聚合酶链反应分析多肿瘤抑癌基因1第二外显子纯合性缺失
作者：刘虎 桂淑玉 汪渊 周青
单位：刘虎 汪渊 周青(安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032)；桂淑玉(安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，合肥 230022)
关键词：基因；抑制；肿瘤；外显子；聚合酶链反应
安徽医科大学学报000304 摘要 目的 摸索可靠、高效和特异的聚合酶链反应(PCR)条件，分析多肿瘤抑癌基因1(MTS1)第二外显子纯合性缺失。方法 对一系列PCR参数进行摸索同时设立对照，并对PCR产物进行Southern blot分析。结果 PCR产物是特异的MTS1第二外显子。结论 扩增MTS1第二外显子的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果。
中图分类号 R394.2
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0173-03
, http://www.100md.com
Establishment of PCR method to amplify specific
multiple tumor suppressor exon2
Liu Hu, Gui Shuyu, Wang Yuan et al
(Laboratory of Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish a reliable, productive and specific PCR to detect the homozygous deletion of multiple tumor suppressor (MTS1) gene exon2. Methods The PCR parameters to amplify MTS1 were optimized with normal control accompanied and the PCR products were corroborated by Southern blotting. Results The PCR products achieved are specific MTS1 exon2. Conclusion The PCR conditions to amplify MTS1 exon2 can produce reliable and specific results.
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MeSH genes, suppressor, tumor; exons; polymerase chain reaction
多肿瘤抑癌基因1(MTS1，p16/CDKN2)表达产物p16蛋白是近来发现的一种直接参与细胞周期调控的蛋白。研究表明MTS1基因的失活与诸多肿瘤的发生与发展有着密切关系。MTS1基因的失活方式有多种，如纯合性缺失、杂合性缺失、突变、甲基化，而在这些失活方式中，纯合性缺失最常见，约占50%〔1〕。
MTS1基因位于人染色体9p21区〔1，2〕，含数个CpG岛〔3〕。由于其GC含量高的序列，具有开链慢、复性快以及容易形成局部空间二级结构的特点, 导致MTS1第二外显子的扩增对PCR反应条件要求较高。因此有必要建立可靠、特异的MTS1第二外显子扩增方法,为进一步研究其在恶性肿瘤细胞中的分子生物学行为奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源 经病理确诊的实体瘤及癌旁正常组织、非实体瘤、正常血液标本均取自安徽医科大学第一附属医院, -80℃保存备检。
1.2 主要试剂和仪器 引物由美国GIBCO BRL公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR 缓冲液等购自华美生物工程公司；Dig DNA Labeling and Detection Kit (Cat No 1093657) 购自Boehringer Mannheim公司； p16 cDNA 重组克隆〔2〕 由美国冷泉港实验室David Beach 博士惠赠；其他试剂均为国产分析纯；Hema 480 基因扩增仪为珠海黑马公司产品。
1.3 实体瘤组织和白血病细胞DNA的制备 实体瘤取手术癌组织0.5 g，加入1 ml DNA 提取液 (100 mmol.L-1 NaCl, 1 mmol.L-1 EDTA，5 g.L-1 SDS, 50 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.0), 在冰上用玻璃匀浆器制备匀浆。白血病的抗凝血用低渗溶血法获取白细胞。在上述细胞悬液中加入50 μl蛋白酶K(2 g. L-1,37℃ 温育4～5 h)，酚/氯仿抽提，醋酸钠/乙醇沉淀，1×TE溶解，分光光度计定量，-80℃保存待测〔3，4〕。1.4 MTS1第二外显子的PCR分析 根据已发表的MTS1序列〔1，2〕，参照Kamb等报道设计引物。MTS1第二外显子：3′端引物(GW-Ⅳ-1Ⅰ)：5′ AGC TTT GGA AGC TCT CAG， 5′端引物(GW-Ⅳ-1G)：5′ TGG CTC TGA CCA TTC TGT; 并以CDK4作为参照，3′端引物(GW-Ⅳ-1K)：5′ GGA GGT CGG TAC CAG AGT G，5′端引物(GW-Ⅳ-1J): 5′ CAT GTA GAC CAG GAC AGG。在50 ng标本DNA模板中分别加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris, 50 mmol.L-1 KCl, 2 mmol.L-1 MgCl2, 0.01 g.L-1 Gelatin, 200 mmol.L-1 dNTPs,50 g.L-1 DMSO 和0.5 mmol.L-1引物)，Hema PCR自动循环仪中，97℃预变性5 min，冰上淬冷，加入用1×PCR缓冲液溶解的Taq酶3U，95℃ 1 min, 3步PCR,95℃ 1 min, 60℃ 1 min,72℃ 1 min,共35个循环，72℃ 5 min, 4℃保温。取8 μl PCR产物进行20 g.L-1琼脂糖电泳，以CDK4出现特异条带且未出现特异性MTS1 第一、二外显子和MTS2第二外显子条带为相应的纯合性缺失。
, 百拇医药
1.5 MTS1 cDNA探针的制作 挑取MTS1 cDNA重组质粒的阳性克隆，在3 ml LB/ampicillin培养基中小量培养，当OD600到达0.4时，吸取100 μl 菌液，加入200 ml LB/ampicillin培养基中培养过夜，用QIAGEN过柱的方法提取质粒，定量，EcoR I/Sal I 酶切，用电洗脱法分离、纯化插入片断〔3，4〕， 酚/氯仿抽提3遍，醋酸钠/乙醇沉淀，双蒸水溶解，定量，用15 μl 总量为1 μg 的插入片断进行地高辛标记，加入2 μl dNTP/Dig-dUTP混合液，2 μl六聚核苷酸混合液，1 μl Klenow 酶(2 U.L-1)，37℃水浴过夜，加入2 μl 0.2 mol.L-1 EDTA终止反应。
1.6 PCR产物的鉴定 PCR 产物进行20 g.L-1琼脂糖电泳，电泳结束后拍照，在变性液( NaOH, NaCl) 中浸泡45 min, 中和液中浸泡30 min至pH值接近中性，进行毛细管法转移DNA至硝酸纤维素薄膜上，NC膜经过80℃干烤交联后，即可放入加有甲醛预杂交液的塑料袋中(10 ml/100 cm2)，封口机封口，42℃水浴振摇30 min，Dig标记探针煮沸变性5 min(5～25 μg.L-1)，冰上淬冷。将探针加入到预温到42℃的杂交液中。倾去预杂交液，将加有探针的杂交液加入到塑料袋中，小心赶去气泡，封口。42℃水浴振摇过夜。杂交结束后，将NC膜在2×SSC和1 g.L-1 SDS中洗涤2次，每次5 min。然后，在0.1×SSC、1 g.L-1 SDS中68℃水浴振摇洗涤2次，每次15 min。在Washing Buffer(马来酸缓冲液，含Tween 20 3%，体积分数)中洗涤1～5 min。在1×Blocking Solution 中浸泡30 min，用1×Blocking Solution 1∶105稀释anti-Dig-AP conjugate。将膜在抗体溶液中孵育30 min。用Washing Buffer 洗涤2次，每次15 min。在detection buffer(0.1 mol.L-1 Tris-HCl,0.1 mol.L-1 NaCl,50 mmol.L-1 MgCl2,pH 9.5)中中和2～5 min。将膜封入加有Color substrate solution (10 ml detection buffer 中加入200 μl NBT/BCIP 储存液)的塑料袋中，避光显色，双蒸水浸泡5 min终止显色反应。拍照。
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2 结果
以等量癌旁正常肝组织DNA为模板，分管以不同配对引物分别PCR扩增MTS1基因的第二外显子和CDK4基因。产物经20 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明每对引物获得的扩增产物大小与文献〔1，2〕报道一致。PCR产物经过Southern blot分析证明PCR 产物确实为MTS1第二外显子扩增产物。
图1 MTS1第二外显子PCR产物琼脂糖电泳和Southern blot
上图： MTS1第二外显子PCR产物电泳图 3和6为纯合性缺失恶性肿瘤标本，其他为未出现纯合性缺失标本；上排为p16第二外显子PCR产物，下排为CDK4 PCR产物；
, http://www.100md.com 下图： p16 PCR产物的Southern blot
3 讨论
MTS1基因因其具有富含GC的GpG岛，模板DNA开链是否完全是PCR反应成功的首要条件，所以，我们通过反复摸索认为为了获得最佳反应结果，包括DNA模板在内的PCR反应系统 (Taq酶除外)必须先充分高温变性，然后冰上淬冷，使模板链充分打开；同时，为阻止变性的DNA单链形成空间局部二级结构，在反应系统中加入了DMSO(二甲基亚砜)，开始时加入的DMSO浓度为100 g.L-1，但DMSO对Taq抑制作用导致 PCR的扩增效率不高，当DMSO浓度降低到50 g.L-1时，在琼脂糖电泳上获得了清晰而特异的条带。
对于一个成功的PCR，不仅要获得有效的扩增效果，同时要保证PCR的特异性，而PCR的特异性一是由引物设计的特异性决定，二是与PCR反应的退火温度密切相关。由于引物的设计参照已发表的MTS1序列，所以，引物的设计是可靠的。一般来说，退火温度越高，PCR的特异性也就越高，但是同时PCR的扩增效率也就越低。我们通过摸索，发现60℃是MTS1基因的最适退火温度。如果按照常规的55℃，就会有数条非特异性的条带出现。由于反应体系中加入了DMSO，为了补偿DMSO对Taq酶的抑制作用，加大了Taq酶的用量，每个反应体系中加入3U Taq酶。CDK4基因作为“看家基因”是一个理想的参照，CDK4基因由于不是高GC含量的序列，所以它对扩增条件要求不高。不少文献将CDK4的引物加入到MTS基因的扩增体系中作为内参照同时又可以简化操作。但是根据我们的经验，由于CDK4易于扩增，往往会与MTS1竞争PCR的原料，所以分管进行扩增。通过对以上PCR关键条件的摸索，获得了可靠、稳定、扩增效率高而且特异性扩增MTS基因的方法。 由于获得冷泉港实验室赠送的MTS1的cDNA克隆，我们制备了MTS1 基因的cDNA探针，对PCR产物进行了Southern blot鉴定，进一步证实了该PCR方法的可靠性与特异性。
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至今，我们实验室已应用这一PCR方法对原发性肝癌〔5〕和胃癌手术标本、肺癌胸水标本〔6〕、白血病血标本中MTS1第二外显子的纯合性缺失作出分析并获得可靠的结果，证明此方法可靠，可重复性好。
基金项目：安徽省教委重点科研基金课题(96JL-077)，安徽医科大学附属医院自然科学研究基金课题(9904)
作者简介：刘虎，男，25岁，硕士研究生
汪渊，男，41岁，教授，硕士生导师，通讯联系人
参考文献
1，Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science，1994；264：436～440
, 百拇医药
2，Serrano M, Hannon,GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cycling D/CDK4. Nature，1993；366：704～707
3，萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T 著.金冬雁，黎孟枫 译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1996：321～322
4，姜泊，张亚历，周殿元 主编.分子生物学常用试验方法.第1版，北京：人民军医出版社，1996：65～83
5，汪渊，刘虎，周青等.癌性胸水p16基因纯合性缺失检测的临床意义.癌症，2000；19(3)：253～255
6，桂淑玉，汪渊，刘虎等. p16基因纯合性缺失检测在癌性胸水诊断中的应用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1998；19(增刊)：37～38
7，汪惠园，夏瑞祥，汪 渊等.急性淋巴细胞白血病p16/MTS1基因缺失与临床预后关系的研究.中华血液病杂志，2000；21(2)：99
1999-11-23收稿，2000-01-13修回, http://www.100md.com
单位：刘虎 汪渊 周青(安徽医科大学分子生物学实验室，合肥 230032)；桂淑玉(安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，合肥 230022)
关键词：基因；抑制；肿瘤；外显子；聚合酶链反应
安徽医科大学学报000304 摘要 目的 摸索可靠、高效和特异的聚合酶链反应(PCR)条件，分析多肿瘤抑癌基因1(MTS1)第二外显子纯合性缺失。方法 对一系列PCR参数进行摸索同时设立对照，并对PCR产物进行Southern blot分析。结果 PCR产物是特异的MTS1第二外显子。结论 扩增MTS1第二外显子的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果。
中图分类号 R394.2
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)02-0173-03
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Establishment of PCR method to amplify specific
multiple tumor suppressor exon2
Liu Hu, Gui Shuyu, Wang Yuan et al
(Laboratory of Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish a reliable, productive and specific PCR to detect the homozygous deletion of multiple tumor suppressor (MTS1) gene exon2. Methods The PCR parameters to amplify MTS1 were optimized with normal control accompanied and the PCR products were corroborated by Southern blotting. Results The PCR products achieved are specific MTS1 exon2. Conclusion The PCR conditions to amplify MTS1 exon2 can produce reliable and specific results.
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MeSH genes, suppressor, tumor; exons; polymerase chain reaction
多肿瘤抑癌基因1(MTS1，p16/CDKN2)表达产物p16蛋白是近来发现的一种直接参与细胞周期调控的蛋白。研究表明MTS1基因的失活与诸多肿瘤的发生与发展有着密切关系。MTS1基因的失活方式有多种，如纯合性缺失、杂合性缺失、突变、甲基化，而在这些失活方式中，纯合性缺失最常见，约占50%〔1〕。
MTS1基因位于人染色体9p21区〔1，2〕，含数个CpG岛〔3〕。由于其GC含量高的序列，具有开链慢、复性快以及容易形成局部空间二级结构的特点, 导致MTS1第二外显子的扩增对PCR反应条件要求较高。因此有必要建立可靠、特异的MTS1第二外显子扩增方法,为进一步研究其在恶性肿瘤细胞中的分子生物学行为奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源 经病理确诊的实体瘤及癌旁正常组织、非实体瘤、正常血液标本均取自安徽医科大学第一附属医院, -80℃保存备检。
1.2 主要试剂和仪器 引物由美国GIBCO BRL公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR 缓冲液等购自华美生物工程公司；Dig DNA Labeling and Detection Kit (Cat No 1093657) 购自Boehringer Mannheim公司； p16 cDNA 重组克隆〔2〕 由美国冷泉港实验室David Beach 博士惠赠；其他试剂均为国产分析纯；Hema 480 基因扩增仪为珠海黑马公司产品。
1.3 实体瘤组织和白血病细胞DNA的制备 实体瘤取手术癌组织0.5 g，加入1 ml DNA 提取液 (100 mmol.L-1 NaCl, 1 mmol.L-1 EDTA，5 g.L-1 SDS, 50 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.0), 在冰上用玻璃匀浆器制备匀浆。白血病的抗凝血用低渗溶血法获取白细胞。在上述细胞悬液中加入50 μl蛋白酶K(2 g. L-1,37℃ 温育4～5 h)，酚/氯仿抽提，醋酸钠/乙醇沉淀，1×TE溶解，分光光度计定量，-80℃保存待测〔3，4〕。1.4 MTS1第二外显子的PCR分析 根据已发表的MTS1序列〔1，2〕，参照Kamb等报道设计引物。MTS1第二外显子：3′端引物(GW-Ⅳ-1Ⅰ)：5′ AGC TTT GGA AGC TCT CAG， 5′端引物(GW-Ⅳ-1G)：5′ TGG CTC TGA CCA TTC TGT; 并以CDK4作为参照，3′端引物(GW-Ⅳ-1K)：5′ GGA GGT CGG TAC CAG AGT G，5′端引物(GW-Ⅳ-1J): 5′ CAT GTA GAC CAG GAC AGG。在50 ng标本DNA模板中分别加入PCR反应液(10 mmol.L-1 Tris, 50 mmol.L-1 KCl, 2 mmol.L-1 MgCl2, 0.01 g.L-1 Gelatin, 200 mmol.L-1 dNTPs,50 g.L-1 DMSO 和0.5 mmol.L-1引物)，Hema PCR自动循环仪中，97℃预变性5 min，冰上淬冷，加入用1×PCR缓冲液溶解的Taq酶3U，95℃ 1 min, 3步PCR,95℃ 1 min, 60℃ 1 min,72℃ 1 min,共35个循环，72℃ 5 min, 4℃保温。取8 μl PCR产物进行20 g.L-1琼脂糖电泳，以CDK4出现特异条带且未出现特异性MTS1 第一、二外显子和MTS2第二外显子条带为相应的纯合性缺失。
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1.5 MTS1 cDNA探针的制作 挑取MTS1 cDNA重组质粒的阳性克隆，在3 ml LB/ampicillin培养基中小量培养，当OD600到达0.4时，吸取100 μl 菌液，加入200 ml LB/ampicillin培养基中培养过夜，用QIAGEN过柱的方法提取质粒，定量，EcoR I/Sal I 酶切，用电洗脱法分离、纯化插入片断〔3，4〕， 酚/氯仿抽提3遍，醋酸钠/乙醇沉淀，双蒸水溶解，定量，用15 μl 总量为1 μg 的插入片断进行地高辛标记，加入2 μl dNTP/Dig-dUTP混合液，2 μl六聚核苷酸混合液，1 μl Klenow 酶(2 U.L-1)，37℃水浴过夜，加入2 μl 0.2 mol.L-1 EDTA终止反应。
1.6 PCR产物的鉴定 PCR 产物进行20 g.L-1琼脂糖电泳，电泳结束后拍照，在变性液( NaOH, NaCl) 中浸泡45 min, 中和液中浸泡30 min至pH值接近中性，进行毛细管法转移DNA至硝酸纤维素薄膜上，NC膜经过80℃干烤交联后，即可放入加有甲醛预杂交液的塑料袋中(10 ml/100 cm2)，封口机封口，42℃水浴振摇30 min，Dig标记探针煮沸变性5 min(5～25 μg.L-1)，冰上淬冷。将探针加入到预温到42℃的杂交液中。倾去预杂交液，将加有探针的杂交液加入到塑料袋中，小心赶去气泡，封口。42℃水浴振摇过夜。杂交结束后，将NC膜在2×SSC和1 g.L-1 SDS中洗涤2次，每次5 min。然后，在0.1×SSC、1 g.L-1 SDS中68℃水浴振摇洗涤2次，每次15 min。在Washing Buffer(马来酸缓冲液，含Tween 20 3%，体积分数)中洗涤1～5 min。在1×Blocking Solution 中浸泡30 min，用1×Blocking Solution 1∶105稀释anti-Dig-AP conjugate。将膜在抗体溶液中孵育30 min。用Washing Buffer 洗涤2次，每次15 min。在detection buffer(0.1 mol.L-1 Tris-HCl,0.1 mol.L-1 NaCl,50 mmol.L-1 MgCl2,pH 9.5)中中和2～5 min。将膜封入加有Color substrate solution (10 ml detection buffer 中加入200 μl NBT/BCIP 储存液)的塑料袋中，避光显色，双蒸水浸泡5 min终止显色反应。拍照。
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2 结果
以等量癌旁正常肝组织DNA为模板，分管以不同配对引物分别PCR扩增MTS1基因的第二外显子和CDK4基因。产物经20 g.L-1琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明每对引物获得的扩增产物大小与文献〔1，2〕报道一致。PCR产物经过Southern blot分析证明PCR 产物确实为MTS1第二外显子扩增产物。
图1 MTS1第二外显子PCR产物琼脂糖电泳和Southern blot
上图： MTS1第二外显子PCR产物电泳图 3和6为纯合性缺失恶性肿瘤标本，其他为未出现纯合性缺失标本；上排为p16第二外显子PCR产物，下排为CDK4 PCR产物；
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3 讨论
MTS1基因因其具有富含GC的GpG岛，模板DNA开链是否完全是PCR反应成功的首要条件，所以，我们通过反复摸索认为为了获得最佳反应结果，包括DNA模板在内的PCR反应系统 (Taq酶除外)必须先充分高温变性，然后冰上淬冷，使模板链充分打开；同时，为阻止变性的DNA单链形成空间局部二级结构，在反应系统中加入了DMSO(二甲基亚砜)，开始时加入的DMSO浓度为100 g.L-1，但DMSO对Taq抑制作用导致 PCR的扩增效率不高，当DMSO浓度降低到50 g.L-1时，在琼脂糖电泳上获得了清晰而特异的条带。
对于一个成功的PCR，不仅要获得有效的扩增效果，同时要保证PCR的特异性，而PCR的特异性一是由引物设计的特异性决定，二是与PCR反应的退火温度密切相关。由于引物的设计参照已发表的MTS1序列，所以，引物的设计是可靠的。一般来说，退火温度越高，PCR的特异性也就越高，但是同时PCR的扩增效率也就越低。我们通过摸索，发现60℃是MTS1基因的最适退火温度。如果按照常规的55℃，就会有数条非特异性的条带出现。由于反应体系中加入了DMSO，为了补偿DMSO对Taq酶的抑制作用，加大了Taq酶的用量，每个反应体系中加入3U Taq酶。CDK4基因作为“看家基因”是一个理想的参照，CDK4基因由于不是高GC含量的序列，所以它对扩增条件要求不高。不少文献将CDK4的引物加入到MTS基因的扩增体系中作为内参照同时又可以简化操作。但是根据我们的经验，由于CDK4易于扩增，往往会与MTS1竞争PCR的原料，所以分管进行扩增。通过对以上PCR关键条件的摸索，获得了可靠、稳定、扩增效率高而且特异性扩增MTS基因的方法。 由于获得冷泉港实验室赠送的MTS1的cDNA克隆，我们制备了MTS1 基因的cDNA探针，对PCR产物进行了Southern blot鉴定，进一步证实了该PCR方法的可靠性与特异性。
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至今，我们实验室已应用这一PCR方法对原发性肝癌〔5〕和胃癌手术标本、肺癌胸水标本〔6〕、白血病血标本中MTS1第二外显子的纯合性缺失作出分析并获得可靠的结果，证明此方法可靠，可重复性好。
基金项目：安徽省教委重点科研基金课题(96JL-077)，安徽医科大学附属医院自然科学研究基金课题(9904)
作者简介：刘虎，男，25岁，硕士研究生
汪渊，男，41岁，教授，硕士生导师，通讯联系人
参考文献
1，Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science，1994；264：436～440
, 百拇医药
2，Serrano M, Hannon,GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cycling D/CDK4. Nature，1993；366：704～707
3，萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T 著.金冬雁，黎孟枫 译.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社，1996：321～322
4，姜泊，张亚历，周殿元 主编.分子生物学常用试验方法.第1版，北京：人民军医出版社，1996：65～83
5，汪渊，刘虎，周青等.癌性胸水p16基因纯合性缺失检测的临床意义.癌症，2000；19(3)：253～255
6，桂淑玉，汪渊，刘虎等. p16基因纯合性缺失检测在癌性胸水诊断中的应用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1998；19(增刊)：37～38
7，汪惠园，夏瑞祥，汪 渊等.急性淋巴细胞白血病p16/MTS1基因缺失与临床预后关系的研究.中华血液病杂志，2000；21(2)：99
1999-11-23收稿，2000-01-13修回, http://www.100md.com