肾阴虚型糖尿病动物模型的研制
作者：吴文莉 马 威 薛 莎 刘 毅
单位：武汉市中西医结合医院 430022
关键词：糖尿病；肾阴虚；动物模型；链脲佐菌素；甲状腺素
湖北中医学学报990313 指导：管竞环
摘要 本实验是“中医药现代化研究”课题的前期动物造模实验之一。通过链脲佐菌素、甲状腺素两种药物对Wistar种大白鼠进行实验，动物出现大便干结、反应迟钝、毛无光泽、多饮、多食、多尿，体重明显下降等肾阴虚证候，同时尿糖定性强阳性，血糖均在10.0～17.0mmol/L，符合糖尿病模型标准，成功地制作了肾阴虚型糖尿病动物模型。
中国图书分类号 R587.1
采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射，引起动物糖尿病症状；然后用甲状腺素(T4)行皮下注射，加重动物肾阴虚表现。或用T4皮下注射先引起动物肾阴虚，再加用STZ注射，诱发动物糖尿病。或单用STZ注射诱发糖尿病。这三种给药方式，均使造模动物表现出肾阴虚型糖尿病的证候。现将动物模型的制作方法、生化指标测试结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 动物与试剂
1.1.1 动物
Wistar种雌性大白鼠，体重200～250g，由同济医科大学动物中心提供。购入后先用市售固体饲料喂养3～5天，待适应环境、体重开始增加时进行实验。动物随机分成四组：
A组：正常对照组；
B组：STZ造模组；
C组：先用STZ，后加用T4造模组；
D组：先用T4，后加用STZ造模组。
对照组和模型组均饮用自来水。
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1.1.2 试剂
(1)链脲佐菌素注射液(Streptozocin STZ)：Sigma公司产品，批号：HO250。临用前用pH4.2枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解，配成2%的溶液，按65?mg/kgbw的剂量一次性腹腔注射[1、2、3、4]；
(2)甲状腺素(T4)：上海长城生化制药厂产品，批号：960102。造模时T4用量为：0.2?mg/kgbw/d，给药方式为皮下注射，用药天数7天[5]。
(3)pH4.2枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液：临用前配制。
(4)胰岛素注射液：徐州生物化学制药厂产品，批号：961216。当造模大白鼠的血糖(空腹)超过16.8mmol/L时，连续‘两天皮下注射胰岛素8个单位[6]。
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1.2 实验方法
1.2.1 观察项目
体重、食量、饮水量、尿量、体温、神态体毛、活动度、大便等。
1.2.2 尿糖及尿常规检测
动物用代谢笼收集尿液作尿糖定性、尿蛋白、酮体、潜血等常规检查。
1.2.3 血生化指标测定
造模在给药后的第3天开始，每隔3天剪大鼠鼠尾取血测空腹8小时后的血糖值，仪器为美国Lifescan公司生产的One Touch血糖仪。并在给药后的第14天取血测肝、肾功能。
2 结果
2.1 肾阴虚表现
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模型组大白鼠随着给药日数的增加而日益消瘦，生长发育远不如正常对照组。三组造模组体温较正常组平均升高1.2°C，体毛无光泽，活动频度增加但反应迟钝，大便干结、色黑，饮水量、食量、尿量均高于正常组2～3倍。
2.2 体重变化
正常组大鼠开始平均体重210g，饲养20天后平均体重增加30?g。三组造模组大鼠随时间的延长，平均体重下降32.5g，与正常组比较，体重变化存在统计学差异，三组之间的体重变化无统计学差异。
2.3 动物死亡情况
B组大鼠在STZ腹腔注射的第5～7天有3只死亡；C组大鼠在STZ注射后的第6天有2只死亡，加用T4注射后的第3天有3只死亡；D组大鼠在加用STZ注射后的第2天有1只死亡。共有9只死亡，死亡率为26%。
, http://www.100md.com 死亡大鼠均行心脏采血，检查血糖、肝功能和肾功能，结果均高于正常值，说明大鼠死于高血糖诱发的肝、肾功能衰竭。
2.4 血糖变化
三组造模大鼠均在STZ腹腔注射后的第3天开始，每间隔3～4天，监测空腹8小时后血糖，结果显示三组大鼠血糖均高于正常组(P<0.01)。三组之间血糖值比较无统计学差异。(见附表)
附表 各组大鼠血糖变化状况(mmol/L，x±SD)
A组
B组
C组
D组
造模前
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3.0±0.21
2.8±0.18
2.76±1.01
2.90±0.62
造模后
3.05±0.20
12.2±2.28
14.5±2.52
14.6±2.60
2.5 尿糖及尿常规检查变化
四组大鼠均用代谢笼收集24小时尿，测尿糖及尿常规。造模大鼠在注射STZ后24小时开始监测尿糖及常规检查。结果三组造模大鼠均表现为尿糖定性强阳性，无论血糖波动情况如何，尿糖始终表现为强阳性。50%的大鼠尿蛋白定性为弱阳性。
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3 讨论
用甲状腺素造肾阴虚模型早在七十年代就有报道[7]。随着中医药理论研究的深入，迫切需要研制出能反映人类疾病症状，且能体现中医证型的病证结合的动物模型。
笔者用三种方式给大白鼠注射STZ和T415天，发现三组造模大鼠均有消瘦、生长发育缓慢，体温升高、毛无光泽，活动频度增加、反应迟钝，多饮、多食、多尿，大便干结等肾阴虚证表现；同时，造模大白鼠的血糖值均在10.0～17.0mmol/L之间，尿糖定性强阳性，符合糖尿病动物模型的标准。可以认为，三种造模方式均可造模肾阴虚型糖尿病的病证结合模型。
链脲佐菌素是从无色链霉菌属中分离出来的一个广谱抗菌素，为无色固体，易溶于水。STZ能选择性损伤胰腺β-细胞，而后引起这些细胞坏死。实验动物在用药后表现出人类典型的糖尿病症状，如高血糖、尿糖，多饮、多食、多尿，体重下降，酮尿及酸中毒，还可引起部分动物肾功能损害而出现蛋白尿[8]。
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糖尿病的症状符合中医的消渴证特点，即多饮、多食、多尿和体重下降。中医根据“三多”症状，将消渴证分为上、中、下三消。病变脏腑在肺、胃、肾，而以肾为关键。肺主治节，为水之上源，如肺燥阴虚，津液失于敷布，则胃失濡润，肾失滋养；胃热偏盛，则可灼伤肺津，耗损肾阴。而肾阴不足，阴虚火旺，亦可上炎肺、胃，终至肺燥、胃热、肾阴虚同时存在[9]。本实验最后观察的造模大白鼠，尿频量多、混浊如脂膏，正处于肾阴亏虚阶段。
根据上述原理，可以认为：STZ诱发的大白鼠糖尿病模型，同时也是肾阴虚型糖尿病模型。如再加用甲状腺素，以加重肾阴虚表现，适当缩短造模天数，则更为理想。本模型符合中医理论，是一种新型的病证结合动物模型。
参考文献
1 胡忠华，刘宗汉.实验性糖尿病大鼠性激素水平的变化研究.衡阳医学院学报，1995，23(1)：21～23.
, http://www.100md.com
2 Tong YC. et al. Dark-cycle video surveillance of sexual performances of normal and diabetic rats.Urol Int.1996,56(4):207～210.
3 EI Midaoui A. et al. Effect of Physical training on mitochondrial function in skeletai muscle of normal and diabetic rats.Metabolism 1996,45(7):810～814.
4 Karkanias GB.et al.Deficits in reproductive behavior in diabtic female rats are due to hypoinsulinemia rather than hyperglycemia.Horm Behav.1997,32(1):19～21.
5 陈小野主编.实用中医证候动物模型学.中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社：117～138
6 汪谦主编.现代医学实验方法.北京：人民卫生出版社，927～928
7 上海中医学院正常人体学教研组.阳虚、阴虚造型以及某些助阳药和滋阴药作用的初步研究.新医药学杂志，1997,(9):33～36
8 朱愉，多秀瀛主编.实验动物的疾病模型.天津科技翻译出版公司出版，255～256.
9 张伯臾主编.中医内科学.上海科学技术出版社，250～251, 百拇医药
单位：武汉市中西医结合医院 430022
关键词：糖尿病；肾阴虚；动物模型；链脲佐菌素；甲状腺素
湖北中医学学报990313 指导：管竞环
摘要 本实验是“中医药现代化研究”课题的前期动物造模实验之一。通过链脲佐菌素、甲状腺素两种药物对Wistar种大白鼠进行实验，动物出现大便干结、反应迟钝、毛无光泽、多饮、多食、多尿，体重明显下降等肾阴虚证候，同时尿糖定性强阳性，血糖均在10.0～17.0mmol/L，符合糖尿病模型标准，成功地制作了肾阴虚型糖尿病动物模型。
中国图书分类号 R587.1
采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射，引起动物糖尿病症状；然后用甲状腺素(T4)行皮下注射，加重动物肾阴虚表现。或用T4皮下注射先引起动物肾阴虚，再加用STZ注射，诱发动物糖尿病。或单用STZ注射诱发糖尿病。这三种给药方式，均使造模动物表现出肾阴虚型糖尿病的证候。现将动物模型的制作方法、生化指标测试结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 动物与试剂
1.1.1 动物
Wistar种雌性大白鼠，体重200～250g，由同济医科大学动物中心提供。购入后先用市售固体饲料喂养3～5天，待适应环境、体重开始增加时进行实验。动物随机分成四组：
A组：正常对照组；
B组：STZ造模组；
C组：先用STZ，后加用T4造模组；
D组：先用T4，后加用STZ造模组。
对照组和模型组均饮用自来水。
, 百拇医药
1.1.2 试剂
(1)链脲佐菌素注射液(Streptozocin STZ)：Sigma公司产品，批号：HO250。临用前用pH4.2枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解，配成2%的溶液，按65?mg/kgbw的剂量一次性腹腔注射[1、2、3、4]；
(2)甲状腺素(T4)：上海长城生化制药厂产品，批号：960102。造模时T4用量为：0.2?mg/kgbw/d，给药方式为皮下注射，用药天数7天[5]。
(3)pH4.2枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液：临用前配制。
(4)胰岛素注射液：徐州生物化学制药厂产品，批号：961216。当造模大白鼠的血糖(空腹)超过16.8mmol/L时，连续‘两天皮下注射胰岛素8个单位[6]。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 观察项目
体重、食量、饮水量、尿量、体温、神态体毛、活动度、大便等。
1.2.2 尿糖及尿常规检测
动物用代谢笼收集尿液作尿糖定性、尿蛋白、酮体、潜血等常规检查。
1.2.3 血生化指标测定
造模在给药后的第3天开始，每隔3天剪大鼠鼠尾取血测空腹8小时后的血糖值，仪器为美国Lifescan公司生产的One Touch血糖仪。并在给药后的第14天取血测肝、肾功能。
2 结果
2.1 肾阴虚表现
, 百拇医药
模型组大白鼠随着给药日数的增加而日益消瘦，生长发育远不如正常对照组。三组造模组体温较正常组平均升高1.2°C，体毛无光泽，活动频度增加但反应迟钝，大便干结、色黑，饮水量、食量、尿量均高于正常组2～3倍。
2.2 体重变化
正常组大鼠开始平均体重210g，饲养20天后平均体重增加30?g。三组造模组大鼠随时间的延长，平均体重下降32.5g，与正常组比较，体重变化存在统计学差异，三组之间的体重变化无统计学差异。
2.3 动物死亡情况
B组大鼠在STZ腹腔注射的第5～7天有3只死亡；C组大鼠在STZ注射后的第6天有2只死亡，加用T4注射后的第3天有3只死亡；D组大鼠在加用STZ注射后的第2天有1只死亡。共有9只死亡，死亡率为26%。
, http://www.100md.com 死亡大鼠均行心脏采血，检查血糖、肝功能和肾功能，结果均高于正常值，说明大鼠死于高血糖诱发的肝、肾功能衰竭。
2.4 血糖变化
三组造模大鼠均在STZ腹腔注射后的第3天开始，每间隔3～4天，监测空腹8小时后血糖，结果显示三组大鼠血糖均高于正常组(P<0.01)。三组之间血糖值比较无统计学差异。(见附表)
附表 各组大鼠血糖变化状况(mmol/L，x±SD)
A组
B组
C组
D组
造模前
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3.0±0.21
2.8±0.18
2.76±1.01
2.90±0.62
造模后
3.05±0.20
12.2±2.28
14.5±2.52
14.6±2.60
2.5 尿糖及尿常规检查变化
四组大鼠均用代谢笼收集24小时尿，测尿糖及尿常规。造模大鼠在注射STZ后24小时开始监测尿糖及常规检查。结果三组造模大鼠均表现为尿糖定性强阳性，无论血糖波动情况如何，尿糖始终表现为强阳性。50%的大鼠尿蛋白定性为弱阳性。
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3 讨论
用甲状腺素造肾阴虚模型早在七十年代就有报道[7]。随着中医药理论研究的深入，迫切需要研制出能反映人类疾病症状，且能体现中医证型的病证结合的动物模型。
笔者用三种方式给大白鼠注射STZ和T415天，发现三组造模大鼠均有消瘦、生长发育缓慢，体温升高、毛无光泽，活动频度增加、反应迟钝，多饮、多食、多尿，大便干结等肾阴虚证表现；同时，造模大白鼠的血糖值均在10.0～17.0mmol/L之间，尿糖定性强阳性，符合糖尿病动物模型的标准。可以认为，三种造模方式均可造模肾阴虚型糖尿病的病证结合模型。
链脲佐菌素是从无色链霉菌属中分离出来的一个广谱抗菌素，为无色固体，易溶于水。STZ能选择性损伤胰腺β-细胞，而后引起这些细胞坏死。实验动物在用药后表现出人类典型的糖尿病症状，如高血糖、尿糖，多饮、多食、多尿，体重下降，酮尿及酸中毒，还可引起部分动物肾功能损害而出现蛋白尿[8]。
, http://www.100md.com
糖尿病的症状符合中医的消渴证特点，即多饮、多食、多尿和体重下降。中医根据“三多”症状，将消渴证分为上、中、下三消。病变脏腑在肺、胃、肾，而以肾为关键。肺主治节，为水之上源，如肺燥阴虚，津液失于敷布，则胃失濡润，肾失滋养；胃热偏盛，则可灼伤肺津，耗损肾阴。而肾阴不足，阴虚火旺，亦可上炎肺、胃，终至肺燥、胃热、肾阴虚同时存在[9]。本实验最后观察的造模大白鼠，尿频量多、混浊如脂膏，正处于肾阴亏虚阶段。
根据上述原理，可以认为：STZ诱发的大白鼠糖尿病模型，同时也是肾阴虚型糖尿病模型。如再加用甲状腺素，以加重肾阴虚表现，适当缩短造模天数，则更为理想。本模型符合中医理论，是一种新型的病证结合动物模型。
参考文献
1 胡忠华，刘宗汉.实验性糖尿病大鼠性激素水平的变化研究.衡阳医学院学报，1995，23(1)：21～23.
, http://www.100md.com
2 Tong YC. et al. Dark-cycle video surveillance of sexual performances of normal and diabetic rats.Urol Int.1996,56(4):207～210.
3 EI Midaoui A. et al. Effect of Physical training on mitochondrial function in skeletai muscle of normal and diabetic rats.Metabolism 1996,45(7):810～814.
4 Karkanias GB.et al.Deficits in reproductive behavior in diabtic female rats are due to hypoinsulinemia rather than hyperglycemia.Horm Behav.1997,32(1):19～21.
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6 汪谦主编.现代医学实验方法.北京：人民卫生出版社，927～928
7 上海中医学院正常人体学教研组.阳虚、阴虚造型以及某些助阳药和滋阴药作用的初步研究.新医药学杂志，1997,(9):33～36
8 朱愉，多秀瀛主编.实验动物的疾病模型.天津科技翻译出版公司出版，255～256.
9 张伯臾主编.中医内科学.上海科学技术出版社，250～251, 百拇医药