雌激素替代对切卵巢大鼠基底前脑NGFR和学习记忆的影响
作者：王寅初 叶碧绿
单位：温州医学院附属第二医院妇产科(325027)
关键词：雌激素替代治疗；神经生长因子受体；内侧隔核；斜角带水平肢；Meynert基核；认知功能
温州医学院学报/990403 摘 要 目的 探讨雌激素替代对切卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元神经生长因子表达的影响和对学习记忆的影响。方法 50只雌性切卵巢大鼠分成给雌激素组和对照组，分别用免疫组化方法测定给药后1周、2周、4周时基底前脑各部位神经生长因子受体(NGFR)阳性神经元数，用MORRIS迷宫观察给药4周时大鼠逃避潜伏期和搜索策略，并进行两组间比较。结果 给雌激素组与对照组的NGFR阳性神经元数相比，内侧隔核(MS)和Meynert基核(NBM)部位分别在2周和4周开始有显著性降低，而斜角带水平肢(HDB)在4周内无显著性变化。给药4周后给雌激素组与对照组相比，逃避潜伏期延长有显著性而空间搜索策略差异无显著性。结论 ①雌激素替代对基底前脑胆碱能神经元的神经生长因子受体的表达有时间性和部位选择性作用。②给雌激素4周时，大鼠的学习获取能力减退，但空间定位、学习巩固和记忆储存能力尚无明显变化。
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Effects of the estrogen replacement therapy
on the NGFR in the basal forebrain and on the
Cognitive function of the ovariectomized rats
Wang Yinchu,Ye Bilu.Department of
Gynecology and Obstetrics,The Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College,Wenzhou,Zhejiang,China,325027
Abstract Objective To investigate the effects of estrogen replacement therapy(ERT)on the cholinergic system-nerve growth factor related system in the basal forebrain and on the cognitive function.Methods Fifty female ovariectomized rats were divided into two groups(estrogen replaced therapy group and no estrogen treated control group).After 1-week、2-week and 4-week therapy,the rats were executed,and the NGFR immunoreactive cells in the basal forebrain were detected by immunocytochemical method.Morris mazes were used to evaluate the memory and learning ability of the ovariectomized rats after 4 weeks of ERT.Results The number of NGFR immunoreactive cells of ERT rats compared with that of control rats was as follows:In the MS,there was a significant decrease after 2 weeks.In the NBM,there was a significant decrease after 4 weeks.In the HDB,there wasn't signnificant change within 4 weeks.In the place navigation test of Morris mazes,escape latencies of the ERT rats were significantly increase the first 4 blocks compared with those of the controls(30.4±7.5svs 21.3±5.3s，P<0.01);in the latter 5 blocks escape latency had no significant difference between the two groups(13.2±7.7vs 9.8±3.1，P>0.05).In the spatial probe test of Morris mazes,there was no significant difference between ERT group and control group in the percentage of the swimming distance in the every quadrant part over the total swimming area.Conclusion ①ERT produces regionally selective effects on the NGFR expression of the basal forebrain cholinergic neurons.②Short-term(1 month)ERT makes the ovariectomized rats more difficult to obtain new information,but exerts no influence on the other aspects of the memory and learning.
, 百拇医药
Key words Estrogen replacement therapy(ERT) Nerve growth factor receptor(NGFR) Medial septum(MS) Horizontal limb of the diagonal band of Broca(HDB) Nucleus basalis of Meynert(NBM) Cognitive function
阿尔茨海默氏病是引起老年性痴呆的主要病因，近年的研究结果提示雌激素与阿尔茨海默氏病之间可能存在着一定的联系。因阿尔茨海默氏病的认知功能障碍主要原因在于基底前脑胆碱能神经元的损伤，而神经生长因子为胆碱能神经元的生长提供营养支持。所以本研究通过观察去卵巢大鼠给雌激素后基底前脑各部位神经生长因子受体(NGF)阳性神经元数的变化和认知记忆的变化情况，为临床用雌激素预防和治疗阿尔茨海默氏病提供实验基础。
1 材料和方法
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1.1 动物及分组 雌性SD大鼠50只，3月龄，体重190～230克(温州医学院试验动物中心提供)，均行双侧卵巢切除术，两周后，随机分成两组，每组各25只，其中一组大鼠每只隔天给予芝麻油稀释(1∶1)的苯甲酸雌二醇20μl(含苯甲酸雌二醇20μg)，另外一组大鼠每只隔天给予20μl芝麻油，于给药后1周、2周、4周分别杀死给雌激素组和给芝麻油组大鼠各5只，并用免疫组化方法检测基底前脑各部位NGFR阳性细胞。剩余的20只大鼠(给雌激素组和不给雌激素组各10只)于给药四周后用MORRIS水迷宫进行行为学检测。动物在饲养过程中，自由饮食、饮水，自然光暗周期。
1.2 基底前脑神经元NGFR免疫细胞化学染色
1.2.1 固定、取材和制备：大鼠经心腔内灌注固定后，除去颅盖，再把大鼠头部固定在江湾立体定位仪上，在前囟后约2mm处横切一刀。取出脑组织，后固定4小时后，经梯度蔗糖脱水，4℃冰箱过夜。取前部脑组织，用恒冷切片机做冠状连续切片，片厚40μm，取前囟+1.0、+0.5、+0.1、-0.2、-1.0、-1.2、-1.4的脑片。
, 百拇医药
1.2.2 NGFR免疫细胞化学染色：使用ABC法，一抗(1∶30)由Bohring Mannheim公司提供，二抗和三抗(均为1∶200)是由Sigma公司提供。严格按中山医科大学老年性痴呆研究室的操作规程进行，DAB显色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照试验切片不加一抗孵育，其他步骤相同。
1.2.3 阳性神经元计数：胞浆有棕黄颗粒着色为阳性细胞，用放大160倍的显微镜计数：①前囟+1.0、+0.5、+0.1脑片的内侧隔核(MS)部位的全部阳性细胞。②前囟+0.5、+0.1、-0.2脑片的斜角带水平肢(HDB)部位的全部阳性细胞。③前囟-1.0、-1.2、-1.4脑片的Mynert基核(NBM)部位的全部阳性细胞。
1.3 MORRIS水迷宫检测
1.3.1 定位航行实验：MORRIS水迷宫的组成参见文献[1]。试验开始前一天将大鼠放入水池中(不含平台)自由游泳2分钟，让其熟悉迷宫环境。试验开始时，将平台置于NE象限正中，实验共4天半，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，分别将大鼠从E、S、W、N四点面向池壁放入池中，记录每次大鼠从入水池到找到平台的时间为逃避潜伏期。每次训练时间不超过2分钟，每两次训练之间让大鼠在平台上休息1分钟。
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1.3.2 空间搜索试验：第5天下午撤除平台后，将大鼠在S点面向池壁放入水中，用录像机记录120秒内大鼠在池中游泳路线。测出120秒内大鼠在各个象限内游泳路程分别占总路程的百分比。
1.4 数据统计学处理 采用SPSS软件处理，用t检验和单因素方差分析作差异显著性分析。用[(实验组均数—对照组均数)/对照组均数]×100%来表示变化百分率。
2 结果
2.1 雌激素替代不同时间对切卵巢大鼠基底前脑各部位NGFR阳性细胞数的影响见表1 MS和HDB部位的NGFR阳性神经元数分别在给雌激素2周和4周开始与对照组相比显著降低。HDB部位的NGFR阳性神经元数给雌激素组与对照组相比，在4周内差异均无显著性意义。
表1 雌激素替代1周、2周、4周对切卵巢大鼠基底前脑
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MS、HDB、NBM部位NGFR阳性神经元数的影响(
±SD)
n
MS
HDB
NBM
1周
2周
4周
1周
2周
4周
1周
, 百拇医药
2周
4周
给雌激素组
15
86.4±10.4
75.6±8.6*
66.8±7.5**
153.7±30.0
128.7±18.9
119.8±28.4
116.5±26.3
113.9±17.9
, 百拇医药
102.3±21.0*
对照组
15
84.4±9.4
84.8±13.7
82.1±8.7
142.8±36.8
140.5±35.3
133.2±29.0
109.9±23.8
131.0±31.3
132.9±43.9
, 百拇医药
变化百分比
2.4
-10.8
-18.6
7.6
-8.4
-10.1
6.0
-13.1
-23.0
与对照组比：*P<0.05，**P<0.01
2.2 雌激素替代对切卵巢大鼠学习记忆的影响
, 百拇医药
2.2.1 定位航行试验：给雌激素组和对照组大鼠各10只经过共9个时间段的训练，都学会了寻找平台，并且随着训练次数的增加，两组大鼠平均逃避潜伏期在前4个时间段迅速缩短，自第5个时间段起，平均逃避潜伏期趋于稳定。如表2。
表2 两组大鼠在9个时间段中的逃避潜伏期的比较(±s) 时间段
给雌激素组
(n=10)
对照组
(n=10)
1
54.0±24.5
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36.5±13.8
2
31.3±10.3
23.0±11.7
3
15.8±8.1
16.4±6.9
4
20.5±8.5*
9.2±2.8
5
16.0±11.0
, 百拇医药
12.6±11.8
6
12.0±7.8
9.8±5.2
7
13.7±6.8
10.2±4.8
8
10.3±6.1
9.3±7.4
9
14.3±11.3
, 百拇医药 7.0±2.3
与对照组比：*P<0.05
把9个训练时间段分为前4个时间段和后5个时间段，分别计算两组大鼠平均逃避潜伏期见表3。从表3可见，在前4个时间段，给雌激素组的平均逃避潜伏期比对照组明显延长，差别有非常显著性意义，说明此阶段给雌激素大鼠要找到平台所花的时间比对照组多，提示给雌激素组大鼠学习获取能力比对照组差；在后5个时间段，给雌激素组的平均逃避潜伏期比对照组稍延长，但差别没有显著性意义，说明达到稳定状态后，给雌激素大鼠的空间定位能力、学习巩固和储存能力与对照组差异无显著性。
表3 两组大鼠在不同时间段平均逃避潜伏期(±s，s)
n
前四个时间段
, 百拇医药
后五个时间段
雌激素组
10
30.4±7.5**
13.2±7.7
对 照 组
10
21.3±5.3
9.8±3.1
与对照组比：**P<0.01
2.2.2 空间搜索试验：我们用数点法测出2组大鼠在各个象限游泳路程占总游泳路程的百分比并相互比较，结果如表4。结果发现两组大鼠在平台所在象限的游泳路程占总路程的百分比比其他象限显著增大，说明两组大鼠均对平台位置有良好的记忆；而大鼠在平台所在象限的游泳路程占总路程的百分比在两组之间差异无显著性(35.7%±5.7%对35.5%±6.6%，P>0.05)，说明给雌激素大鼠与对照组的短期空间记忆差异无显著性。
, 百拇医药
表4 两组大鼠120秒内在水池各象限游泳路程占总游泳
路程的百分比及相互比较(±SD，%) 象限
雌激素组(n=10)
对照组(n=10)
P
1.平台所在象限(NE)
35.7±5.7
35.5±6.6
>0.05
2.平台右侧象限(NW)
, 百拇医药
26.5±8.6
27.9±6.7
>0.05
3.平台左侧象限(SE)
20.7±8.3
20.4±7.9
>0.05
4.平台对侧象限(SW)
17.1±5.8
16.1±4.3
>0.05
F
, 百拇医药
15.1712
20.6601
P
<0.01
<0.01
各(1)∶(2)
<0.01
<0.05
象(1)∶(3)
<0.01
<0.01
限(1)∶(4)
, 百拇医药 <0.01
<0.01
间(2)∶(3)
>0.05
<0.05
比(2)∶(4)
<0.05
<0.01
较(3)∶(4)
>0.05
>0.05
3 讨论
3.1 早在70年代初，Deutsch等[2]通过动物实验发现胆碱能系统与记忆的形成和储存有关，现已证明，乙酰胆碱是记忆、学习、认知功能最重要的神经递质，因胆碱能神经元的胞体绝大部分集中于基底前脑部位，而发出长长的突起投射到海马、扣带皮质和半球外侧面，包括额叶、顶叶、枕叶和颞叶等，所以基底前脑胆碱能系统被认为与学习记忆过程密切相关。研究发现AD患者胆碱能系统的退化包括高亲和胆碱摄取能力下降，乙酰胆碱释放减少，ChAT活性下降和AchE活性下降，基底前脑ChAT和NGFR抗体标记细胞严重丢失等，这些与AD的首发症状——记忆力显著减退相符合。有报道AD患者用胆碱酯酶抑制剂发现认知行为指标改善，另外还有用乙酰胆碱(ACh)的合成前体胆碱和增加Ach释放的药物来改善胆碱功能、促进记忆的报道。因此AD发病与基底前脑胆碱能系统的退化密切相关。
, 百拇医药
先前的研究表明啮齿动物和灵长类动物的基底前脑胆碱能神经元既表达神经生长因子受体[3]，也表达雌激素核受体[4,5]，提示基底前脑既是神经生长因子靶器官，也是雌激素的靶器官，神经生长因子和雌激素及两者之间的相互作用均能影响基底前脑胆碱能神经元的功能状态。
本实验结果发现MS部位在雌激素替代2周以后、NBM部位4周以后NGFR阳性细胞数有显著性降低，HDB处随雌激素治疗时间延长，在4周内NGFR阳性细胞数有降低，但变化尚无显著性，可能HDB部位对雌激素替代无反应，也可能反应较慢，差异显著性可能会在一个月以后出现。MS、HDB部位p75NGFR阳性细胞数的减少，其原因可能有雌激素对p75NGFR间接和直接的下调作用。
Gibbs[6]提出雌激素对基底前脑胆碱能系统—神经生长因子相关系统的作用模式如下示意图：
外源性雌激素→ChAT合成↑
, 百拇医药
ChAT↑→ACh(乙酰胆碱)合成↑
ACh↑→NGFR合成↓*
NGFR合成↓→对NGF敏感性↓
对NGF敏感性↓→ChAT合成↓
ChAT合成↓→ACh合成和释放↓
注：*直接作用通过Ach与胆碱能自身受体结合而引起NGFR合成减少；间接作用通过影响NGF的合成和释放而引起NGFR合成减少。
这一作用模式中NGFR的降低起关键的调节作用，它对抗了雌激素对ChAT直接的上调作用，使胆碱能功能不致于过度上升。本实验虽然没有观察胆碱能功能，但在其他的研究中已发现给雌激素替代早期基底前脑ChAT阳性细胞数是有显著增加，随后减少达对照组水平，而NGFR阳性细胞数的减少是在ChAT阳性细胞数减少之前的[6,7]。
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雌激素替代短期内引起NGFR的减少，也可能是雌激素的直接作用的结果。研究[8]表明，暴露于雌激素，可使培养的PC12细胞trkA mRNA表达上调，而使p75NGFR mRNA表达暂时下调，提示雌激素能通过调节高、低亲和NGFR的比例而影响NGF的效果。
3.2 Morris水迷宫因其突出的优点而被广泛用于检测啮齿类动物的空间学习记忆能力。本实验用Morris水迷宫评价雌激素替代4周对切卵巢大鼠空间记忆能力和搜索策略的影响，结果发现：在9个时间段的训练中，两组大鼠均学会寻找平台，并且给雌激素组学习获得能力较对照组差，而记忆巩固能力尚无明显变化。在空间搜索实验中，给雌激素大鼠的搜索策略与对照组比较差异无显著性，说明两组大鼠的短期记忆能力也无区别。
本试验结果可能与雌激素作用的时间性有关，与本试验所示当时的神经生长因子相关系统的功能状态有关。隔天给雌激素20μg，4周时，MS和NBM部位的NGFR阳性细胞数已显著下降，可能在早期升高的胆碱能功能已被下调，至正常或偏低水平，所以学习获得能力已开始降低但尚未影响到空间记忆巩固能力和搜索策略。随治疗时间的延长，雌激素的长期作用对胆碱能功能的有利作用可能会使Morris水迷宫的各项指标获得改善。
, 百拇医药
尽管许多研究者已将雌激素列为治疗阿尔茨海默氏病的一个很有希望的药物，但其对记忆的作用的时间性和部位选择性还需进一步探讨。
参考文献
1 Richard Morris.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.J Neurosci Methods,1984,11∶47～60
2 C.A.O'Malley,R.D.Hautamaki,M.Kelley,et al.Effects of ovariectomy and estradiol benzoate on high affinity choline uptake.Ach synthesis.And release from rat cerebral cortical synaptosomes.Brain Res,1987,403∶389～392
, 百拇医药
3 武义鸣，徐慧君，金国进等.大鼠基底前脑NGF-R及CHAP免疫反应阳性神经元的分布：免疫双标法.中国组织化学与细胞化学杂志，1996，5(2)∶146～150
4 Toran Allerand CD,Miranda RC.Estrogen receptors colocalize with low-affinity nerve growth factor receptors in cholinergic neurons of the basal forebrain.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(10)∶4668～4672
5 Brown TJ,Maclusky NJ,Toran Allerand CD,et al.Characterization of 11 beta-methoxy-16 alpha-[125I]iodoestradiol binding:neuronal localization of estrogen-binding sites in the developing rat brain.Endocrinology,1989,124(5)∶2074～2088
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6 Gibbs RB,Pfaff DW.Effects of estrogen and fimbria/fornix transection on p75NGFR and ChAT expression in the medial septum and diagonal band of Broca.Exp Neurol.，1992,116(1)∶23～39
7 Gibbs RB.Effects of estrogen on basal forebrain cholinergic neurons vary as a function of dose and duration of treatment.Brain Res,1997,757(1)∶10～16
8 Sohrabji F,Greene LA,Miranda RC,et al.Reciprocal regulation of estrogen and NGF receptors by their ligands in PC12 cells.J Neurobiol.，1994,25(8)∶974～988
(收稿：1999-07-13，修回：1999-09-16), 百拇医药
单位：温州医学院附属第二医院妇产科(325027)
关键词：雌激素替代治疗；神经生长因子受体；内侧隔核；斜角带水平肢；Meynert基核；认知功能
温州医学院学报/990403 摘 要 目的 探讨雌激素替代对切卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元神经生长因子表达的影响和对学习记忆的影响。方法 50只雌性切卵巢大鼠分成给雌激素组和对照组，分别用免疫组化方法测定给药后1周、2周、4周时基底前脑各部位神经生长因子受体(NGFR)阳性神经元数，用MORRIS迷宫观察给药4周时大鼠逃避潜伏期和搜索策略，并进行两组间比较。结果 给雌激素组与对照组的NGFR阳性神经元数相比，内侧隔核(MS)和Meynert基核(NBM)部位分别在2周和4周开始有显著性降低，而斜角带水平肢(HDB)在4周内无显著性变化。给药4周后给雌激素组与对照组相比，逃避潜伏期延长有显著性而空间搜索策略差异无显著性。结论 ①雌激素替代对基底前脑胆碱能神经元的神经生长因子受体的表达有时间性和部位选择性作用。②给雌激素4周时，大鼠的学习获取能力减退，但空间定位、学习巩固和记忆储存能力尚无明显变化。
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Effects of the estrogen replacement therapy
on the NGFR in the basal forebrain and on the
Cognitive function of the ovariectomized rats
Wang Yinchu,Ye Bilu.Department of
Gynecology and Obstetrics,The Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College,Wenzhou,Zhejiang,China,325027
Abstract Objective To investigate the effects of estrogen replacement therapy(ERT)on the cholinergic system-nerve growth factor related system in the basal forebrain and on the cognitive function.Methods Fifty female ovariectomized rats were divided into two groups(estrogen replaced therapy group and no estrogen treated control group).After 1-week、2-week and 4-week therapy,the rats were executed,and the NGFR immunoreactive cells in the basal forebrain were detected by immunocytochemical method.Morris mazes were used to evaluate the memory and learning ability of the ovariectomized rats after 4 weeks of ERT.Results The number of NGFR immunoreactive cells of ERT rats compared with that of control rats was as follows:In the MS,there was a significant decrease after 2 weeks.In the NBM,there was a significant decrease after 4 weeks.In the HDB,there wasn't signnificant change within 4 weeks.In the place navigation test of Morris mazes,escape latencies of the ERT rats were significantly increase the first 4 blocks compared with those of the controls(30.4±7.5svs 21.3±5.3s，P<0.01);in the latter 5 blocks escape latency had no significant difference between the two groups(13.2±7.7vs 9.8±3.1，P>0.05).In the spatial probe test of Morris mazes,there was no significant difference between ERT group and control group in the percentage of the swimming distance in the every quadrant part over the total swimming area.Conclusion ①ERT produces regionally selective effects on the NGFR expression of the basal forebrain cholinergic neurons.②Short-term(1 month)ERT makes the ovariectomized rats more difficult to obtain new information,but exerts no influence on the other aspects of the memory and learning.
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Key words Estrogen replacement therapy(ERT) Nerve growth factor receptor(NGFR) Medial septum(MS) Horizontal limb of the diagonal band of Broca(HDB) Nucleus basalis of Meynert(NBM) Cognitive function
阿尔茨海默氏病是引起老年性痴呆的主要病因，近年的研究结果提示雌激素与阿尔茨海默氏病之间可能存在着一定的联系。因阿尔茨海默氏病的认知功能障碍主要原因在于基底前脑胆碱能神经元的损伤，而神经生长因子为胆碱能神经元的生长提供营养支持。所以本研究通过观察去卵巢大鼠给雌激素后基底前脑各部位神经生长因子受体(NGF)阳性神经元数的变化和认知记忆的变化情况，为临床用雌激素预防和治疗阿尔茨海默氏病提供实验基础。
1 材料和方法
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1.1 动物及分组 雌性SD大鼠50只，3月龄，体重190～230克(温州医学院试验动物中心提供)，均行双侧卵巢切除术，两周后，随机分成两组，每组各25只，其中一组大鼠每只隔天给予芝麻油稀释(1∶1)的苯甲酸雌二醇20μl(含苯甲酸雌二醇20μg)，另外一组大鼠每只隔天给予20μl芝麻油，于给药后1周、2周、4周分别杀死给雌激素组和给芝麻油组大鼠各5只，并用免疫组化方法检测基底前脑各部位NGFR阳性细胞。剩余的20只大鼠(给雌激素组和不给雌激素组各10只)于给药四周后用MORRIS水迷宫进行行为学检测。动物在饲养过程中，自由饮食、饮水，自然光暗周期。
1.2 基底前脑神经元NGFR免疫细胞化学染色
1.2.1 固定、取材和制备：大鼠经心腔内灌注固定后，除去颅盖，再把大鼠头部固定在江湾立体定位仪上，在前囟后约2mm处横切一刀。取出脑组织，后固定4小时后，经梯度蔗糖脱水，4℃冰箱过夜。取前部脑组织，用恒冷切片机做冠状连续切片，片厚40μm，取前囟+1.0、+0.5、+0.1、-0.2、-1.0、-1.2、-1.4的脑片。
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1.2.2 NGFR免疫细胞化学染色：使用ABC法，一抗(1∶30)由Bohring Mannheim公司提供，二抗和三抗(均为1∶200)是由Sigma公司提供。严格按中山医科大学老年性痴呆研究室的操作规程进行，DAB显色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照试验切片不加一抗孵育，其他步骤相同。
1.2.3 阳性神经元计数：胞浆有棕黄颗粒着色为阳性细胞，用放大160倍的显微镜计数：①前囟+1.0、+0.5、+0.1脑片的内侧隔核(MS)部位的全部阳性细胞。②前囟+0.5、+0.1、-0.2脑片的斜角带水平肢(HDB)部位的全部阳性细胞。③前囟-1.0、-1.2、-1.4脑片的Mynert基核(NBM)部位的全部阳性细胞。
1.3 MORRIS水迷宫检测
1.3.1 定位航行实验：MORRIS水迷宫的组成参见文献[1]。试验开始前一天将大鼠放入水池中(不含平台)自由游泳2分钟，让其熟悉迷宫环境。试验开始时，将平台置于NE象限正中，实验共4天半，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，分别将大鼠从E、S、W、N四点面向池壁放入池中，记录每次大鼠从入水池到找到平台的时间为逃避潜伏期。每次训练时间不超过2分钟，每两次训练之间让大鼠在平台上休息1分钟。
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1.3.2 空间搜索试验：第5天下午撤除平台后，将大鼠在S点面向池壁放入水中，用录像机记录120秒内大鼠在池中游泳路线。测出120秒内大鼠在各个象限内游泳路程分别占总路程的百分比。
1.4 数据统计学处理 采用SPSS软件处理，用t检验和单因素方差分析作差异显著性分析。用[(实验组均数—对照组均数)/对照组均数]×100%来表示变化百分率。
2 结果
2.1 雌激素替代不同时间对切卵巢大鼠基底前脑各部位NGFR阳性细胞数的影响见表1 MS和HDB部位的NGFR阳性神经元数分别在给雌激素2周和4周开始与对照组相比显著降低。HDB部位的NGFR阳性神经元数给雌激素组与对照组相比，在4周内差异均无显著性意义。
表1 雌激素替代1周、2周、4周对切卵巢大鼠基底前脑
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MS、HDB、NBM部位NGFR阳性神经元数的影响(
±SD)n
MS
HDB
NBM
1周
2周
4周
1周
2周
4周
1周
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2周
4周
给雌激素组
15
86.4±10.4
75.6±8.6*
66.8±7.5**
153.7±30.0
128.7±18.9
119.8±28.4
116.5±26.3
113.9±17.9
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102.3±21.0*
对照组
15
84.4±9.4
84.8±13.7
82.1±8.7
142.8±36.8
140.5±35.3
133.2±29.0
109.9±23.8
131.0±31.3
132.9±43.9
, 百拇医药
变化百分比
2.4
-10.8
-18.6
7.6
-8.4
-10.1
6.0
-13.1
-23.0
与对照组比：*P<0.05，**P<0.01
2.2 雌激素替代对切卵巢大鼠学习记忆的影响
, 百拇医药
2.2.1 定位航行试验：给雌激素组和对照组大鼠各10只经过共9个时间段的训练，都学会了寻找平台，并且随着训练次数的增加，两组大鼠平均逃避潜伏期在前4个时间段迅速缩短，自第5个时间段起，平均逃避潜伏期趋于稳定。如表2。
表2 两组大鼠在9个时间段中的逃避潜伏期的比较(
±s) 时间段给雌激素组
(n=10)
对照组
(n=10)
1
54.0±24.5
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36.5±13.8
2
31.3±10.3
23.0±11.7
3
15.8±8.1
16.4±6.9
4
20.5±8.5*
9.2±2.8
5
16.0±11.0
, 百拇医药
12.6±11.8
6
12.0±7.8
9.8±5.2
7
13.7±6.8
10.2±4.8
8
10.3±6.1
9.3±7.4
9
14.3±11.3
, 百拇医药 7.0±2.3
与对照组比：*P<0.05
把9个训练时间段分为前4个时间段和后5个时间段，分别计算两组大鼠平均逃避潜伏期见表3。从表3可见，在前4个时间段，给雌激素组的平均逃避潜伏期比对照组明显延长，差别有非常显著性意义，说明此阶段给雌激素大鼠要找到平台所花的时间比对照组多，提示给雌激素组大鼠学习获取能力比对照组差；在后5个时间段，给雌激素组的平均逃避潜伏期比对照组稍延长，但差别没有显著性意义，说明达到稳定状态后，给雌激素大鼠的空间定位能力、学习巩固和储存能力与对照组差异无显著性。
表3 两组大鼠在不同时间段平均逃避潜伏期(
±s，s)n
前四个时间段
, 百拇医药
后五个时间段
雌激素组
10
30.4±7.5**
13.2±7.7
对 照 组
10
21.3±5.3
9.8±3.1
与对照组比：**P<0.01
2.2.2 空间搜索试验：我们用数点法测出2组大鼠在各个象限游泳路程占总游泳路程的百分比并相互比较，结果如表4。结果发现两组大鼠在平台所在象限的游泳路程占总路程的百分比比其他象限显著增大，说明两组大鼠均对平台位置有良好的记忆；而大鼠在平台所在象限的游泳路程占总路程的百分比在两组之间差异无显著性(35.7%±5.7%对35.5%±6.6%，P>0.05)，说明给雌激素大鼠与对照组的短期空间记忆差异无显著性。
, 百拇医药
表4 两组大鼠120秒内在水池各象限游泳路程占总游泳
路程的百分比及相互比较(
±SD，%) 象限雌激素组(n=10)
对照组(n=10)
P
1.平台所在象限(NE)
35.7±5.7
35.5±6.6
>0.05
2.平台右侧象限(NW)
, 百拇医药
26.5±8.6
27.9±6.7
>0.05
3.平台左侧象限(SE)
20.7±8.3
20.4±7.9
>0.05
4.平台对侧象限(SW)
17.1±5.8
16.1±4.3
>0.05
F
, 百拇医药
15.1712
20.6601
P
<0.01
<0.01
各(1)∶(2)
<0.01
<0.05
象(1)∶(3)
<0.01
<0.01
限(1)∶(4)
, 百拇医药 <0.01
<0.01
间(2)∶(3)
>0.05
<0.05
比(2)∶(4)
<0.05
<0.01
较(3)∶(4)
>0.05
>0.05
3 讨论
3.1 早在70年代初，Deutsch等[2]通过动物实验发现胆碱能系统与记忆的形成和储存有关，现已证明，乙酰胆碱是记忆、学习、认知功能最重要的神经递质，因胆碱能神经元的胞体绝大部分集中于基底前脑部位，而发出长长的突起投射到海马、扣带皮质和半球外侧面，包括额叶、顶叶、枕叶和颞叶等，所以基底前脑胆碱能系统被认为与学习记忆过程密切相关。研究发现AD患者胆碱能系统的退化包括高亲和胆碱摄取能力下降，乙酰胆碱释放减少，ChAT活性下降和AchE活性下降，基底前脑ChAT和NGFR抗体标记细胞严重丢失等，这些与AD的首发症状——记忆力显著减退相符合。有报道AD患者用胆碱酯酶抑制剂发现认知行为指标改善，另外还有用乙酰胆碱(ACh)的合成前体胆碱和增加Ach释放的药物来改善胆碱功能、促进记忆的报道。因此AD发病与基底前脑胆碱能系统的退化密切相关。
, 百拇医药
先前的研究表明啮齿动物和灵长类动物的基底前脑胆碱能神经元既表达神经生长因子受体[3]，也表达雌激素核受体[4,5]，提示基底前脑既是神经生长因子靶器官，也是雌激素的靶器官，神经生长因子和雌激素及两者之间的相互作用均能影响基底前脑胆碱能神经元的功能状态。
本实验结果发现MS部位在雌激素替代2周以后、NBM部位4周以后NGFR阳性细胞数有显著性降低，HDB处随雌激素治疗时间延长，在4周内NGFR阳性细胞数有降低，但变化尚无显著性，可能HDB部位对雌激素替代无反应，也可能反应较慢，差异显著性可能会在一个月以后出现。MS、HDB部位p75NGFR阳性细胞数的减少，其原因可能有雌激素对p75NGFR间接和直接的下调作用。
Gibbs[6]提出雌激素对基底前脑胆碱能系统—神经生长因子相关系统的作用模式如下示意图：
外源性雌激素→ChAT合成↑
, 百拇医药
ChAT↑→ACh(乙酰胆碱)合成↑
ACh↑→NGFR合成↓*
NGFR合成↓→对NGF敏感性↓
对NGF敏感性↓→ChAT合成↓
ChAT合成↓→ACh合成和释放↓
注：*直接作用通过Ach与胆碱能自身受体结合而引起NGFR合成减少；间接作用通过影响NGF的合成和释放而引起NGFR合成减少。
这一作用模式中NGFR的降低起关键的调节作用，它对抗了雌激素对ChAT直接的上调作用，使胆碱能功能不致于过度上升。本实验虽然没有观察胆碱能功能，但在其他的研究中已发现给雌激素替代早期基底前脑ChAT阳性细胞数是有显著增加，随后减少达对照组水平，而NGFR阳性细胞数的减少是在ChAT阳性细胞数减少之前的[6,7]。
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雌激素替代短期内引起NGFR的减少，也可能是雌激素的直接作用的结果。研究[8]表明，暴露于雌激素，可使培养的PC12细胞trkA mRNA表达上调，而使p75NGFR mRNA表达暂时下调，提示雌激素能通过调节高、低亲和NGFR的比例而影响NGF的效果。
3.2 Morris水迷宫因其突出的优点而被广泛用于检测啮齿类动物的空间学习记忆能力。本实验用Morris水迷宫评价雌激素替代4周对切卵巢大鼠空间记忆能力和搜索策略的影响，结果发现：在9个时间段的训练中，两组大鼠均学会寻找平台，并且给雌激素组学习获得能力较对照组差，而记忆巩固能力尚无明显变化。在空间搜索实验中，给雌激素大鼠的搜索策略与对照组比较差异无显著性，说明两组大鼠的短期记忆能力也无区别。
本试验结果可能与雌激素作用的时间性有关，与本试验所示当时的神经生长因子相关系统的功能状态有关。隔天给雌激素20μg，4周时，MS和NBM部位的NGFR阳性细胞数已显著下降，可能在早期升高的胆碱能功能已被下调，至正常或偏低水平，所以学习获得能力已开始降低但尚未影响到空间记忆巩固能力和搜索策略。随治疗时间的延长，雌激素的长期作用对胆碱能功能的有利作用可能会使Morris水迷宫的各项指标获得改善。
, 百拇医药
尽管许多研究者已将雌激素列为治疗阿尔茨海默氏病的一个很有希望的药物，但其对记忆的作用的时间性和部位选择性还需进一步探讨。
参考文献
1 Richard Morris.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.J Neurosci Methods,1984,11∶47～60
2 C.A.O'Malley,R.D.Hautamaki,M.Kelley,et al.Effects of ovariectomy and estradiol benzoate on high affinity choline uptake.Ach synthesis.And release from rat cerebral cortical synaptosomes.Brain Res,1987,403∶389～392
, 百拇医药
3 武义鸣，徐慧君，金国进等.大鼠基底前脑NGF-R及CHAP免疫反应阳性神经元的分布：免疫双标法.中国组织化学与细胞化学杂志，1996，5(2)∶146～150
4 Toran Allerand CD,Miranda RC.Estrogen receptors colocalize with low-affinity nerve growth factor receptors in cholinergic neurons of the basal forebrain.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(10)∶4668～4672
5 Brown TJ,Maclusky NJ,Toran Allerand CD,et al.Characterization of 11 beta-methoxy-16 alpha-[125I]iodoestradiol binding:neuronal localization of estrogen-binding sites in the developing rat brain.Endocrinology,1989,124(5)∶2074～2088
, http://www.100md.com
6 Gibbs RB,Pfaff DW.Effects of estrogen and fimbria/fornix transection on p75NGFR and ChAT expression in the medial septum and diagonal band of Broca.Exp Neurol.，1992,116(1)∶23～39
7 Gibbs RB.Effects of estrogen on basal forebrain cholinergic neurons vary as a function of dose and duration of treatment.Brain Res,1997,757(1)∶10～16
8 Sohrabji F,Greene LA,Miranda RC,et al.Reciprocal regulation of estrogen and NGF receptors by their ligands in PC12 cells.J Neurobiol.，1994,25(8)∶974～988
(收稿：1999-07-13，修回：1999-09-16), 百拇医药