天南星类中药材的PAGE鉴别
作者：姚明全 陈振江
单位：湖北省荆州市第一人民医院 434000
关键词：天南星；异叶天南星 虎掌；PAGE鉴别
摘要 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳
摘要 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)技术，对天南星类中药材进行鉴别分析结果表明：三种天南星药材样品的PAGE图谱完全不同，可作为天南星类中药材鉴别的一种有效方法。
中国图书分类号 282.5
Abstract:
Polyacrylamide Gel Electrophoresis [PAGE] was used to determine the traditional Chinese medicinal materials of three kinds Arsaema consangumeum Schott.Results Showed that their PAGE bands were always quite distinct,which can be used to assess their quatity and distinguish them from confusable varieties.
, 百拇医药
Key words:Arisaema consangumeum Schott.Arisaema heterophyllum Bi.
Pinellia peclatisecta Schott.PAGE identification.
天南星主要用于祛风定惊，散结化痰。外用可治疗疮疡肿毒、蛇虫咬伤。近年来临床上用于治疗宫颈癌，有很好的疗效。因天南星药材亲缘关系相近，性状类别相似，用常规的性状显微鉴别方法很难鉴别分析。研究表明，天南星药理作用的主要有效成分含有蛋白质，故可应用PAGE技术对其进行鉴别[1][2]。现报道如下。
1 实验材料与仪器
天南星(Arisaema Consanguineum Schott)样品Ⅰ、异叶天南星(Arisaema heterophyllum Bi)样品Ⅱ、虎掌(掌叶半夏)(Pinellia peclatisecta Schott)样品Ⅲ，以上样品均为鲜品，由湖北中医学院药学系鉴定教研室鉴定并提供。
, 百拇医药
DYY-Ⅲ4型双稳电泳仪、DYY-Ⅲ28型垂直板型电泳槽(北京六一仪器厂)。
2 试剂的配制与凝胶的制备
2.1 试剂配制
A：36.6g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，48ml，1mol/L的Hcl加水到1000ml;B：5.98Tris,48ml,1molHcl加水到100ml；C：30g丙烯酰胺(Acr)，0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)加水到100ml过滤后使用；D：10gAcr,2.5gBis加水到100ml过滤后使用；E：4mg核黄素加水到100ml；F：40%(W/V)的蔗糖溶液；G：0.56g的过硫酸铵加水到100ml(AP溶液)；H：6gTris,28.8g甘氨酸加水到1000ml，使用时稀释10倍，此为电极缓冲液。
2.2 凝胶的制备及电泳槽的安装[3]
, 百拇医药
2.2.1 本实验采用垂直板电泳槽 凝胶模子是由两块玻璃装入一个用硅酮橡胶做成的夹套内构成，玻璃板厚2mm，两玻璃板之间由夹套隔开厚约1.5mm，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。安装电泳槽时，玻璃板先用热的去污剂刷洗或洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥。勿用手指接触洗净的玻璃板面，将两块玻璃板装入橡胶夹套内，然后垂直地装入两个半槽之间，用螺丝将两个半槽固定在一起，注意在上螺丝时，要按照一定的顺序一个个的逐步柠紧，均匀用力。电泳槽装好后将熔化的1.5%的琼脂注入背面槽内的小池中，使在胶池的下部凝结成约0.5cm厚的琼脂层，备用。
02.2.2 分离胶的制备
将试剂A∶C∶水∶G按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml胶液0.6μl的比例加入加速剂四甲基乙二胺(TEMED)、混合后立即装入槽中，胶液加到距玻璃板顶部3cm处(注意排除可能存在的气泡)，上面再加约4mm厚的水层以隔绝空气并使胶面平坦。
, 百拇医药
2.2.3 浓缩胶的制备
将试剂B∶D∶E∶F按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml胶液1.5μl的比例加入TEMED。然后再加到吸去表面水层的分离胶上部，高约3cm，并放好样品槽模板(俗称梳子)，光照聚合，聚合约需30～40分钟，胶聚合后，小心取出“梳子”，加入上槽电极缓冲液备用。
3 样品液的制备
精确称取样品Ⅰ2g加0.9%的生理盐水4ml研磨成浆后置离心管中离心15分钟(3000rpm/min)，取上清液2ml加入4ml丙酮沉淀离心，倾出上清液，将沉淀加2ml蒸馏水溶解后装入半透膜袋中透析48小时(其间更换蒸馏水数次)，即得样品液Ⅰ，置冰箱中备用。用同样的方法处理Ⅱ、Ⅲ号样品。
4 点样
用微量注射器分别吸取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号样品液各25μl注入到样品槽内的电极缓冲液与浓缩胶之间界面上。并在上槽缓冲液中加入1～3滴溴酚蓝指示剂示踪。
, 百拇医药
5 电泳
加样后，向两槽内注入电极缓冲液，接通电源立即电泳。前后两槽分别接入电源的负、正极上，开始电流调节为9mA,当样品进入分离胶后，加大电流至12mA，当指示剂到达凝胶未端约1cm时，停止电泳。
6 染色
取出胶板后，放入0.2%的考马斯亮蓝(R250)染色液中，在36°C下染色1小时，用蒸馏水冲去凝胶表面附着的染料，再用含20%甲醇和7%醋酸的脱色液脱色，经常更换脱色液，直至背景清晰为止。
7 结果与讨论
电泳图谱如图1所示。由图谱可知：三种天南星的PAGE谱带完全不同，从而将它们鉴别区分。
, 百拇医药
天南星的PAGE图谱
A.天南星 B.异叶天南星
C.虎掌(掌叶半夏) D.天南星(干品)
PAGE技术操作简便，重现性良好，凝胶本身有较强的机械强度，在本实验中我们曾做过数次重复，所得电泳图谱稳定可靠，此外，采用垂直板型PAGE，操作及制胶板方便，并可在一块胶上(120mm×100mm×1.5mm)同时进行十几种样品的PAGE分析，且样品和试剂用量少，符合多快好省的要求，特别适用于含有蛋白质成分的各类中药材(如：果实种子类、根皮类及动物类中药)的质量分析及真伪鉴别。
作者简介：湖北中医学院 430061
参考文献
1 陈振江.高效电泳技术及其在药剂学中的应用中草药，1994，16(9)：52
2 陈振江.中药青葙子、土鳖虫的等电聚焦电泳的研究.中草药，1996，27(10)：593
3 袁晓华等.植物生理生化实验.北京：高等教育出版社，1983.64
收稿日期：1999-01-27, 百拇医药
单位：湖北省荆州市第一人民医院 434000
关键词：天南星；异叶天南星 虎掌；PAGE鉴别
摘要 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳
摘要 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)技术，对天南星类中药材进行鉴别分析结果表明：三种天南星药材样品的PAGE图谱完全不同，可作为天南星类中药材鉴别的一种有效方法。
中国图书分类号 282.5
Abstract:
Polyacrylamide Gel Electrophoresis [PAGE] was used to determine the traditional Chinese medicinal materials of three kinds Arsaema consangumeum Schott.Results Showed that their PAGE bands were always quite distinct,which can be used to assess their quatity and distinguish them from confusable varieties.
, 百拇医药
Key words:Arisaema consangumeum Schott.Arisaema heterophyllum Bi.
Pinellia peclatisecta Schott.PAGE identification.
天南星主要用于祛风定惊，散结化痰。外用可治疗疮疡肿毒、蛇虫咬伤。近年来临床上用于治疗宫颈癌，有很好的疗效。因天南星药材亲缘关系相近，性状类别相似，用常规的性状显微鉴别方法很难鉴别分析。研究表明，天南星药理作用的主要有效成分含有蛋白质，故可应用PAGE技术对其进行鉴别[1][2]。现报道如下。
1 实验材料与仪器
天南星(Arisaema Consanguineum Schott)样品Ⅰ、异叶天南星(Arisaema heterophyllum Bi)样品Ⅱ、虎掌(掌叶半夏)(Pinellia peclatisecta Schott)样品Ⅲ，以上样品均为鲜品，由湖北中医学院药学系鉴定教研室鉴定并提供。
, 百拇医药
DYY-Ⅲ4型双稳电泳仪、DYY-Ⅲ28型垂直板型电泳槽(北京六一仪器厂)。
2 试剂的配制与凝胶的制备
2.1 试剂配制
A：36.6g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，48ml，1mol/L的Hcl加水到1000ml;B：5.98Tris,48ml,1molHcl加水到100ml；C：30g丙烯酰胺(Acr)，0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)加水到100ml过滤后使用；D：10gAcr,2.5gBis加水到100ml过滤后使用；E：4mg核黄素加水到100ml；F：40%(W/V)的蔗糖溶液；G：0.56g的过硫酸铵加水到100ml(AP溶液)；H：6gTris,28.8g甘氨酸加水到1000ml，使用时稀释10倍，此为电极缓冲液。
2.2 凝胶的制备及电泳槽的安装[3]
, 百拇医药
2.2.1 本实验采用垂直板电泳槽 凝胶模子是由两块玻璃装入一个用硅酮橡胶做成的夹套内构成，玻璃板厚2mm，两玻璃板之间由夹套隔开厚约1.5mm，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。安装电泳槽时，玻璃板先用热的去污剂刷洗或洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥。勿用手指接触洗净的玻璃板面，将两块玻璃板装入橡胶夹套内，然后垂直地装入两个半槽之间，用螺丝将两个半槽固定在一起，注意在上螺丝时，要按照一定的顺序一个个的逐步柠紧，均匀用力。电泳槽装好后将熔化的1.5%的琼脂注入背面槽内的小池中，使在胶池的下部凝结成约0.5cm厚的琼脂层，备用。
02.2.2 分离胶的制备
将试剂A∶C∶水∶G按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml胶液0.6μl的比例加入加速剂四甲基乙二胺(TEMED)、混合后立即装入槽中，胶液加到距玻璃板顶部3cm处(注意排除可能存在的气泡)，上面再加约4mm厚的水层以隔绝空气并使胶面平坦。
, 百拇医药
2.2.3 浓缩胶的制备
将试剂B∶D∶E∶F按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml胶液1.5μl的比例加入TEMED。然后再加到吸去表面水层的分离胶上部，高约3cm，并放好样品槽模板(俗称梳子)，光照聚合，聚合约需30～40分钟，胶聚合后，小心取出“梳子”，加入上槽电极缓冲液备用。
3 样品液的制备
精确称取样品Ⅰ2g加0.9%的生理盐水4ml研磨成浆后置离心管中离心15分钟(3000rpm/min)，取上清液2ml加入4ml丙酮沉淀离心，倾出上清液，将沉淀加2ml蒸馏水溶解后装入半透膜袋中透析48小时(其间更换蒸馏水数次)，即得样品液Ⅰ，置冰箱中备用。用同样的方法处理Ⅱ、Ⅲ号样品。
4 点样
用微量注射器分别吸取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号样品液各25μl注入到样品槽内的电极缓冲液与浓缩胶之间界面上。并在上槽缓冲液中加入1～3滴溴酚蓝指示剂示踪。
, 百拇医药
5 电泳
加样后，向两槽内注入电极缓冲液，接通电源立即电泳。前后两槽分别接入电源的负、正极上，开始电流调节为9mA,当样品进入分离胶后，加大电流至12mA，当指示剂到达凝胶未端约1cm时，停止电泳。
6 染色
取出胶板后，放入0.2%的考马斯亮蓝(R250)染色液中，在36°C下染色1小时，用蒸馏水冲去凝胶表面附着的染料，再用含20%甲醇和7%醋酸的脱色液脱色，经常更换脱色液，直至背景清晰为止。
7 结果与讨论
电泳图谱如图1所示。由图谱可知：三种天南星的PAGE谱带完全不同，从而将它们鉴别区分。
, 百拇医药
天南星的PAGE图谱
A.天南星 B.异叶天南星
C.虎掌(掌叶半夏) D.天南星(干品)
PAGE技术操作简便，重现性良好，凝胶本身有较强的机械强度，在本实验中我们曾做过数次重复，所得电泳图谱稳定可靠，此外，采用垂直板型PAGE，操作及制胶板方便，并可在一块胶上(120mm×100mm×1.5mm)同时进行十几种样品的PAGE分析，且样品和试剂用量少，符合多快好省的要求，特别适用于含有蛋白质成分的各类中药材(如：果实种子类、根皮类及动物类中药)的质量分析及真伪鉴别。
作者简介：湖北中医学院 430061
参考文献
1 陈振江.高效电泳技术及其在药剂学中的应用中草药，1994，16(9)：52
2 陈振江.中药青葙子、土鳖虫的等电聚焦电泳的研究.中草药，1996，27(10)：593
3 袁晓华等.植物生理生化实验.北京：高等教育出版社，1983.64
收稿日期：1999-01-27, 百拇医药
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