三氧化二砷诱导人胃癌细胞株MGC-803细胞凋亡的研究
作者：陈云华 李建萍 陈 亮 曾 斌 曾明新
单位：湖南省郴州医学高等专科学校(郴州 423000)；曾斌 曾明新(衡阳医学院附属第二医院(衡阳 421001))
关键词：肿瘤细胞，培养的；胃；脱噬作用；砷
湖南医学990104 摘 要
【目的】为探讨三氧化二砷(As2O3)对胃癌细胞的作用及可能的机制。【方法】用不同浓度的As2O3作用于培养的胃癌细胞株MGC-803细胞。【结果】噻唑蓝(MTT)细胞活力测定显示As2O3能明显抑制MGC-803细胞生长；进一步用Hoeghes33342和碘化丙啶(PI)双荧光流式细胞仪(FCM)检测和琼脂糖DNA电泳，MGC-803细胞表现为明显凋亡特征；扫描电镜显示凋亡的形态学特征。【结论】As2O3能有效地抑制胃癌细胞的生长增殖，并具有时—效和量—效关系。
, http://www.100md.com
Apoptosis of Human Gastric Cancer Cell Induced by Arsenic Trioxide in Vitro
CHEN Yunhua, LI Jianping, CHEN Liang
Chenzhou Medical School,Hunan Province,Chenzhou,423000
ZENG Bin, ZENG Mingxin
Second Affiliated Hospital,Hengyang Medical College,Hengyang,421001
Abstract
【Objective】 To study the effects and possible mechanism of action of As2O3 on human gastric cancer(HGC) cells. 【Methods】 By means of MTT colorimetric assay,the antiproliferative effects of As2O3 with different concentrations on cultured HGC cell line MGC-803 were observed.The characteristics of apoptosis were further examined by Hoeches33342,PI,fluorescence flow cytometry and DNA agarose gel electrophores; whereas the morphological feature of apoptosis was observed by scanning electron microscopy. 【Results】 Prominent apoptosis of HGC cells showing typical morphological changes was induced by addition of As2O3. 【Conclusions】 As2O3 can inhibit significantly the reproduction and proliferation of HGC cells, which is related to drug concentration and time of cultivation.
, 百拇医药
Key words tumor cells,cultured； stomach； apoptosis； arsenic
肿瘤细胞为恶性无限制增殖，分化受阻和细胞凋亡受抑制是恶性肿瘤的重要的发病机制，据此，设计化疗方案，诱导分化和促进肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤诊疗的重要措施，特别是促凋亡疗法现已成为各种肿瘤治疗的基础[1]。
近年报道，三氧化二砷(As2O3)能有效地治疗急性早幼粒细胞白血病，并可诱导NB4细胞凋亡[2，3]，提示砷剂可能具有抑制某些肿瘤的作用，但有关砷剂对其它肿瘤作用的基础研究尚无报道，砷剂抗肿瘤机制也有待进一步阐明。本研究以人胃癌细胞株MGC-803为受试对象，以观察As2O3能否有效抑制MGC-803细胞生长，促进其凋亡。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 As2O3购自Sigma公司(Lot,a1010)以PBS溶解配成10-3M储存液，4℃保存。Hoechst33342和碘化丙啶(PI)购自美国Eugene公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，RNA酶，蛋白酶K等为华美公司进口分装；MGC-803细胞株由北京市肿瘤研究所馈赠；PMPI 1640，GIBCO产品；胎牛血清为天津血研所生化厂产品。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MGC-803细胞以含10%灭活的胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素10 mg/ml的RMPI 1640为培养基，在5%二氧化碳，37 ℃细胞培养箱内培养；细胞融合贴壁，单层生长铺满培养瓶后，以0.25%胰蛋白酶消化，常规传代培养，每3～4d传代一次。
, 百拇医药
1.2.2 MTT细胞活力分析 将0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液的MGC-803细胞，用含10%胎牛血清RMPI 1640培养基稀释调整细胞密度为3×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔加200μl的细胞悬液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内培养12 h，待细胞贴壁良好时，将浓度分别为10-8，5×10-8，10-7，10-6M的As2O3加入每孔中。对照组加PBS溶液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内分别培养12，24，48 h，然后每孔加入10 mg/ml的MTT(1640培养液溶解)20 μl，同样条件保温4 h，取出培养板每孔加200 μl的二甲基亚砜，混匀，酶标仪测定570 nm吸光值。
1.2.3 流式细胞仪(Fcm)分析 将经10-8，10-6M浓度As2O3处理12～48h和未经砷处理的对照组MCG-803培养细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×105/ml，分别加入Hoechst33342和PI至终浓度为5μg/ml，37 ℃温育15 min后，离心6 min(500 r/min)后沉淀，予冷PBS漂洗，再沉淀，重悬于2 ml PBS中，立即在以紫外光为激发光源的Fcm(Lysis。USA)进行检测，分别用480 nm和600 nm的滤光片测量Hoechst33342和PI的蓝色和红色荧光，以及600/480的荧光比率，其相关参数由LYSIS软件自动分析处理。
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1.2.4 DNA电泳 收集10-8，10-6M浓度As2O3处理24 h后和对照组MGC-803细胞予冷PBS冲洗一次，离心6 min(500 r/min)沉淀，加入2 ml的细胞裂解液(50 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，150 mM NaCl，1% SDS)，然后加蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，50℃水溶4 h，冷却至室温后，加入-20 ℃无水乙醇，可见DNA白色沉淀析出，离心沉淀10 min(12000 r/min)，小心吸去上清液，70%乙醇洗一次，重沉淀，风干，溶入400 ml TE缓冲液中，加入RNA至终浓度为200 mg/ml，37 ℃，20 min，然后置含溴化乙啶(EB)mg/ml的1.5%琼脂糖上，DNA分子量标准为λDNA经Hand Ⅲ和Ecor Ⅰ消化酶切(Promega产品)，电泳缓冲液为：0.5×TBE，电压为5 V/cm，电泳4 h，紫外灯观察并摄相。
1.2.5 扫描电镜样品制备 生长于小盖玻片上的经As2O3处理和对照组的细胞，以冷PBS液洗净，然后以1.5%戊二醛，1%锇酸固定各2 h，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水。乙酸异戊醛置换，临界点干燥，喷镀，安置，扫描电镜下观察，摄像。
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2 结果
2.1 不同浓度As2O3对MGC-803细胞生长增殖的影响 用10-8，5×10-8、10-7，10-6M浓度的As2O3分别处理培养生长良好的MGC-803细胞6、12、24、48 h，MTT细胞活力分析显示MGC-803细胞实验组存活细胞明显低于对照组，且具有一定的时-效和量-效关系。10-8、10-7M的As2O3作用6 h，对MGC-803细胞生长抑制作用不明显，但随作用时间延长及作用浓度增加，细胞生长抑制效应逐渐增强呈量—效，时-效关系。详图1，所得结果为三次实验所测得的平均数据(
±s)。
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图1 不同浓度的As2O3对MGC-803细胞生长存活的影响
2.2 As2O3诱导MGC-803细胞凋亡
2.2.1 流式细胞仪分析 经浓度为10-8，5×10-7、10-6M的As2O3处理12～48h的MGC-803细胞经Fcm检测，其相关参数由LYSIS软件自动分析处理，结果证明细胞呈典型的凋亡图形，且随浓度和作用时间延长，细胞凋亡率明显增加，以10-6M作用48h凋亡率为最大。接近100%。参见图2(为模拟图)。
图2 经不同As2O3处理不同浓度的MGC-803细胞得Fcm检测结果
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2.2.2 DNA琼脂糖电泳 用不同浓度的As2O3处理MGC-803细胞24h抽提DNA行琼脂糖电泳，结果显示：浓度为5×10-8、10-7、10-6M者，有细胞凋亡的典型“梯形”表现，尤以10-6作用者明显，对照组则为阴性(图3)。
图3 经不同浓度的As2O3处理24 h的MGC-803细胞DNA琼脂糖电泳图(1,10-6M;2,10-7M;3,5×10-8M;4,10-8M;5,对照;6,标记)
2.2.3 凋亡的形态学改变 用5×10-7M终浓度的As2O3处理MGC-803细胞24h，倒置显微镜下呈典型的凋亡特征，细胞变圆，胞膜起泡，染色质向一侧浓缩偏移(如图4)。扫描电镜可见染色质分解、浓缩、聚集成块状，凋亡小体形成(如图5)。
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图4 5×10-7M的As2O3作用于MGC-803细胞24h后，倒置显微镜下见细胞形态变圆，体积缩小，质膜起泡
图5 5×10-7M的As2O3作用于MGC-803细胞24h后，扫描电镜下见细胞形态变圆，质膜起泡，凋亡小体形成
3 讨论
细胞凋亡是细胞生理性自杀，正常情况下，细胞增殖和凋亡维持了组织中细胞总数平衡。肿瘤组织因细胞过度增殖，凋亡相对抑制，从而造成机体的失衡状态。故加速和促进肿瘤细胞凋亡对肿瘤防治具备重要意义。
在传统的中医药中，小剂量砷剂曾被用于治疗食道癌、淋巴瘤等[4]。最近报道它可有效应用治疗急性早幼粒细胞白血病[3，5]，本研究以10-8、10-6M浓度的As2O3处理培养的人胃癌MGC-803细胞，结果发现它能有效地抑制细胞增殖，其抑制细胞增殖与Fcm检测的细胞凋亡率相一致，且随As2O3浓度增加，作用时间延长，细胞增殖抑制率和凋亡率相应增加，具有时-量关系。
, 百拇医药
细胞凋亡过程中，核酸内切酶活化，DNA在核小体间被切断，形成180-200 bp碱基对或其倍数的DNA片断，在琼脂糖电泳上表现为“梯形”，这与细胞坏死时，DNA随机断裂，琼脂糖电泳表现为片状明显不同。这是细胞凋亡中最重要的生化改变，利用流式细胞仪检测细胞凋亡是较敏感的方法之一，作者采用双荧光标记方法，提高了Fcm凋亡细胞检出率，同时排除了坏死细胞[7]。在本研究中，从As2O3处理的MGC-803细胞中提取的DNA琼脂糖电泳具备典型梯形条带；扫描电镜显示细胞凋亡的形态学特征；Fcm检测具典型的凋亡细胞分布，细胞凋亡检出率与生长抑制率相一致，说明As2O3抑制MGC-803细胞生长是通过诱导其凋亡实现的。本研究所使用的As2O3浓度低文献报道[2]，说明MGC-803细胞对砷剂更加敏感。
参考文献
, 百拇医药
[1] Barr P J,Tomel D.Apoptosis and it′s role in human disease.Biol Technol,1994,12:487
[2] Chen GQ,Zhu J,Shi X,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3),in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apotosis with down regulation of bel expression and alteration of PML,RAR/PML protein localization.Blood,1996,88:1053～1061
, http://www.100md.com
[3] 张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，2(17)：17～19
[4] 中国中医药药典，北京：人民卫生出版社，1972版，P48
[5] 王振义.开展砷剂治疗白血病的临床的机制研究.中华血液学杂志，1996，2(17)：58
[6] Steller H,Mechanisms and genes of cellular suicide.Science,1995,267:145～149
[7] Belloc F,Dumain P,Bocsseau MR,et al,A flow cytometry method using hoechst 33342 and propidum iodide for simulk taneous cell cycle analysis and apoptosis dimination in unfixed cell,Cytometry,1994,17:59～65
(19981013 收稿), http://www.100md.com
单位：湖南省郴州医学高等专科学校(郴州 423000)；曾斌 曾明新(衡阳医学院附属第二医院(衡阳 421001))
关键词：肿瘤细胞，培养的；胃；脱噬作用；砷
湖南医学990104 摘 要
【目的】为探讨三氧化二砷(As2O3)对胃癌细胞的作用及可能的机制。【方法】用不同浓度的As2O3作用于培养的胃癌细胞株MGC-803细胞。【结果】噻唑蓝(MTT)细胞活力测定显示As2O3能明显抑制MGC-803细胞生长；进一步用Hoeghes33342和碘化丙啶(PI)双荧光流式细胞仪(FCM)检测和琼脂糖DNA电泳，MGC-803细胞表现为明显凋亡特征；扫描电镜显示凋亡的形态学特征。【结论】As2O3能有效地抑制胃癌细胞的生长增殖，并具有时—效和量—效关系。
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Apoptosis of Human Gastric Cancer Cell Induced by Arsenic Trioxide in Vitro
CHEN Yunhua, LI Jianping, CHEN Liang
Chenzhou Medical School,Hunan Province,Chenzhou,423000
ZENG Bin, ZENG Mingxin
Second Affiliated Hospital,Hengyang Medical College,Hengyang,421001
Abstract
【Objective】 To study the effects and possible mechanism of action of As2O3 on human gastric cancer(HGC) cells. 【Methods】 By means of MTT colorimetric assay,the antiproliferative effects of As2O3 with different concentrations on cultured HGC cell line MGC-803 were observed.The characteristics of apoptosis were further examined by Hoeches33342,PI,fluorescence flow cytometry and DNA agarose gel electrophores; whereas the morphological feature of apoptosis was observed by scanning electron microscopy. 【Results】 Prominent apoptosis of HGC cells showing typical morphological changes was induced by addition of As2O3. 【Conclusions】 As2O3 can inhibit significantly the reproduction and proliferation of HGC cells, which is related to drug concentration and time of cultivation.
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Key words tumor cells,cultured； stomach； apoptosis； arsenic
肿瘤细胞为恶性无限制增殖，分化受阻和细胞凋亡受抑制是恶性肿瘤的重要的发病机制，据此，设计化疗方案，诱导分化和促进肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤诊疗的重要措施，特别是促凋亡疗法现已成为各种肿瘤治疗的基础[1]。
近年报道，三氧化二砷(As2O3)能有效地治疗急性早幼粒细胞白血病，并可诱导NB4细胞凋亡[2，3]，提示砷剂可能具有抑制某些肿瘤的作用，但有关砷剂对其它肿瘤作用的基础研究尚无报道，砷剂抗肿瘤机制也有待进一步阐明。本研究以人胃癌细胞株MGC-803为受试对象，以观察As2O3能否有效抑制MGC-803细胞生长，促进其凋亡。
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1 材料与方法
1.1 材料 As2O3购自Sigma公司(Lot,a1010)以PBS溶解配成10-3M储存液，4℃保存。Hoechst33342和碘化丙啶(PI)购自美国Eugene公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，RNA酶，蛋白酶K等为华美公司进口分装；MGC-803细胞株由北京市肿瘤研究所馈赠；PMPI 1640，GIBCO产品；胎牛血清为天津血研所生化厂产品。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MGC-803细胞以含10%灭活的胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素10 mg/ml的RMPI 1640为培养基，在5%二氧化碳，37 ℃细胞培养箱内培养；细胞融合贴壁，单层生长铺满培养瓶后，以0.25%胰蛋白酶消化，常规传代培养，每3～4d传代一次。
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1.2.2 MTT细胞活力分析 将0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液的MGC-803细胞，用含10%胎牛血清RMPI 1640培养基稀释调整细胞密度为3×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔加200μl的细胞悬液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内培养12 h，待细胞贴壁良好时，将浓度分别为10-8，5×10-8，10-7，10-6M的As2O3加入每孔中。对照组加PBS溶液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内分别培养12，24，48 h，然后每孔加入10 mg/ml的MTT(1640培养液溶解)20 μl，同样条件保温4 h，取出培养板每孔加200 μl的二甲基亚砜，混匀，酶标仪测定570 nm吸光值。
1.2.3 流式细胞仪(Fcm)分析 将经10-8，10-6M浓度As2O3处理12～48h和未经砷处理的对照组MCG-803培养细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×105/ml，分别加入Hoechst33342和PI至终浓度为5μg/ml，37 ℃温育15 min后，离心6 min(500 r/min)后沉淀，予冷PBS漂洗，再沉淀，重悬于2 ml PBS中，立即在以紫外光为激发光源的Fcm(Lysis。USA)进行检测，分别用480 nm和600 nm的滤光片测量Hoechst33342和PI的蓝色和红色荧光，以及600/480的荧光比率，其相关参数由LYSIS软件自动分析处理。
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1.2.4 DNA电泳 收集10-8，10-6M浓度As2O3处理24 h后和对照组MGC-803细胞予冷PBS冲洗一次，离心6 min(500 r/min)沉淀，加入2 ml的细胞裂解液(50 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，150 mM NaCl，1% SDS)，然后加蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，50℃水溶4 h，冷却至室温后，加入-20 ℃无水乙醇，可见DNA白色沉淀析出，离心沉淀10 min(12000 r/min)，小心吸去上清液，70%乙醇洗一次，重沉淀，风干，溶入400 ml TE缓冲液中，加入RNA至终浓度为200 mg/ml，37 ℃，20 min，然后置含溴化乙啶(EB)mg/ml的1.5%琼脂糖上，DNA分子量标准为λDNA经Hand Ⅲ和Ecor Ⅰ消化酶切(Promega产品)，电泳缓冲液为：0.5×TBE，电压为5 V/cm，电泳4 h，紫外灯观察并摄相。
1.2.5 扫描电镜样品制备 生长于小盖玻片上的经As2O3处理和对照组的细胞，以冷PBS液洗净，然后以1.5%戊二醛，1%锇酸固定各2 h，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水。乙酸异戊醛置换，临界点干燥，喷镀，安置，扫描电镜下观察，摄像。
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2 结果
2.1 不同浓度As2O3对MGC-803细胞生长增殖的影响 用10-8，5×10-8、10-7，10-6M浓度的As2O3分别处理培养生长良好的MGC-803细胞6、12、24、48 h，MTT细胞活力分析显示MGC-803细胞实验组存活细胞明显低于对照组，且具有一定的时-效和量-效关系。10-8、10-7M的As2O3作用6 h，对MGC-803细胞生长抑制作用不明显，但随作用时间延长及作用浓度增加，细胞生长抑制效应逐渐增强呈量—效，时-效关系。详图1，所得结果为三次实验所测得的平均数据(
±s)。, 百拇医药
图1 不同浓度的As2O3对MGC-803细胞生长存活的影响
2.2 As2O3诱导MGC-803细胞凋亡
2.2.1 流式细胞仪分析 经浓度为10-8，5×10-7、10-6M的As2O3处理12～48h的MGC-803细胞经Fcm检测，其相关参数由LYSIS软件自动分析处理，结果证明细胞呈典型的凋亡图形，且随浓度和作用时间延长，细胞凋亡率明显增加，以10-6M作用48h凋亡率为最大。接近100%。参见图2(为模拟图)。
图2 经不同As2O3处理不同浓度的MGC-803细胞得Fcm检测结果
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2.2.2 DNA琼脂糖电泳 用不同浓度的As2O3处理MGC-803细胞24h抽提DNA行琼脂糖电泳，结果显示：浓度为5×10-8、10-7、10-6M者，有细胞凋亡的典型“梯形”表现，尤以10-6作用者明显，对照组则为阴性(图3)。
图3 经不同浓度的As2O3处理24 h的MGC-803细胞DNA琼脂糖电泳图(1,10-6M;2,10-7M;3,5×10-8M;4,10-8M;5,对照;6,标记)
2.2.3 凋亡的形态学改变 用5×10-7M终浓度的As2O3处理MGC-803细胞24h，倒置显微镜下呈典型的凋亡特征，细胞变圆，胞膜起泡，染色质向一侧浓缩偏移(如图4)。扫描电镜可见染色质分解、浓缩、聚集成块状，凋亡小体形成(如图5)。
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图4 5×10-7M的As2O3作用于MGC-803细胞24h后，倒置显微镜下见细胞形态变圆，体积缩小，质膜起泡
图5 5×10-7M的As2O3作用于MGC-803细胞24h后，扫描电镜下见细胞形态变圆，质膜起泡，凋亡小体形成
3 讨论
细胞凋亡是细胞生理性自杀，正常情况下，细胞增殖和凋亡维持了组织中细胞总数平衡。肿瘤组织因细胞过度增殖，凋亡相对抑制，从而造成机体的失衡状态。故加速和促进肿瘤细胞凋亡对肿瘤防治具备重要意义。
在传统的中医药中，小剂量砷剂曾被用于治疗食道癌、淋巴瘤等[4]。最近报道它可有效应用治疗急性早幼粒细胞白血病[3，5]，本研究以10-8、10-6M浓度的As2O3处理培养的人胃癌MGC-803细胞，结果发现它能有效地抑制细胞增殖，其抑制细胞增殖与Fcm检测的细胞凋亡率相一致，且随As2O3浓度增加，作用时间延长，细胞增殖抑制率和凋亡率相应增加，具有时-量关系。
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细胞凋亡过程中，核酸内切酶活化，DNA在核小体间被切断，形成180-200 bp碱基对或其倍数的DNA片断，在琼脂糖电泳上表现为“梯形”，这与细胞坏死时，DNA随机断裂，琼脂糖电泳表现为片状明显不同。这是细胞凋亡中最重要的生化改变，利用流式细胞仪检测细胞凋亡是较敏感的方法之一，作者采用双荧光标记方法，提高了Fcm凋亡细胞检出率，同时排除了坏死细胞[7]。在本研究中，从As2O3处理的MGC-803细胞中提取的DNA琼脂糖电泳具备典型梯形条带；扫描电镜显示细胞凋亡的形态学特征；Fcm检测具典型的凋亡细胞分布，细胞凋亡检出率与生长抑制率相一致，说明As2O3抑制MGC-803细胞生长是通过诱导其凋亡实现的。本研究所使用的As2O3浓度低文献报道[2]，说明MGC-803细胞对砷剂更加敏感。
参考文献
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[1] Barr P J,Tomel D.Apoptosis and it′s role in human disease.Biol Technol,1994,12:487
[2] Chen GQ,Zhu J,Shi X,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3),in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apotosis with down regulation of bel expression and alteration of PML,RAR/PML protein localization.Blood,1996,88:1053～1061
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[3] 张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，2(17)：17～19
[4] 中国中医药药典，北京：人民卫生出版社，1972版，P48
[5] 王振义.开展砷剂治疗白血病的临床的机制研究.中华血液学杂志，1996，2(17)：58
[6] Steller H,Mechanisms and genes of cellular suicide.Science,1995,267:145～149
[7] Belloc F,Dumain P,Bocsseau MR,et al,A flow cytometry method using hoechst 33342 and propidum iodide for simulk taneous cell cycle analysis and apoptosis dimination in unfixed cell,Cytometry,1994,17:59～65
(19981013 收稿), http://www.100md.com