重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备
作者：陈飞虎 盛晓蓉 吴亦伦 陈敏珠 智强
单位：陈飞虎 陈敏珠(安徽医科大学临床药理学研究所，合肥 230032)；盛晓蓉 吴亦伦(安徽省医学科学研究所病毒室，合肥 230061)；智强(安徽桑尼生物技术研究所，合肥 230042)
关键词：白细胞介素10；抗体；单克隆；分离和提纯；杂交瘤
安徽医科大学学报000207 摘要 目的 制备重组人白细胞介素10(rhIL-10)单克隆抗体。方法 应用鼠-鼠杂交瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，ELISA检测杂交瘤细胞培养上清、腹水效价，双向免疫扩散试验进行亚类鉴定，Giemsa染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果 获得了2株能分泌抗rhIL-10单克隆抗体的杂交瘤细胞系(1D3、2A3)，无血清培养液效价为1∶512、1∶256，腹水效价1∶105、1∶104。单克隆抗体为IgG2亚类，染色体数目98～103条。2株杂交瘤细胞体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。结论 制备的2株单克隆抗体效价高，稳定性强。
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中图分类号 R392.1
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0104-03
Preparation of the monoclonal antibodies against
recombinant human interleukin-10
Chen Feihu, Sheng Xiaorong, Wu Yilun et al
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To prepare monoclonal antibodies (McAb) against recombinant human interleukin-10 (rhIL-10). Methods Mouse-mouse hybridoma technolgy was used to set up hybridoma cell lines seereting McAbs. ELISA was used to detect the titer of serum-free supernatant and ascetic fluid, double immunodiffusion test to analyse the immsunoglobulin subclass, et al. Results Two hybridoma cell lines (1D3, 2A3)secreting mcAbs were prepared, the titers of serum-free supernatant were 1∶256～1∶512 and ascetic fluid were 1∶104～1∶105. The McAbs were IgG2 subclass. Chromosomal numbers 98～103. The hybridoma cells were bequeathed more than six months and the titers of antibody did not change obviously. Conclusion The two McAbs against rhIL-10 show high titer and good reliability.
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MeSH interleukin-10； antibodies, monoclonal/isolation and purification;hybridomas
白细胞介素10(Interleukin 10，IL-10)主要由Th2细胞产生，Th0、Th1、单核/巨噬细胞、B细胞及角朊细胞也可产生。其相对分子量为3.5×104～4.0×104，基因定位于第1号染色体上〔1，2〕。IL-10抑制抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC)的功能及T细胞增殖，抑制Th1合成细胞因子，下调主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ型的表达，单核/巨噬细胞产生的细胞因子的作用亦被强烈抑制〔3，4〕，故IL-10为重要的免疫调节因子。本研究利用重组人白细胞介素10(Recombiant human interleukin-10,rhIL-10)作为抗原，采用鼠-鼠杂交瘤技术制备了2株分泌高效价的抗rhIL-10单克隆抗体细胞株，为IL-10生物学与免疫学的深入研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 rhIL-10：安徽桑尼生物技术研究所提供，批号980825；PEG 400：Serva产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：Promega产品；RPMI 1640干粉：GIBCO产品；Balb/c小鼠：8～12周，♀，由本校实验动物中心提供(皖医实验动物准字第01号)；SP 2/0骨髓瘤细胞株：安徽省医学科学研究所病毒室保存，为防止HGPRT缺乏株逆转，融合前加8-AG驯化。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫 将100 μg rhIL-10抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，充分乳化，经小鼠背部皮下多点注射。两周后rhIL-10 200 μg腹腔注射，融合前3天，同剂量再注射一次。
1.2.2 细胞融合 将免疫小鼠脾细胞与SP 2/0细胞按5∶1比例混合于50ml尖底离心管中，置37℃水浴，于45 s内缓慢滴入1 ml 50% PEG 400，静置1 min离心收集细胞。将细胞悬于含HAT的选择培养液中，滴加于96孔培养板。
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1.2.3 筛选阳性克隆 采用间接ELISA筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞。用rhIL-10包板(每毫升20μg)BSA封闭，4℃保存，使用时加入待测上清每孔100μl，37℃温育2 h，洗板后加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1 000)，37℃ 1 h后显色。在酶标仪570 nm处测A值。大于阴性对照A值均数加2个标准差者(
±+2s)判断为阳性孔。
1.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 采用有限稀释法进行。
1.2.5 杂交瘤细胞无血清培养液及腹水制备
1.2.5.1 通过亚克隆获得的杂交瘤细胞在培养瓶中长满单层后，用无血清培养液洗1次，再加入无血清培养液培养，3天后收上清。
1.2.5.2 小鼠腹腔接种福氏不完全佐剂7～10天后，经腹腔接种105～106杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，抽取腹水，-20℃冻存。
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1.2.6 亚类鉴定 采用双向免疫扩散法。
1.2.7 杂交瘤细胞染色体计数 将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓度为0.3 mg*L-1的秋水仙素，于37℃继续培养2 h，收集细胞，加低渗溶液使细胞膨胀，固定制片，Giemsa染色，镜下计数。
2 结果
2.1 融合及克隆化 细胞融合后1周可见细胞集落，2块培养板共192孔，其中有173孔有融合的杂交瘤细胞生长，融合率达90%，用ELISA法检测，阳性率4.7%。挑选A值较高，每孔只有1个融合细胞生长的集落进行克隆。杂交瘤细胞1D3、2A3株经过3次克隆后，克隆阳检率达100%。
2.2 检测抗rhIL-10单克隆抗体效价
2.2.1 细胞无血清培养液培养3天，收上清测定抗体效价1D3、2A3分别为1∶512、1∶256。
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2.2.2 将杂交瘤细胞接种于致敏的小鼠腹腔，收获腹水用ELISA测定抗体效价，1D3、2A3两株为1∶105、1∶104。
2.2.3 该杂交瘤细胞3天传一代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体效价无明显改变。
2.3 抗体亚类鉴定 用双向免疫扩散法鉴定两株均为IgG2亚类。
2.4 染色体结果检查 1D3、2A3染色体条数为98～103条，约为脾细胞与SP2/0细胞染色体之和(见图1、2)。
3 讨论
IL-10是一种多功能细胞因子，可抑制作为炎症介质的单核因子的产生，同时它又正向调节具有抗炎症介质作用的IL-1ra，提示IL-10可能在许多临床情况下是一种有效的抗炎质物质，如菌血症、类风湿性关节炎和银屑病。最近的研究也表明，这些患者血液中IL-10的分泌发生改变〔5〕，如银屑病患者外周血单个核细胞中IL-10 mRNA表达明显降低，用rhIL-10治疗银屑病收到良好效果。由于IL-10还可抑制由T细胞亚群产生的细胞因子，可望被用于延长同种异植的存活，以及用于各种T细胞介导的自身免疫性疾病，如Ⅰ型糖尿病和多发性硬化症的治疗等。可见IL-10在一些疾病的发生与治疗中有重要作用。利用鼠-鼠杂交瘤技术，成功地制备了2株(1D3、2A3)杂交瘤细胞系可分泌高效价抗rhIL-10单克隆抗体，为进一步研究IL-10的结构与功能，以及IL-10在相关疾病中的作用奠定基础。
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图1 1D3杂交瘤细胞色体
图2 2A3杂交瘤细胞色体
陈飞虎，男，37岁，副教授，博士生
陈敏珠，女，67岁，博士生导师
参考文献
1，Frorentino DF, Zlotnik A, Vieira P et al. IL-10acts on the antigen-presenting cells to inhibit cytokine production by Th1 cells. J Immunol, 1991;146(10):3 444～3 451
2，Kim JM, Brannan CI, Copeland NG et al. Structure of the mouse IL-10 gene and chromosomal location of the mouse and human genes. J Immunol, 1992；148(11):3 618～3 623
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3，陈飞虎，路景清，陈敏珠等.rhIL-10对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响. 安徽医科大学学报，1999；34(4)：258
4，De Waal Malefyt R, Haanen J, Spits H et al. Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class Ⅱ major histocompalibility complexs expression. J Exp Med, 1991；174(4):915～924
5，Asadullah K, Sterry W, Stephanek K et al. IL-10 is a key cytokine in psoriasis:proof of principle by IL-10 therapy. A new therapeutic approach. J Clin Invest， 1998；101(4):783～794
1999-10-29收稿，2000-02-23修回, 百拇医药
单位：陈飞虎 陈敏珠(安徽医科大学临床药理学研究所，合肥 230032)；盛晓蓉 吴亦伦(安徽省医学科学研究所病毒室，合肥 230061)；智强(安徽桑尼生物技术研究所，合肥 230042)
关键词：白细胞介素10；抗体；单克隆；分离和提纯；杂交瘤
安徽医科大学学报000207 摘要 目的 制备重组人白细胞介素10(rhIL-10)单克隆抗体。方法 应用鼠-鼠杂交瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，ELISA检测杂交瘤细胞培养上清、腹水效价，双向免疫扩散试验进行亚类鉴定，Giemsa染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果 获得了2株能分泌抗rhIL-10单克隆抗体的杂交瘤细胞系(1D3、2A3)，无血清培养液效价为1∶512、1∶256，腹水效价1∶105、1∶104。单克隆抗体为IgG2亚类，染色体数目98～103条。2株杂交瘤细胞体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。结论 制备的2株单克隆抗体效价高，稳定性强。
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中图分类号 R392.1
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0104-03
Preparation of the monoclonal antibodies against
recombinant human interleukin-10
Chen Feihu, Sheng Xiaorong, Wu Yilun et al
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To prepare monoclonal antibodies (McAb) against recombinant human interleukin-10 (rhIL-10). Methods Mouse-mouse hybridoma technolgy was used to set up hybridoma cell lines seereting McAbs. ELISA was used to detect the titer of serum-free supernatant and ascetic fluid, double immunodiffusion test to analyse the immsunoglobulin subclass, et al. Results Two hybridoma cell lines (1D3, 2A3)secreting mcAbs were prepared, the titers of serum-free supernatant were 1∶256～1∶512 and ascetic fluid were 1∶104～1∶105. The McAbs were IgG2 subclass. Chromosomal numbers 98～103. The hybridoma cells were bequeathed more than six months and the titers of antibody did not change obviously. Conclusion The two McAbs against rhIL-10 show high titer and good reliability.
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MeSH interleukin-10； antibodies, monoclonal/isolation and purification;hybridomas
白细胞介素10(Interleukin 10，IL-10)主要由Th2细胞产生，Th0、Th1、单核/巨噬细胞、B细胞及角朊细胞也可产生。其相对分子量为3.5×104～4.0×104，基因定位于第1号染色体上〔1，2〕。IL-10抑制抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC)的功能及T细胞增殖，抑制Th1合成细胞因子，下调主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ型的表达，单核/巨噬细胞产生的细胞因子的作用亦被强烈抑制〔3，4〕，故IL-10为重要的免疫调节因子。本研究利用重组人白细胞介素10(Recombiant human interleukin-10,rhIL-10)作为抗原，采用鼠-鼠杂交瘤技术制备了2株分泌高效价的抗rhIL-10单克隆抗体细胞株，为IL-10生物学与免疫学的深入研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 rhIL-10：安徽桑尼生物技术研究所提供，批号980825；PEG 400：Serva产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：Promega产品；RPMI 1640干粉：GIBCO产品；Balb/c小鼠：8～12周，♀，由本校实验动物中心提供(皖医实验动物准字第01号)；SP 2/0骨髓瘤细胞株：安徽省医学科学研究所病毒室保存，为防止HGPRT缺乏株逆转，融合前加8-AG驯化。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫 将100 μg rhIL-10抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，充分乳化，经小鼠背部皮下多点注射。两周后rhIL-10 200 μg腹腔注射，融合前3天，同剂量再注射一次。
1.2.2 细胞融合 将免疫小鼠脾细胞与SP 2/0细胞按5∶1比例混合于50ml尖底离心管中，置37℃水浴，于45 s内缓慢滴入1 ml 50% PEG 400，静置1 min离心收集细胞。将细胞悬于含HAT的选择培养液中，滴加于96孔培养板。
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1.2.3 筛选阳性克隆 采用间接ELISA筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞。用rhIL-10包板(每毫升20μg)BSA封闭，4℃保存，使用时加入待测上清每孔100μl，37℃温育2 h，洗板后加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1 000)，37℃ 1 h后显色。在酶标仪570 nm处测A值。大于阴性对照A值均数加2个标准差者(
±+2s)判断为阳性孔。1.2.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 采用有限稀释法进行。
1.2.5 杂交瘤细胞无血清培养液及腹水制备
1.2.5.1 通过亚克隆获得的杂交瘤细胞在培养瓶中长满单层后，用无血清培养液洗1次，再加入无血清培养液培养，3天后收上清。
1.2.5.2 小鼠腹腔接种福氏不完全佐剂7～10天后，经腹腔接种105～106杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，抽取腹水，-20℃冻存。
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1.2.6 亚类鉴定 采用双向免疫扩散法。
1.2.7 杂交瘤细胞染色体计数 将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓度为0.3 mg*L-1的秋水仙素，于37℃继续培养2 h，收集细胞，加低渗溶液使细胞膨胀，固定制片，Giemsa染色，镜下计数。
2 结果
2.1 融合及克隆化 细胞融合后1周可见细胞集落，2块培养板共192孔，其中有173孔有融合的杂交瘤细胞生长，融合率达90%，用ELISA法检测，阳性率4.7%。挑选A值较高，每孔只有1个融合细胞生长的集落进行克隆。杂交瘤细胞1D3、2A3株经过3次克隆后，克隆阳检率达100%。
2.2 检测抗rhIL-10单克隆抗体效价
2.2.1 细胞无血清培养液培养3天，收上清测定抗体效价1D3、2A3分别为1∶512、1∶256。
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2.2.2 将杂交瘤细胞接种于致敏的小鼠腹腔，收获腹水用ELISA测定抗体效价，1D3、2A3两株为1∶105、1∶104。
2.2.3 该杂交瘤细胞3天传一代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体效价无明显改变。
2.3 抗体亚类鉴定 用双向免疫扩散法鉴定两株均为IgG2亚类。
2.4 染色体结果检查 1D3、2A3染色体条数为98～103条，约为脾细胞与SP2/0细胞染色体之和(见图1、2)。
3 讨论
IL-10是一种多功能细胞因子，可抑制作为炎症介质的单核因子的产生，同时它又正向调节具有抗炎症介质作用的IL-1ra，提示IL-10可能在许多临床情况下是一种有效的抗炎质物质，如菌血症、类风湿性关节炎和银屑病。最近的研究也表明，这些患者血液中IL-10的分泌发生改变〔5〕，如银屑病患者外周血单个核细胞中IL-10 mRNA表达明显降低，用rhIL-10治疗银屑病收到良好效果。由于IL-10还可抑制由T细胞亚群产生的细胞因子，可望被用于延长同种异植的存活，以及用于各种T细胞介导的自身免疫性疾病，如Ⅰ型糖尿病和多发性硬化症的治疗等。可见IL-10在一些疾病的发生与治疗中有重要作用。利用鼠-鼠杂交瘤技术，成功地制备了2株(1D3、2A3)杂交瘤细胞系可分泌高效价抗rhIL-10单克隆抗体，为进一步研究IL-10的结构与功能，以及IL-10在相关疾病中的作用奠定基础。
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图1 1D3杂交瘤细胞色体
图2 2A3杂交瘤细胞色体
陈飞虎，男，37岁，副教授，博士生
陈敏珠，女，67岁，博士生导师
参考文献
1，Frorentino DF, Zlotnik A, Vieira P et al. IL-10acts on the antigen-presenting cells to inhibit cytokine production by Th1 cells. J Immunol, 1991;146(10):3 444～3 451
2，Kim JM, Brannan CI, Copeland NG et al. Structure of the mouse IL-10 gene and chromosomal location of the mouse and human genes. J Immunol, 1992；148(11):3 618～3 623
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3，陈飞虎，路景清，陈敏珠等.rhIL-10对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响. 安徽医科大学学报，1999；34(4)：258
4，De Waal Malefyt R, Haanen J, Spits H et al. Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class Ⅱ major histocompalibility complexs expression. J Exp Med, 1991；174(4):915～924
5，Asadullah K, Sterry W, Stephanek K et al. IL-10 is a key cytokine in psoriasis:proof of principle by IL-10 therapy. A new therapeutic approach. J Clin Invest， 1998；101(4):783～794
1999-10-29收稿，2000-02-23修回, 百拇医药