acidic residues comprise part of the myosin light chain-binding site on skeletal muscle MLCK. J Biol Chem,1990;265(27):16588
, 百拇医药
3，Perrie WT, Perry SV. An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin. Biochem J,1970;119:31
4，Trayer IP, Perry SV. The myosin of developing skeletal muscle. Biochemische Zeitschrift,1996;345:87
5，Perry SV. The chromatography of L-myosin on diethylaminoethlcellulose. Biochem J,1960;74:94
6，王延枝，冷 楠，鲁云霞.小麦根H+-ATPase与脂质体的重组方法研究.植物生理学通讯，1993；29(1)：53
7，Holt JC, Lowey S. An immunological approach to the role of the low molecular weight subunits in myosin I physical-chemical and immunological characterization of the light chains. Biochemistry,1975;14:4600
1999-09-06收稿，1999-11-10修回, 百拇医药
单位：鲁云霞 周青 刘虎 朱华庆 汪渊(安徽医科大学分子生物学实验室和生物化学教研室，合肥 230032)；汪惠园(安徽医科大学第一附属医院血液内科，合肥 230022)
关键词：肌球蛋白轻链；分离和提纯
安徽医科大学学报000104 摘要 目的 从兔骨骼肌中提取肌球蛋白轻链，为下一步研究肌肉收缩原理提供可磷酸化的底物。方法 用离心、透析、柱层析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和电泳转移等方法纯化兔骨骼肌肌球蛋白轻链。结果 提取纯化得到较纯的肌球蛋白，进一步得到轻链混合液和各种轻链纯品，经紫外吸收检测及SDS-PAGE证实其分子量分别为25000(MLC1)、19000(MLC2)和16500(MLC3)，均与文献报道基本一致。结论 研究所用的方法可行，所得到的肌球蛋白及其轻链样品较纯，可用于下一步实验。
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自由词 可磷酸化的底物；柱层析；兔骨骼肌
中图分类号 R341.22；R349.3
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0014-04
Isolation and purification of
skeletal muscle myosin light chains from rabbit
Lu Yunxia, Zhou Qing,Wang Huiyuan et al
(Laboratory of Molecular Biology and Dept
of Biochemistry of Anhui Medical University,Hefei 230032)
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Abstract Objective To obtain myosin light chains (MLC) from rabbit skeletal muscle in order to provide phosphorylatable substrate for muscle contraction. Methods The centrifugation, dialsis,ion exchange chromatography,SDS-PAGE and electrophoresis transferring were used to obtain MLC. Results Pure myosins and all kinds of light chains were obtained and their behaviors are similar with those references reported. Their molecular weight are 25000(MLC),19000(MLC2) and 16500(MLC3) respectively. Conclusion The methods are practicable and the purified MLC can be used for further study.
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MeSH myosin light chains/isolation and purification
Free words phosphorylatable substrate; SDS-PAGE; rabbit skeletal muscle
肌球蛋白(EC3613)，又称ATP磷酸水解酶，通过催化水解ATP提供肌肉收缩所需能量。目前已从很多动物的肌肉或非肌肉组织甚至血小板细胞中分离纯化出相应的肌球蛋白〔1〕。其中兔骨骼肌肌球蛋白是研究肌肉收缩机制中运用最为广泛的一种蛋白。不论是何种来源的肌球蛋白均由轻链和重链组成，其中轻链又分为调节轻链和必需轻链两种，前者可由肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)在Ca2+及钙调蛋白(calmodulin)存在时催化其磷酸化而导致肌动蛋白与肌球蛋白反应进而引发肌肉收缩〔2，3〕。我们提纯的兔骨骼肌肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)即是为下一步研究肌肉收缩原理提供可磷酸化的底物，同时也为进一步免疫学实验提供较纯的免疫原。
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1 材料
1.1 实验动物 健康成年♂白兔，由安徽医科大学动物实验中心提供(皖医实动准字01)，取其腿肌和背肌，新鲜制备或-80℃保存备用。
1.2 试剂 DEAE纤维素(DE-52)为Whatman进口分装，ATP为美国Sigma公司产品，DTT为上海生物工程公司产品(进口分装)，其余均为国产分析纯或化学纯试剂。
1.3 仪器 DE-52柱层析在WXJ-9388核酸蛋白检测仪及配套仪器上进行，测定蛋白质紫外吸收值在国产UV-754分光光度计上进行。
2 方法
2.1 兔骨骼肌肌球蛋白粗提液的制备〔4〕 以下所有实验步骤均在4℃下进行。将兔骨骼肌去除脂肪和结缔组织，生理盐水洗净，剪成小块后绞碎，用溶液A(0.3 mol.L-1 KCl，0.15 mol.L-1磷酸钾缓冲液，0.02 mol.L-1 EDTA，0.005 mol.L-1 MgCl2 0.01 mol.L-1焦磷酸钠，0.001 mol.L-1 ATP，pH6.5)搅拌抽提15 min，4倍体积的冷水稀释终止抽提，3层纱布过滤去除肉渣。抽提液再用冷水稀释至其离子强度约为0.04，放置至少3 h后，虹吸去除上清液，离心(7000 r.min-1)15 min收集沉淀蛋白，用适量溶液B(1.0 mol.L-1 KCl，0.025 mol.L-1 EDTA，0.06 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)溶解，对溶液C(0.6 mol.L-1 KCl，0.025 mol.L-1磷酸钾缓冲液，0.01 mol.L-1 EDTA， 0.001 mol.L-1 DTT，pH6.5)透析过夜，向透析液中缓慢加入等体积的冷去离子水，搅拌30 min后离心(10000 r.min-1)10 min去除肌动球蛋白，上清液用冷水稀释至离子强度约为0.04，静置过夜后离心，沉淀重新溶解在溶液D(3.0 mol.L-1 KCl，0.01 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)中，对溶液E(0.6 mol.L-1 KCl,0.05 mol.L-1磷酸钾缓冲液，pH6.5)透析过夜得肌球蛋白粗提液。
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2.2 肌球蛋白的纯化〔5〕 将肌球蛋白粗提液稀释至5～10 g.L-1，对溶液F(0.16 mol.L-1 KCl，20 mmol.L-1 Tris-HCl,pH 8.2)充分透析，离心(12000 r.min-1)15 min去沉淀，上清液加在用上述缓冲液充分平衡的15 cm×3 cm DE-52层析柱顶，用同一缓冲液洗 脱至流出液的A280值可忽略不计为止；改用溶液G(0.3 mol.L-1 KCl，20 mmol.L-1 Tris-HCl，pH8.2)洗脱；最后用溶液H(1.5 mol.L-1 KCl,20 mmol.L-1 Tris-HCl,pH8.2)洗脱，流速控制在30 ml.h-1，每管约10 ml，分别收集各洗脱峰，并测其A280和A260值，合并含肌球蛋白量高的各管进行浓缩。
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2.3 ATP酶活性测定 采用Fiske和Subbarow修改的方法，测定反应中无机磷的释放量〔6〕，根据需要加入Ca2+激活之。
2.4 肌球蛋白轻链的制备〔7〕 向溶于0.6 mol.L-1 KCl的肌球蛋白溶液(30～40 g.L-1)中加入等体积的溶液I(8 mol.L-1尿素，50 mmol.L-1 Tris-HCl,10 mmol.L-1 EDTA，5 mmol.L-1 DTT,pH8.0)，室温下搅拌1 h(以下步骤均在4℃进行)后，加入10倍体积的冷水，离心(14000 r.min-1)15 min弃沉淀(含重链)，上清液即为轻链混和液，上样于事先用50 mmol.L-1 Tris-HCl、2×10-4 mol.L-1 DTT、pH 8.0溶液充分平衡的60 cm×2 cm DE-52柱，洗脱去除尿素，然后改用1.0 mol.L-1 KCl、50 mmol.L-1 Tris-HCl、pH 8.0的溶液洗脱得到轻链混和液。
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2.5 肌球蛋白及其轻链的鉴定及纯化 用不连续的垂直板SDS-PAGE法，浓缩胶为1 g.L-1 SDS-60 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶，分离胶为1 g.L-1 SDS-120 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶，电泳条件为：电压50 V×30 min,电压100 V至指示剂溴酚蓝迁移至下端约1 cm处，电泳约2.5 h。以肌球蛋白纯化各阶段的溶液作样品，在同一板上电泳作比较，再将轻链混和液作样品，电泳染色后切下各轻链区带，用电泳转移法(80V×5 h)得到相应的纯品。
2.6 蛋白浓度测定 Lowry法和紫外吸收法。
3 结果
3.1 肌球蛋白的纯化 如图1所示，经洗脱共可得到三个峰，其中峰1 A280/A260=1.72，峰2 A280/A260=0.91，峰3 A280/A260=0.48，结果表明峰1是蛋白峰，且较纯；而峰2和峰3均混有不同数量的核酸。此外测峰1各管的ATPase活性证明它正是肌球蛋白。
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3.2 肌球蛋白的ATP酶活性 由表1可知，肌球蛋白逐步被纯化，但纯化倍数不高(2.89倍)。
3.3 肌球蛋白轻链的制备 如图2所示，作者曾用两种不同层析柱(15 cm×3 cm和60 cm×2 cm)制备轻链，结果发现细长柱的分辨率较高，得到的蛋白峰高且窄，而用粗短柱得到的蛋白峰较宽(结果未显示)。
图1 肌球蛋白的柱层析洗脱曲线
表1 肌球蛋白纯化各阶段的ATPase活性
体积
(ml)
蛋白
(mg)
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Ca2+-ATPase
活性
(mmol Pi.L-1)
Ca2+-ATPase
比活性(mmol
Pi.min-1.g-1)
第一次冷水稀释液
1400
7420
4922
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0.662
第一次离心透析液
45
520
403
0.775
第二次离心液
80
259
333
1.286
上柱样液
52
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201
385
1.913
图2 MLC的柱层析洗脱曲线
3.4 肌球蛋白及其轻链的电泳图谱 图3为肌球蛋白纯化各阶段的SDS-PAGE，可见杂蛋白逐渐减少，而肌球蛋白的重链和轻链分别在板胶的上下端。图4为将轻链混和液电泳染色后的区带切下作电泳转移，再以得到的各轻链纯品作样品再次电泳，通过与已知分子量的标准蛋白相比较，得出三条轻链的分子量分别为25000(MLC1)、19000(MLC2)和16500(MLC3)。
3.5 MLC的紫外吸收光谱 将经尿素裂解、DE-52柱层析去除尿素后的MLC混和液在240～320 nm测定其紫外吸收光谱，如图5所示，A280/A260=0.49，说明A260>A280。
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图3 肌球蛋白纯化各阶段的SDS-PAGE图谱
1 第一次冷水稀释液； 2 第一次离心透析液；3 第二次离心液； 4 柱层析后洗脱液；5 柱层析前上样液； 6 SDS-PAGE低分子量蛋白标准
图4 MLC纯化蛋白的SDS-PAGE图谱
1 MLC混合样品； 2和3 MLC1；4 MLC2； 5 MLC3； 6 SDS-PAGE低分子量蛋白标准
4 讨论
纯化肌球蛋白有两个原则，一是在离子强度约为0.3时选择性沉淀肌球蛋白并通过离心除去；二是用冷水稀释至离子强度为0.04，此时肌球蛋白不溶，通过至少两次这样的过程去除血清蛋白和其它杂蛋白。即使这样肌球蛋白粗提液中仍然包含10%～15%的杂质，通过DEAE纤维素作为层析介质在pH 7～8之间可有效地纯化肌球蛋白。我们得到的洗脱峰有三个，其中峰1经证明为肌球蛋白，峰2可能是腺苷酸脱氨酶〔5〕，峰3A280/A260接近纯核酸比值，表明我们所用的柱层析方法至少除去了核酸的污染。肌球蛋白与其它蛋白不同之处在于它具有水解ATP的酶活性，但肌肉细胞中还有其它一些酶(如Mg2+-激活肌肉ATPase等)均能水解ATP释放出无机磷酸，因此测定ATP酶活性并非是确定肌球蛋白纯化效率的最好方法。MLC分子中含有大量的苯丙氨酸〔7〕，故有较高的A260值，也造成了MLC所特有的紫外吸收光谱。我们测定了从240～320 nm MLC紫外吸收值的变化，结果与文献报道基本一致。我们用SDS-PAGE结合电泳转移技术得到了兔骨骼肌肌球蛋白的三种轻链，其分子量与文献报道一致。其中MLC2是可磷酸化的调节轻链(简称P-轻链)，因能被DTNB从肌球蛋白中解离而经常被称为DTNB轻链。我们提纯的该轻链既可作为底物来研究MLCK与肌肉收缩及动脉粥样硬化的关系，也能作为免疫原进行免疫学实验。
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图5 MLC的紫外吸收光谱
基金项目：中华人民共和国教育部优秀年轻教师研究基金(99044312)、国家自然科学研究基金(39870324)和安徽省教委科学研究基金(99JL0090)
作者简介：鲁云霞，女，30岁，硕士，讲师；
汪 渊，男，41岁，教授，硕士生导师
1，Adelstein RS, Pollard TD, Kuehl WM. Isolation and characterization of myosin and two myosin fragments from human blood platelets. Proc Natl Acad Sci USA,1971;68:2703
2，Paul BH. Acidic residues comprise part of the myosin light chain-binding site on skeletal muscle MLCK. J Biol Chem,1990;265(27):16588
, 百拇医药
3，Perrie WT, Perry SV. An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin. Biochem J,1970;119:31
4，Trayer IP, Perry SV. The myosin of developing skeletal muscle. Biochemische Zeitschrift,1996;345:87
5，Perry SV. The chromatography of L-myosin on diethylaminoethlcellulose. Biochem J,1960;74:94
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1999-09-06收稿，1999-11-10修回, 百拇医药