再生障碍性贫血血清抑制物诱导脐血造血细胞凋亡
作者：吴建波 俞康 沈志坚 江松福
单位：(温州医学院附属第一医院血液科，温州，325000)
关键词：再生障碍性贫血；脐血；造血干细胞；凋亡
温州医学院学报000103 摘 要：目的：研究再生障碍性贫血血清抑制物诱导人脐血造血细胞凋亡的作用。方法：提纯的再障血清抑制物加到人脐血造血细胞培养体系中，采用形态学观察及TUNNL法测定细胞凋亡。结果：20例脐血造血细胞分别与0.1μg/ml ,1μg/ml,10μg/ml的再障血清抑制蛋白组份共同培养后，凋亡细胞发现率分别为3.5±1.6%(P>0.05)，41±9.8%(P<0.01)，60.3±18.2%(P<0.01)，而对照组为2.6±1.5%。结论：再障血清抑制蛋白组分量与脐血造血凋亡细胞数量呈正相关。证明再障血清抑制蛋白组份与造成血细胞凋亡有一定的量效关系，推测造血细胞凋亡增加可能是再障发病的主要机制。
, http://www.100md.com
分类号：R556.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2138(2000)01-0008-02
Apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells induced by serum inhibitor in aplastic anemia
WU Jian-bo YU Kang SHEN Zhi-jian
(Hematology Department,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
Abstract：Objective：To study apoptosis in human umbilical cord blood hematopoietic cells induced by serum inhibitor in aplastic anemia. Methods: Purified serum inhibitor in aplastic anemia was added into culture system of umbilical cord blood hematopoietic cells and morphological change was observed.TUNNL was used to determine cell apoptosis .Results: Following culture of umbilical cord blood hematopoietic cells in 20 cases combined with serum inhibitor of aplastic anemia 0.1μg/ml, 1μg/ml,we found all apoptosis rate was respectively 3.5±1.6%(P>0.06), 41±9.8%(P<0.01), 60.3±18.2%(P<0.01), while the rate of the control group was 2.6+1.5%. Conclusion: There was a positive correlation between quantity of serum inhibition protein and the number of apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells. It is proved there was some dose-effect relationship between serum inhibition protein groups and apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells. It is suggested that the increased apoptosis of hematopoietic cells play an important role in pathogenesis of aplastic anemia.
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Key words：aplastic anemia;umbillical cord blood;hematopoietic cells；apoptosis▲
再生障碍性贫血血清中含有多种造血负性调节因子，包括TNF、IFN、 IL-2等，这些因子对造血干细胞有明显的抑制作用。尤其是提纯的部分组份蛋白的抑制作用更明显。我们也曾报道[1]再障血清的部分组份蛋白对骨髓基质细胞的抑制作用。近来研究表明，再障与造血干细胞凋亡有关。我们以重组 GM-CSF和 IL-3作为造血细胞存活因子，提取再障血清中对CFU-GM、CFU-F 抑制作用最强的蛋白组份作为诱导剂，观察对人脐血造血细胞的凋亡诱导作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象
取健康足月分娩产妇脐血20份。产妇年龄23～30岁，平均25岁。胎儿性别男女各10例。 按1987年全国再障讨论会制定标准[2]，确诊慢性再障22例，其中男14例,女 8例， 年龄16～50岁，平均38岁。
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1.2 实验材料
DMEM培养基、小牛血清(GiBco)、重组人GM-CSF、IL-3，分别为Schering- Plough公司和上海源东生物技术公司产品，Sep Genen DNA提取试剂盒为Promega公司产品，TUNNL法试剂盒为深圳晶美公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 再障血清蛋白组份的制备:取20例再障病人血清各5ml混合，用灭菌 0.39饱和度的硫酸铵沉淀血清蛋白组份。装入透析袋用蒸馏水透析24小时，过G25凝胶层析柱，用紫外分光光度计检测。收集高吸收峰洗脱液，经冷冻干燥后置深低温冰箱保存备用。
1.3.2 脐造血细胞培养：20份脐血每份各取10～15ml。分别用Ficoll法分离单个核细胞后用 DMEM培养液洗涤三次,用含10%小牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为1×106/ml。按Letem等[3]报道的方法，配置条件培养液，即 10%小牛血清+DMEM、GM-CSF 1ng/ml、IL-35ng/ml，置25ml 塑料培养瓶中(NUNALON丹麦),每瓶接种5ml单个核细胞，置二氧化碳培养箱5%CO2、37℃。培养24小时后，根据再障血清抑制蛋白浓度设置实验组及对照组；实验组加再障血清抑制蛋白。终浓度分别为0.1μg/ml(实验组Ⅰ)、1μg/ml(实验组Ⅱ)、10μg/ml(实验组Ⅲ)，对照组加等量10%小牛血清+DMEM，继续培养24小时后，收集细胞。
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1.3.3 形态学观察：收集各培养物中细胞离心后涂片干燥，用甲基绿-派诺宁染色法染色，光镜下观察凋亡细胞。固缩细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染者为凋亡细胞。凋亡指数，即随机选择20个视野约1000～2500个细胞，计数凋亡细胞百分率。
1.3.4 DNA末端标记法：收集各培养瓶中的细胞，用BPS洗涤两次，用Sep Genen DNA提取试剂盒。提取DNA紫外分光光度计定量后，置Eppendoff微量离心管中。反应体系如下：细胞DNA 1.0μg、10×buffer 2μl 32P-dATP 0.5μl，klenow 聚合酶5u双蒸水20μl 室温反应30min ，1μl 0.5mol EDTA终止，常规酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀。标记DNA在1.8%琼脂糖凝胶100V电泳约2小时放射自显影。
2 结果
TUNNL法电泳显示20例脐造血细胞与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml浓度的再障血清抑制蛋白组份作用24小时后，分别出现3/20、11/20、19/20例的DNA梯形带条结果，而对照组无一例出现DNA梯形条带。形态学观察，对照组凋亡细胞为2.6±1.5%。实验组Ⅰ凋亡细胞为3.5±1.6%，与对照组相比无差异(P>0.05)。实验组Ⅱ凋亡细胞为41±9.8%与实验组Ⅰ相比有显著差异(P<0.01)。
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实验组Ⅲ凋亡细胞百分率为60.3±18.2%与实验组Ⅱ相比亦有显著差异(P<0.01)。再障血清抑制蛋白组份与凋亡之剂量效应关系(见附图)。
附图 抑制蛋白对脐造血细胞凋亡诱导的量效关系
3 讨论
再生障碍性贫血的发病机制目前尚未完全阐明，以往有人报道再障血清能抑制正常人CFU-GM、CFU-F生长，提示了再障血清中存在抑制因子[4]。我们先前实验发现，0.39饱和度硫酸铵沉淀的再障血清蛋白组份对CFU-GM和CFU-F抑制作用最强，因此本研究选用该血清蛋白组份作为凋亡的诱导剂。再障的血清中包含了小分子蛋白及多肽类，有较多活性较高的负性造血调节因子为TNF、IFN、IL-Ⅱ等。 Selleri等[5]报道再障患者T淋巴细胞在体外表达INF-r明显增强。在长期培养中低浓度的IFN-r能抑制CFU-GM、BFU-E生长，并诱导CD34+细胞凋亡。近年认为凋亡是再障的一个主要的病理过程，尤其是不能控制的造血干细胞的凋亡程序启动，可能是引起造血衰竭的最重要原因[6]。 philpoit等[7]通过流式细胞术，发现再障患者的骨髓或外周血单个核细胞中的CD34+细胞比正常人CD34+细胞易发生凋亡。亦有报道再障骨髓中单个核细胞Fas受体表达明显高于正常人。实验表明，TNF、INF可诱使正常人骨髓CD34+细胞高表达Fas。已知Fas与FasL结合是引起细胞凋亡的重要因素之一，并推测再障患者的淋巴细胞通过直接接触或分泌某些可溶性细胞因子介导骨髓造血细胞凋亡[8]。笔者也观察到，再障血清中的抑制蛋白组份具有较强的诱导脐造血细胞凋亡作用。无论从形态学观察或DNA“梯形”断裂现象均得到到证实，并且随着抑制蛋白组份剂量的增加，凋亡细胞也逐渐增加。证明再障血清抑制蛋白组份与造血细胞的凋亡有一定的量效关系。目前认为，细胞凋亡是凋亡基因启动，抗凋亡基因抑制等一系列基因调控下的程序性死亡。而造血细胞的调亡增加可能是再障发病的主要机制。设法控制或干预凋亡基因，抗凋亡基因，阻断或抑制造成血细胞凋亡过程可望成为再障治疗研究的新特点。■
, 百拇医药
基金项目：浙江省卫生厅资助课题。
作者简介：吴建波(1963-)，男，温州医学院附属一医血液科主治医师，从事细胞生物学及分子生物学研究。
参考文献：
[1] 俞康，吴建波，王光汉等.PHA-MNCCM对慢性再障骨髓基质细胞生长影响的研究[J].中国现代医学杂志，1999,10:24-25.
[2] 第四届全国再生障碍性贫血学术会议. 再生障碍性贫血诊断标准[J].中华血液学杂志,1987, 8(8):封四..
[3] Loten J，Sachs L. Hematopoietic cells from mice deficient in wildtype p53 are more resistant to induction of apoptosis by some agents[J]. Blood, 1993,82：1092.
, 百拇医药
[4] 蒋本荣，叶根耀，浅风伟等.再生障碍性贫血发病机制的初步探讨[J].中华血液学杂志，1984,5:294.
[5] Selleri C, Maciejewski JP, Satp T，et al. Interferon-gamma constitutively expressed in the stromal microenvironment of human marrow cultures mediates potert hematopoietic inhibition[J].Blood，1996, 87(10):41-49.
[6] Laveder F, Marcolongo K. V controlled triggering of programmed cell death (apoptosis) in haematopoietie stem cells; a new hypothesis for the pathogenesis of aplastie anaemia[J].Immunol Cell Biol， 1996,74(2)：159.
, 百拇医药
[7] Philpott NJ, Scopes J, Marsh Jcw，et al. Increased apoptosis in aplastie anemia bone marrow progenitor cells: possible pathophy biologic significance[J]. Exp Hematol ， 1995,23(14)： 1642.
[8] Maciejewski JP, Selleri C, Sato T，et al. Increased expression of Fas antigen on bone marrow CD34+ cells of patients with aplastic anemia[J]. Br J Haematol，1995,91:245.
收稿日期：1999-11-28
改稿日期：2000-01-05, http://www.100md.com
单位：(温州医学院附属第一医院血液科，温州，325000)
关键词：再生障碍性贫血；脐血；造血干细胞；凋亡
温州医学院学报000103 摘 要：目的：研究再生障碍性贫血血清抑制物诱导人脐血造血细胞凋亡的作用。方法：提纯的再障血清抑制物加到人脐血造血细胞培养体系中，采用形态学观察及TUNNL法测定细胞凋亡。结果：20例脐血造血细胞分别与0.1μg/ml ,1μg/ml,10μg/ml的再障血清抑制蛋白组份共同培养后，凋亡细胞发现率分别为3.5±1.6%(P>0.05)，41±9.8%(P<0.01)，60.3±18.2%(P<0.01)，而对照组为2.6±1.5%。结论：再障血清抑制蛋白组分量与脐血造血凋亡细胞数量呈正相关。证明再障血清抑制蛋白组份与造成血细胞凋亡有一定的量效关系，推测造血细胞凋亡增加可能是再障发病的主要机制。
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分类号：R556.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2138(2000)01-0008-02
Apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells induced by serum inhibitor in aplastic anemia
WU Jian-bo YU Kang SHEN Zhi-jian
(Hematology Department,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000)
Abstract：Objective：To study apoptosis in human umbilical cord blood hematopoietic cells induced by serum inhibitor in aplastic anemia. Methods: Purified serum inhibitor in aplastic anemia was added into culture system of umbilical cord blood hematopoietic cells and morphological change was observed.TUNNL was used to determine cell apoptosis .Results: Following culture of umbilical cord blood hematopoietic cells in 20 cases combined with serum inhibitor of aplastic anemia 0.1μg/ml, 1μg/ml,we found all apoptosis rate was respectively 3.5±1.6%(P>0.06), 41±9.8%(P<0.01), 60.3±18.2%(P<0.01), while the rate of the control group was 2.6+1.5%. Conclusion: There was a positive correlation between quantity of serum inhibition protein and the number of apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells. It is proved there was some dose-effect relationship between serum inhibition protein groups and apoptosis of umbilical cord blood hematopoietic cells. It is suggested that the increased apoptosis of hematopoietic cells play an important role in pathogenesis of aplastic anemia.
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Key words：aplastic anemia;umbillical cord blood;hematopoietic cells；apoptosis▲
再生障碍性贫血血清中含有多种造血负性调节因子，包括TNF、IFN、 IL-2等，这些因子对造血干细胞有明显的抑制作用。尤其是提纯的部分组份蛋白的抑制作用更明显。我们也曾报道[1]再障血清的部分组份蛋白对骨髓基质细胞的抑制作用。近来研究表明，再障与造血干细胞凋亡有关。我们以重组 GM-CSF和 IL-3作为造血细胞存活因子，提取再障血清中对CFU-GM、CFU-F 抑制作用最强的蛋白组份作为诱导剂，观察对人脐血造血细胞的凋亡诱导作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象
取健康足月分娩产妇脐血20份。产妇年龄23～30岁，平均25岁。胎儿性别男女各10例。 按1987年全国再障讨论会制定标准[2]，确诊慢性再障22例，其中男14例,女 8例， 年龄16～50岁，平均38岁。
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1.2 实验材料
DMEM培养基、小牛血清(GiBco)、重组人GM-CSF、IL-3，分别为Schering- Plough公司和上海源东生物技术公司产品，Sep Genen DNA提取试剂盒为Promega公司产品，TUNNL法试剂盒为深圳晶美公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 再障血清蛋白组份的制备:取20例再障病人血清各5ml混合，用灭菌 0.39饱和度的硫酸铵沉淀血清蛋白组份。装入透析袋用蒸馏水透析24小时，过G25凝胶层析柱，用紫外分光光度计检测。收集高吸收峰洗脱液，经冷冻干燥后置深低温冰箱保存备用。
1.3.2 脐造血细胞培养：20份脐血每份各取10～15ml。分别用Ficoll法分离单个核细胞后用 DMEM培养液洗涤三次,用含10%小牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为1×106/ml。按Letem等[3]报道的方法，配置条件培养液，即 10%小牛血清+DMEM、GM-CSF 1ng/ml、IL-35ng/ml，置25ml 塑料培养瓶中(NUNALON丹麦),每瓶接种5ml单个核细胞，置二氧化碳培养箱5%CO2、37℃。培养24小时后，根据再障血清抑制蛋白浓度设置实验组及对照组；实验组加再障血清抑制蛋白。终浓度分别为0.1μg/ml(实验组Ⅰ)、1μg/ml(实验组Ⅱ)、10μg/ml(实验组Ⅲ)，对照组加等量10%小牛血清+DMEM，继续培养24小时后，收集细胞。
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1.3.3 形态学观察：收集各培养物中细胞离心后涂片干燥，用甲基绿-派诺宁染色法染色，光镜下观察凋亡细胞。固缩细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染者为凋亡细胞。凋亡指数，即随机选择20个视野约1000～2500个细胞，计数凋亡细胞百分率。
1.3.4 DNA末端标记法：收集各培养瓶中的细胞，用BPS洗涤两次，用Sep Genen DNA提取试剂盒。提取DNA紫外分光光度计定量后，置Eppendoff微量离心管中。反应体系如下：细胞DNA 1.0μg、10×buffer 2μl 32P-dATP 0.5μl，klenow 聚合酶5u双蒸水20μl 室温反应30min ，1μl 0.5mol EDTA终止，常规酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀。标记DNA在1.8%琼脂糖凝胶100V电泳约2小时放射自显影。
2 结果
TUNNL法电泳显示20例脐造血细胞与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml浓度的再障血清抑制蛋白组份作用24小时后，分别出现3/20、11/20、19/20例的DNA梯形带条结果，而对照组无一例出现DNA梯形条带。形态学观察，对照组凋亡细胞为2.6±1.5%。实验组Ⅰ凋亡细胞为3.5±1.6%，与对照组相比无差异(P>0.05)。实验组Ⅱ凋亡细胞为41±9.8%与实验组Ⅰ相比有显著差异(P<0.01)。
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实验组Ⅲ凋亡细胞百分率为60.3±18.2%与实验组Ⅱ相比亦有显著差异(P<0.01)。再障血清抑制蛋白组份与凋亡之剂量效应关系(见附图)。
附图 抑制蛋白对脐造血细胞凋亡诱导的量效关系
3 讨论
再生障碍性贫血的发病机制目前尚未完全阐明，以往有人报道再障血清能抑制正常人CFU-GM、CFU-F生长，提示了再障血清中存在抑制因子[4]。我们先前实验发现，0.39饱和度硫酸铵沉淀的再障血清蛋白组份对CFU-GM和CFU-F抑制作用最强，因此本研究选用该血清蛋白组份作为凋亡的诱导剂。再障的血清中包含了小分子蛋白及多肽类，有较多活性较高的负性造血调节因子为TNF、IFN、IL-Ⅱ等。 Selleri等[5]报道再障患者T淋巴细胞在体外表达INF-r明显增强。在长期培养中低浓度的IFN-r能抑制CFU-GM、BFU-E生长，并诱导CD34+细胞凋亡。近年认为凋亡是再障的一个主要的病理过程，尤其是不能控制的造血干细胞的凋亡程序启动，可能是引起造血衰竭的最重要原因[6]。 philpoit等[7]通过流式细胞术，发现再障患者的骨髓或外周血单个核细胞中的CD34+细胞比正常人CD34+细胞易发生凋亡。亦有报道再障骨髓中单个核细胞Fas受体表达明显高于正常人。实验表明，TNF、INF可诱使正常人骨髓CD34+细胞高表达Fas。已知Fas与FasL结合是引起细胞凋亡的重要因素之一，并推测再障患者的淋巴细胞通过直接接触或分泌某些可溶性细胞因子介导骨髓造血细胞凋亡[8]。笔者也观察到，再障血清中的抑制蛋白组份具有较强的诱导脐造血细胞凋亡作用。无论从形态学观察或DNA“梯形”断裂现象均得到到证实，并且随着抑制蛋白组份剂量的增加，凋亡细胞也逐渐增加。证明再障血清抑制蛋白组份与造血细胞的凋亡有一定的量效关系。目前认为，细胞凋亡是凋亡基因启动，抗凋亡基因抑制等一系列基因调控下的程序性死亡。而造血细胞的调亡增加可能是再障发病的主要机制。设法控制或干预凋亡基因，抗凋亡基因，阻断或抑制造成血细胞凋亡过程可望成为再障治疗研究的新特点。■
, 百拇医药
基金项目：浙江省卫生厅资助课题。
作者简介：吴建波(1963-)，男，温州医学院附属一医血液科主治医师，从事细胞生物学及分子生物学研究。
参考文献：
[1] 俞康，吴建波，王光汉等.PHA-MNCCM对慢性再障骨髓基质细胞生长影响的研究[J].中国现代医学杂志，1999,10:24-25.
[2] 第四届全国再生障碍性贫血学术会议. 再生障碍性贫血诊断标准[J].中华血液学杂志,1987, 8(8):封四..
[3] Loten J，Sachs L. Hematopoietic cells from mice deficient in wildtype p53 are more resistant to induction of apoptosis by some agents[J]. Blood, 1993,82：1092.
, 百拇医药
[4] 蒋本荣，叶根耀，浅风伟等.再生障碍性贫血发病机制的初步探讨[J].中华血液学杂志，1984,5:294.
[5] Selleri C, Maciejewski JP, Satp T，et al. Interferon-gamma constitutively expressed in the stromal microenvironment of human marrow cultures mediates potert hematopoietic inhibition[J].Blood，1996, 87(10):41-49.
[6] Laveder F, Marcolongo K. V controlled triggering of programmed cell death (apoptosis) in haematopoietie stem cells; a new hypothesis for the pathogenesis of aplastie anaemia[J].Immunol Cell Biol， 1996,74(2)：159.
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[7] Philpott NJ, Scopes J, Marsh Jcw，et al. Increased apoptosis in aplastie anemia bone marrow progenitor cells: possible pathophy biologic significance[J]. Exp Hematol ， 1995,23(14)： 1642.
[8] Maciejewski JP, Selleri C, Sato T，et al. Increased expression of Fas antigen on bone marrow CD34+ cells of patients with aplastic anemia[J]. Br J Haematol，1995,91:245.
收稿日期：1999-11-28
改稿日期：2000-01-05, http://www.100md.com