免疫介导再障小鼠模型血清IL-2、TNF水平及中药复方对其的影响
作者：梁毅 鲁新华
单位：湖北中医学院 430061
关键词：再生障碍性贫；免疫介导；动物模型；中医药
湖北中医学院学报990311 指导 陈如泉
摘要 以免疫介导法复制小鼠再生障碍性贫血模型，并选用经验方“地甘口服液”及传统方“四物汤”为治疗药物，了解模型鼠血清IL-2及TNF水平，以及中药复方对其的影响。结果表明：免疫介导小鼠模型血清IL-2及TNF含量明显高于正常，而两种中药复方均可降低两种细胞因子的血清含量，且两种不同浓度的地甘口服液及四物汤三者之间并不存在差异。
中国图书分类号 R285.5
Cellular Factors Serum Content in ImmunologicallyMediated Aplastic Anemia in Mice and the Effects ofChinese Drugs Complex Prescription on Them
, 百拇医药
Liang Yi,etal.
(Hubei College of TCM.Wuhan 430061)
Abstract:we have used immunologically mediated method to imitate aplastic anemia in mice and chosen Di-gan Oral Liquid and Decoction of Four Ingredients to treat the mice.The cellular factors(IL-2,TNF) were detected and the effects of the Chinese medicine were observed.The result showed:the serum content of cellular factor in immunologically mediated aplastic anemia was higher than that of normal group (P<0.01).Both Chinese medicine can reduce the cellular factors content and the difference of three treated groups was smaller (P>0.05).
, 百拇医药
Key words:Aplastic anemia Immunological mediation Animal model
用免疫介导法处理小鼠不仅可以损害小鼠的造血干细胞，使有源于 CFU-S 阶段的造血生成能力缺陷，还可以使机体的免疫功能受损，出现造血抑制细胞和血浆CFU-GM抑制活性[1][2]。通过对实验小鼠两种细胞因子——白细胞介素-2(IL-2)及肿瘤坏死因子(TNF)的检测分析，可以了解免疫介导模型小鼠血清中两种细胞因子的水平，以及地甘口服液及红霖四物口服液对它们的影响。
1 资料与方法
1.1 动物 Balb/c小鼠60只，8～12周龄，体重16g～20g，雌雄不限，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。DBA/2小鼠，8～10周龄，雌雄不限，由中山医科大学实验中心提供。
, http://www.100md.com 1.2 模型动物的建立[3] 取DBA/2小鼠，断颈处死，95%酒精浸泡消毒5分钟后，无菌取出胸腺及颈、腋下、腹股沟等处的淋巴结，加RPMI-1640培养液，除去表面血污及粘附的结缔组织。再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，直到成糊状，再轻轻研磨用200目尼龙网过滤，使之成为单细胞悬液。计数后配成1×106/ml浓度，其胸腺细胞：淋巴结细胞为1∶2。取1滴苔盼蓝滴入玻片上鉴定细胞活性应在95%以上。Balb/c小鼠经X射线6.0Gy/3min亚致死剂量照射后1～4小时内，立即尾静脉输入上述细胞悬液，每只小鼠输入0.2ml。
1.3 药剂制备 地甘口服液由大剂量炙甘草、熟地黄为主组成，由湖北中医学院附属医院制剂室制备。经水煎、过滤、浓缩，分别配制成100%(每毫升含生药1g)及200%(每毫升含生药2g)药液分装成100ml瓶备用。红霖四物口服液由四川新斯顿制药有限责任公司提供(批准文号：22-3294-川卫药准字1996-011555号)。
, http://www.100md.com
1.4 分组及处理 实验动物随机分成五组，每组12只小鼠。分别为：(1)正常组，灌服蒸馏水0.5ml～0.6ml/只，2次/d，连续10天；(2)模型组，制模后处理同上；(3)地甘口服液Ⅰ组；(4)地甘口服液Ⅱ组。制模后分别灌服100%及200%浓度地甘口服液，每次0.5～0.6ml/只，2次/d，连续10天；(5)四物口服液组，制模后灌服四物口服液0.5ml～0.6ml/只，2次/d，连续10天。
分组处理后第11天～14天，模型组小鼠濒死时，定为取材时间。用毛细吸管从各组小鼠眼眶后静脉丛取血0.8ml～1ml，分离血清，-20°C保存。
1.5 主要试剂及仪器 TNF放射免疫测定药盒及IL-2放射免疫测定药盒，均由北京东亚免疫技术研究所提供，批号分别为980701和980629。J-2008G型自动γ-免疫计数仪，(上海262厂生产)。电子直线加速器(WDVE-6/100型，广州威达)。
, 百拇医药
1.6 实验方法 将小鼠血清置冷水中复融混匀，4°C 3000r/min离心5分钟，取上清液，然后分别按药盒说明方法操作。
1.7 统计学方法 数据均以均数±标准差(X±s)表示，分别采用t检验及F检验。
2 结果
2.1 免疫介导再生障碍性贫血小鼠血清TNF含量的变化及地甘口服液、红霖四物口服液对其的影响 见表1。
表1 各组小鼠血清TNF含量的变化(X±s) 组 别
n
TNF(ng/ml)
正 常 组
12
, http://www.100md.com
5.016±0.893
模 型 组
12
10.33±1.09*
地甘口服液Ⅰ组
12
7.625±1.371*△
地甘口服液Ⅱ组
12
8.025±1.672*△
红霖四物口服液组
, http://www.100md.com
12
7.806±1.379*△
*与正常组比较 P<0.01，△ 与模型组比较 P<0.01，治疗组之间比较(F检验) P>0.05。
2.2 免疫介导再生障碍性贫血小鼠血清IL-2含量的变化及地甘口服液、红霖四物口服液对其的影响 见表2。表2 各组小鼠血清IL-2含量的变化(X±s) 组 别
n
IL-2(ng/ml)
正 常 组
12
1.365±0.24
, 百拇医药
模 型 组
12
2.376+0.478*
地甘口服液Ⅰ组
12
1.77+0.249*△
地甘口服液Ⅱ组
12
1.903±0.257*△
红霖四物口服液组
12
, 百拇医药 1.808+0.214*△
*与正常组比较P<0.01，△ 与模型组比较 P<0.01，治疗组间比较 P>0.05。
3 讨论
根据姚军等的方法[3]，复制出免疫介导小鼠再生障碍性贫血模型，小鼠出现的症状体征、外周血及骨髓象变化特点与文献报告基本一致。在众多的造血负调控因子中，IL-2和TNF含量的异常升高[4][5]，一直被认为与人类免疫介导型再生障碍性贫血循环造血抑制活性的形成密切相关，表现出对CFU-GM的生成产生明显的抑制效应。本实验的结果显示模型小鼠血清中TNF、IL-2含量明显高于正常，表明其造血抑制活性的形成与这两种因子有密切的关系。
以补气补血中药组成的复方在治疗免疫介导型再生障碍性贫血小鼠过程中，表现出两细胞因子含量的下降，尽管与正常鼠比较存在差异，但较模型鼠已有大幅度减少，说明中药复方(地甘口服液、红霖四物口服液)对异常增高的造血负调控因子有拮抗作用，以减轻其对造血功能的抑制，这对于进一步研究中医药对再生障碍性贫血治疗的机理具有十分积极的作用。
, 百拇医药
基金项目：1997年湖北省科委资助课题
作者简介：湖北中医学院96级博士生
参考文献
1 潘景轩.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血粒单系祖细胞的研究.中华血液学杂志，1992，13(2)：78
2 陈俊.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血骨髓CFU-S的改变及机制探讨.中华血液学杂志，1991，12(6)：286
3 姚军.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志，1991，12(5)：229
4 Jie T,Bacigalupao A,Piaggio G,et al. In vitro response of T cells from aplastic anemia pantients to antilymphocyte globulin and phytohemagglutinin:colony-stimulating activity and lymphokine production.Exp Hematal 1991;19:312
5 连天顺，赵志平.再生障碍性贫血白细胞介素-2及其受体细胞的研究.中华血液学杂志，1990，11：21
收稿日期：1998-11-11, 百拇医药
单位：湖北中医学院 430061
关键词：再生障碍性贫；免疫介导；动物模型；中医药
湖北中医学院学报990311 指导 陈如泉
摘要 以免疫介导法复制小鼠再生障碍性贫血模型，并选用经验方“地甘口服液”及传统方“四物汤”为治疗药物，了解模型鼠血清IL-2及TNF水平，以及中药复方对其的影响。结果表明：免疫介导小鼠模型血清IL-2及TNF含量明显高于正常，而两种中药复方均可降低两种细胞因子的血清含量，且两种不同浓度的地甘口服液及四物汤三者之间并不存在差异。
中国图书分类号 R285.5
Cellular Factors Serum Content in ImmunologicallyMediated Aplastic Anemia in Mice and the Effects ofChinese Drugs Complex Prescription on Them
, 百拇医药
Liang Yi,etal.
(Hubei College of TCM.Wuhan 430061)
Abstract:we have used immunologically mediated method to imitate aplastic anemia in mice and chosen Di-gan Oral Liquid and Decoction of Four Ingredients to treat the mice.The cellular factors(IL-2,TNF) were detected and the effects of the Chinese medicine were observed.The result showed:the serum content of cellular factor in immunologically mediated aplastic anemia was higher than that of normal group (P<0.01).Both Chinese medicine can reduce the cellular factors content and the difference of three treated groups was smaller (P>0.05).
, 百拇医药
Key words:Aplastic anemia Immunological mediation Animal model
用免疫介导法处理小鼠不仅可以损害小鼠的造血干细胞，使有源于 CFU-S 阶段的造血生成能力缺陷，还可以使机体的免疫功能受损，出现造血抑制细胞和血浆CFU-GM抑制活性[1][2]。通过对实验小鼠两种细胞因子——白细胞介素-2(IL-2)及肿瘤坏死因子(TNF)的检测分析，可以了解免疫介导模型小鼠血清中两种细胞因子的水平，以及地甘口服液及红霖四物口服液对它们的影响。
1 资料与方法
1.1 动物 Balb/c小鼠60只，8～12周龄，体重16g～20g，雌雄不限，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。DBA/2小鼠，8～10周龄，雌雄不限，由中山医科大学实验中心提供。
, http://www.100md.com 1.2 模型动物的建立[3] 取DBA/2小鼠，断颈处死，95%酒精浸泡消毒5分钟后，无菌取出胸腺及颈、腋下、腹股沟等处的淋巴结，加RPMI-1640培养液，除去表面血污及粘附的结缔组织。再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，直到成糊状，再轻轻研磨用200目尼龙网过滤，使之成为单细胞悬液。计数后配成1×106/ml浓度，其胸腺细胞：淋巴结细胞为1∶2。取1滴苔盼蓝滴入玻片上鉴定细胞活性应在95%以上。Balb/c小鼠经X射线6.0Gy/3min亚致死剂量照射后1～4小时内，立即尾静脉输入上述细胞悬液，每只小鼠输入0.2ml。
1.3 药剂制备 地甘口服液由大剂量炙甘草、熟地黄为主组成，由湖北中医学院附属医院制剂室制备。经水煎、过滤、浓缩，分别配制成100%(每毫升含生药1g)及200%(每毫升含生药2g)药液分装成100ml瓶备用。红霖四物口服液由四川新斯顿制药有限责任公司提供(批准文号：22-3294-川卫药准字1996-011555号)。
, http://www.100md.com
1.4 分组及处理 实验动物随机分成五组，每组12只小鼠。分别为：(1)正常组，灌服蒸馏水0.5ml～0.6ml/只，2次/d，连续10天；(2)模型组，制模后处理同上；(3)地甘口服液Ⅰ组；(4)地甘口服液Ⅱ组。制模后分别灌服100%及200%浓度地甘口服液，每次0.5～0.6ml/只，2次/d，连续10天；(5)四物口服液组，制模后灌服四物口服液0.5ml～0.6ml/只，2次/d，连续10天。
分组处理后第11天～14天，模型组小鼠濒死时，定为取材时间。用毛细吸管从各组小鼠眼眶后静脉丛取血0.8ml～1ml，分离血清，-20°C保存。
1.5 主要试剂及仪器 TNF放射免疫测定药盒及IL-2放射免疫测定药盒，均由北京东亚免疫技术研究所提供，批号分别为980701和980629。J-2008G型自动γ-免疫计数仪，(上海262厂生产)。电子直线加速器(WDVE-6/100型，广州威达)。
, 百拇医药
1.6 实验方法 将小鼠血清置冷水中复融混匀，4°C 3000r/min离心5分钟，取上清液，然后分别按药盒说明方法操作。
1.7 统计学方法 数据均以均数±标准差(X±s)表示，分别采用t检验及F检验。
2 结果
2.1 免疫介导再生障碍性贫血小鼠血清TNF含量的变化及地甘口服液、红霖四物口服液对其的影响 见表1。
表1 各组小鼠血清TNF含量的变化(X±s) 组 别
n
TNF(ng/ml)
正 常 组
12
, http://www.100md.com
5.016±0.893
模 型 组
12
10.33±1.09*
地甘口服液Ⅰ组
12
7.625±1.371*△
地甘口服液Ⅱ组
12
8.025±1.672*△
红霖四物口服液组
, http://www.100md.com
12
7.806±1.379*△
*与正常组比较 P<0.01，△ 与模型组比较 P<0.01，治疗组之间比较(F检验) P>0.05。
2.2 免疫介导再生障碍性贫血小鼠血清IL-2含量的变化及地甘口服液、红霖四物口服液对其的影响 见表2。表2 各组小鼠血清IL-2含量的变化(X±s) 组 别
n
IL-2(ng/ml)
正 常 组
12
1.365±0.24
, 百拇医药
模 型 组
12
2.376+0.478*
地甘口服液Ⅰ组
12
1.77+0.249*△
地甘口服液Ⅱ组
12
1.903±0.257*△
红霖四物口服液组
12
, 百拇医药 1.808+0.214*△
*与正常组比较P<0.01，△ 与模型组比较 P<0.01，治疗组间比较 P>0.05。
3 讨论
根据姚军等的方法[3]，复制出免疫介导小鼠再生障碍性贫血模型，小鼠出现的症状体征、外周血及骨髓象变化特点与文献报告基本一致。在众多的造血负调控因子中，IL-2和TNF含量的异常升高[4][5]，一直被认为与人类免疫介导型再生障碍性贫血循环造血抑制活性的形成密切相关，表现出对CFU-GM的生成产生明显的抑制效应。本实验的结果显示模型小鼠血清中TNF、IL-2含量明显高于正常，表明其造血抑制活性的形成与这两种因子有密切的关系。
以补气补血中药组成的复方在治疗免疫介导型再生障碍性贫血小鼠过程中，表现出两细胞因子含量的下降，尽管与正常鼠比较存在差异，但较模型鼠已有大幅度减少，说明中药复方(地甘口服液、红霖四物口服液)对异常增高的造血负调控因子有拮抗作用，以减轻其对造血功能的抑制，这对于进一步研究中医药对再生障碍性贫血治疗的机理具有十分积极的作用。
, 百拇医药
基金项目：1997年湖北省科委资助课题
作者简介：湖北中医学院96级博士生
参考文献
1 潘景轩.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血粒单系祖细胞的研究.中华血液学杂志，1992，13(2)：78
2 陈俊.免疫介导的小鼠再生障碍性贫血骨髓CFU-S的改变及机制探讨.中华血液学杂志，1991，12(6)：286
3 姚军.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志，1991，12(5)：229
4 Jie T,Bacigalupao A,Piaggio G,et al. In vitro response of T cells from aplastic anemia pantients to antilymphocyte globulin and phytohemagglutinin:colony-stimulating activity and lymphokine production.Exp Hematal 1991;19:312
5 连天顺，赵志平.再生障碍性贫血白细胞介素-2及其受体细胞的研究.中华血液学杂志，1990，11：21
收稿日期：1998-11-11, 百拇医药