ALL病人P16基因的失活与mRNA表达的关系
作者：张君丽 吴建波 谭映霞
单位：(温州医学院附属第一医院血液科，温州，325000)
关键词：白血病；急性淋巴细胞性白血病；P16 基因；纯合缺失；高度甲基化；mRNA表达
温州医学院学报000102
摘 要：目的：探讨ALL 和各亚型中 P16 基因失活和纯合缺失的发生率及mRNA 表达。 方法：对40例ALL (B-ALL28例，T-ALL7例，前B-ALL5例)和15例对照组骨髓标本，采用PCR 法检测P16 基因的纯合缺失，REP 法检测P16 基因的高度甲基化， RT-Nest-PCR 法检测其mRNA的表达。结果：ALL P16 基因高度甲基化或纯合缺失发生率为80%，而对照组无一例P16基因失活；T-ALL 中P16 基因纯合缺失高于高度甲基化 ；B-ALL 中高度甲基化多于纯合缺失。5例P16 基因高度甲基化尚有mRNA表达，其余均无表达。结论：P16 基因的异常是 ALL 的主要发病机制之一。T-ALL P16 基因的纯合缺失为主要表现，而B-ALL P16 的高度甲基化为主要表现。同时，无论P16 基因纯合缺失或高度甲基化，均能高度抑制mRNA 的表达。
, http://www.100md.com
分类号：R557+4 文献标识码：A
文章编号：1000-2138 (2000) 01-0005-03
The relationship between P16 gene inactivation and expression of mRNA in ALL
ZHANG Jun-li WU Jian-bo TAN Ying-xia.
(Department of Hematology and Medical Science Institute,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,325000)
Abstract：Objective：To explore incidence of P16 gene inactivation and homozygous deletion and the expression of mRNA in ALL and various subtypes. Methods：The homozygous delete of P16 gene was determinated by PCR,hypermethylation by REP and the expression of P16 gene by RT-Nest-PCR .Results：In ALL, the incidence of P16 hypermethylation or homozygous deletion is 80%,there is no abnormal in control. In T-ALL, homozygous delete of P16 gene is more common than hypermethylation. In B-ALL, hypermethylation of P16 gene is higher than homozygous deletion.Hypermethylation mRNA expression exists in 5 cases with P16 gene,but not in the others. Conclusion：Abnormal P16 gene is the main pathogenesis in ALL. In T-ALL, P16 gene homozygous delete is predominant epitope, and in B-ALL, however, hypermethylation of P16 gene is predominant presentation. Meanwhile both homozygous deletion and hypermethylation of P16 gene can strongly inhibit mRNA expression.
, 百拇医药
Key words：leukemia; acute lymphatic leukemia; P16 gene; homozygous deletion hypermethylation; expression of mRNA▲
急性淋巴细胞性白血病(ALL)病人有多种染色体异常，使靶基因的不稳定性增加，导致癌基因的激活或抑癌基因的失活，多数病人可表现为P16基因的失活。笔者等观察了40例初诊的ALL，旨在探讨P16基因失活和缺失及mRNA的表达情况。
1 病例和方法
1.1 临床资料
1.1.1 40例初诊病人经细胞形态学、细胞免疫学分型确诊[1]。其中B-ALL 28例，T-ALL 7例，前B-ALL 5例。病人年龄6个月～41岁，0～13岁22例，14～20岁12例，20～41岁6例。全部样本均取自化疗前骨髓。正常对照取自非恶性病的缺铁性贫血病人，共15例。
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1.1.2 主要试剂：蛋白酶 K (Sigma)、Trizol 总 RNA 提取试剂盒(Gibco BRL)、MML-V 逆转录酶 (Cibco BRL)、Taq 酶 (Promega)、限制性内切酶HpaⅡ、KSPⅠ(Promega)、dNTPs(pharmacia), 引物[2,3]由北京赛百盛生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取：酚-氯仿-异戊醇一步法抽提DNA；总RNA的提取：采用Trizol试剂盒快速提取总RNA。
1.2.2 PCR 检测P16基因的纯合缺失。
P16 外显子1
正义链 5′-GGGAGCAGCATGGAGCCG-3 ′
, 百拇医药
反义链 5′-AGTCGCCCGCCATCCCCT-3 ′
P16 外显子2
正义链 5′-CTGGCTCTGACCATTCTGT-3 ′
反义链 5′-AGCACCACCGCAGCGTGTGC-3 ′
PCR 的反应体系为：100ng DNA、2UTaq酶、10×缓冲液5μL、4×dNTPs 4μL、MgCL2 3μL、引物各50pmol，加无菌去离子水至50μL。95℃ 5分钟热变性后，然后94℃ 1分钟、58℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果观察：7.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染观察结果。 P16外显子1的扩增产物为203bp,P16外显子2的扩增产物为171bp。
, 百拇医药
1.2.3 REP检测P16基因外显子1甲基化：
P16外显子1
正义链 5 ′-GGGAGCAGCATGGAGCCG-3 ′
反义链 5 ′-GTGGATCGGCCTCCGACCGTA-3 ′
将目的DNA 分别用水过量的甲基化敏感酶HpaⅡ、KSPⅠ在25℃循环水浴中过夜，扩增时除延伸温度由58℃改为57℃外，其余条件和方法均同1.2.2。用未经内切酶消化的DNA作阳性对照，用缺铁性贫血病人DNA作正常对照，扩增产物为150bp。如果经HpaⅡ或KSPⅠ消化后的DNA仍能扩增出P16外显子1产物，则认为该病人P16基因有高度甲基化。
1.2.4 RT-PCR 分析P16基因mRNA的表达[3]：
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逆转录引物 5 ′-AGGACCTTCGGTGACTGAT-3 ′
第一次PCR引物，正义链 5′-CAGCATGGAGCCTTCGG-3′；反义链 5′-TCTAAGTTTCCCGAGGTTTC-3′。第二次PCR 引物，正义链 5′-CTGACTGGCTGGCCACGGCC-3′；反义链 5′-TCAGAGCCTCTCTGGTTCTT-3 ′。
RT-nest-PCR：
用常规的RT方法获得cDNA。
第一次PCR：反应体系加逆转录产物5μl,第一次PCR引物各50pmol，其余均同1.2.3，扩增条件为96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟，共40个循环。
第二次PCR：取第一次PCR产物lμl，第二次PCR引物各50pmol,其余均同1.2.2，扩增条件同上。扩增产物为336bp.
, 百拇医药
2 结果
2.1 ALL中，40例出现P16基因高度甲基化纯合缺失共32例，发生率80%。对照组均无出现P16基因的异常。
2.2 P16基因的纯合缺失：40例 ALL 有P16基因纯合缺失12例，占30%。B-ALL的28例中P16基因的纯合缺失6例，占21.4%；7例T-ALL P16基因的纯合缺失4例，占57.1%。前B-ALL5例中P16基因缺失2例，占40%。
2.3 P16 基因甲基化的研究：40例ALL中P16基因甲基化20例，占50%。B-ALL 28例中发生甲基化16例，占57.1%。7例T-ALL有2例甲基化，占28.6%。5例前B-ALL有2例甲基化，占40.0%。
2.4 P16 基因失活与mRNA的关系：我们采用RT-nest PCR 发现，40例ALL病人中mRNA表达率为32.5%(13/40)。8例P16基因未失活者有7例有表达，12例纯合缺失的病人仅有1例mRNA表达，20例甲基化的病人有5例有mRNA表达。
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3 讨论
急性淋巴细胞白血病中P16基因的失活主要表现为纯合缺失和高度甲基化，而点突变的频率相对较低。
我们采用PCR法检测了P16外显子1和P16外显子2，发现T-ALL的纯合缺失率较高，占57.1%；而B-ALL的缺失率相对较低，占21.4%；前B-ALL由于例数太少，无法作比较。O hnishi 等[4]报道有22% B-ALL初诊病人P16基因纯合缺失，而T-ALL可高达50%以上。我们的研究结果与之相符。P16基因的纯和缺失与ALL的复发有十分密切的关系。这些改变可导致细胞的有序增殖紊乱，加快肿瘤细胞从G1→S期，从而影响了疾病的预后，增加了复发率和难治性。Kelly W.malony等[5]报道，14例小儿ALL病人初诊时有4例P16基因纯和缺失者，均有复发，且复发时P16基因仍无表达。Ogawa[6]也认为至少有2/3以上的ALL病人在初诊和复发期间有P16基因的纯合缺失。P16基因纯合缺失与疾病的预后关系有待我们进一步研究。
, 百拇医药
我们采用了甲基化敏感性限制酶 HpaⅡ、KspⅠ消化急性淋巴细胞白血病病人的DNA双链，发现除P16基因纯合缺失的12例外，剩余28例有20例发生高度甲基化，而正常对照组无一例甲基化，这进一步说明了高度甲基化是ALL P16基因失活的主要原因。28例B-ALL的病人有16例发生了甲基化，占57.1%，故在B-ALL的病人中P16基因的失活以甲基化为主。20例P16基因甲基化的病人中，仅有5例病人有mRNA的表达，说明基因高度甲基化是导致基因转录失败的敏感因素之一。这5例病人有mRNA的表达，是否因为P16基因甲基化程度的不同和病人的转录调控的个体差异引起，我们还需作进一步研究。还有1例病人P16基因既未发生纯合缺失也未出现高度甲基化，但没有mRNA的表达，推测可能是其它形式的基因突变或非细胞遗传学因素造成。P16基因失活可导致基因的转录异常，可直接影响P16蛋白的表达。有人[7]用Western blot检测20例P16基因失活的儿童ALL发现有18例P16蛋白无表达。但对这些病人骨髓细胞去甲基化诱导后，16例重新表达P16蛋白，说明ALL病人P16基因失活主要是因为P16基因寂静子的高度甲基化。目前，临床上已有用一些去甲基化的药物治疗ALL，并取得一定的疗效，进一步说明了P16基因失活在ALL的病程和预后中扮演了重要的角色。
, 百拇医药
总之，无论是P16基因纯合缺失还是高度甲基化，均能使mRNA表达障碍，但目前对于ALL病人是如何引起P16基因调节通路的异常，尚需做进一步的研究。■
基金项目：浙江省卫生厅科研基金课题(98B065)
作者简介：张君丽(1946-)，女，温州医学院附属第一医院血液科副主任医师。
参考文献：
[1] 张之南主编.血液病诊断及疗效标准 [M].第2版.北京科学出版社，1998.
[2] Chaubert P,Guillou L,Kurt Am,et al. Frequent P16 INK4(MTSl) gene inactivation in testicular germ cell tumors[J]. Am J Pathol, 1997,151：859.
, 百拇医药
[3] Ogawa S, Idrrano N, Sato N,et al. Homozgous loss of the cycilin-dependent kinase 4-inhibitor (P16) gene in human leukemias [J]. Bood, 1994,84(8)：2431-2435.
[4] Ohnishi H, Kawamura M,Ida K,et al. Homozygous deletions of P16/MTSl gene are frequent in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1995,86：1269.
[5] Kelly W Maloney,Loris McGavran, Lorrie F Odom,et al. Acquistion of P16 INK4 and P16 INK4B gene abnormalities between initial diagnosis and relapse in children with acute leukemia [J]. Blood，1999，93：2380.
, http://www.100md.com
[6] Ogawa s,Idargaishi A, Miyawalci s,et al. Loss of the cyclin-dependent kinase 4-inhibitor (P16 MTS) gene is frequent in and highly specific to lymphoid tumors in primary human hematopoietic malignancies [J]. Blood 1995,86：1548.
[7] Nakamure-M,Sugita K, Inukai T,et al. P16/MTSl/INK4A gene is frequently inactivation by hypermethylation in childhood acute lymphoblastic leukemia with 11q23 translocation[J]. Leukemia, 1999,13(6)：884.
收稿日期：1999-11-29
改稿日期：1999-12-29, 百拇医药
单位：(温州医学院附属第一医院血液科，温州，325000)
关键词：白血病；急性淋巴细胞性白血病；P16 基因；纯合缺失；高度甲基化；mRNA表达
温州医学院学报000102
摘 要：目的：探讨ALL 和各亚型中 P16 基因失活和纯合缺失的发生率及mRNA 表达。 方法：对40例ALL (B-ALL28例，T-ALL7例，前B-ALL5例)和15例对照组骨髓标本，采用PCR 法检测P16 基因的纯合缺失，REP 法检测P16 基因的高度甲基化， RT-Nest-PCR 法检测其mRNA的表达。结果：ALL P16 基因高度甲基化或纯合缺失发生率为80%，而对照组无一例P16基因失活；T-ALL 中P16 基因纯合缺失高于高度甲基化 ；B-ALL 中高度甲基化多于纯合缺失。5例P16 基因高度甲基化尚有mRNA表达，其余均无表达。结论：P16 基因的异常是 ALL 的主要发病机制之一。T-ALL P16 基因的纯合缺失为主要表现，而B-ALL P16 的高度甲基化为主要表现。同时，无论P16 基因纯合缺失或高度甲基化，均能高度抑制mRNA 的表达。
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分类号：R557+4 文献标识码：A
文章编号：1000-2138 (2000) 01-0005-03
The relationship between P16 gene inactivation and expression of mRNA in ALL
ZHANG Jun-li WU Jian-bo TAN Ying-xia.
(Department of Hematology and Medical Science Institute,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,325000)
Abstract：Objective：To explore incidence of P16 gene inactivation and homozygous deletion and the expression of mRNA in ALL and various subtypes. Methods：The homozygous delete of P16 gene was determinated by PCR,hypermethylation by REP and the expression of P16 gene by RT-Nest-PCR .Results：In ALL, the incidence of P16 hypermethylation or homozygous deletion is 80%,there is no abnormal in control. In T-ALL, homozygous delete of P16 gene is more common than hypermethylation. In B-ALL, hypermethylation of P16 gene is higher than homozygous deletion.Hypermethylation mRNA expression exists in 5 cases with P16 gene,but not in the others. Conclusion：Abnormal P16 gene is the main pathogenesis in ALL. In T-ALL, P16 gene homozygous delete is predominant epitope, and in B-ALL, however, hypermethylation of P16 gene is predominant presentation. Meanwhile both homozygous deletion and hypermethylation of P16 gene can strongly inhibit mRNA expression.
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Key words：leukemia; acute lymphatic leukemia; P16 gene; homozygous deletion hypermethylation; expression of mRNA▲
急性淋巴细胞性白血病(ALL)病人有多种染色体异常，使靶基因的不稳定性增加，导致癌基因的激活或抑癌基因的失活，多数病人可表现为P16基因的失活。笔者等观察了40例初诊的ALL，旨在探讨P16基因失活和缺失及mRNA的表达情况。
1 病例和方法
1.1 临床资料
1.1.1 40例初诊病人经细胞形态学、细胞免疫学分型确诊[1]。其中B-ALL 28例，T-ALL 7例，前B-ALL 5例。病人年龄6个月～41岁，0～13岁22例，14～20岁12例，20～41岁6例。全部样本均取自化疗前骨髓。正常对照取自非恶性病的缺铁性贫血病人，共15例。
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1.1.2 主要试剂：蛋白酶 K (Sigma)、Trizol 总 RNA 提取试剂盒(Gibco BRL)、MML-V 逆转录酶 (Cibco BRL)、Taq 酶 (Promega)、限制性内切酶HpaⅡ、KSPⅠ(Promega)、dNTPs(pharmacia), 引物[2,3]由北京赛百盛生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取：酚-氯仿-异戊醇一步法抽提DNA；总RNA的提取：采用Trizol试剂盒快速提取总RNA。
1.2.2 PCR 检测P16基因的纯合缺失。
P16 外显子1
正义链 5′-GGGAGCAGCATGGAGCCG-3 ′
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反义链 5′-AGTCGCCCGCCATCCCCT-3 ′
P16 外显子2
正义链 5′-CTGGCTCTGACCATTCTGT-3 ′
反义链 5′-AGCACCACCGCAGCGTGTGC-3 ′
PCR 的反应体系为：100ng DNA、2UTaq酶、10×缓冲液5μL、4×dNTPs 4μL、MgCL2 3μL、引物各50pmol，加无菌去离子水至50μL。95℃ 5分钟热变性后，然后94℃ 1分钟、58℃ 1分钟、72℃ 1分钟共30个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果观察：7.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染观察结果。 P16外显子1的扩增产物为203bp,P16外显子2的扩增产物为171bp。
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1.2.3 REP检测P16基因外显子1甲基化：
P16外显子1
正义链 5 ′-GGGAGCAGCATGGAGCCG-3 ′
反义链 5 ′-GTGGATCGGCCTCCGACCGTA-3 ′
将目的DNA 分别用水过量的甲基化敏感酶HpaⅡ、KSPⅠ在25℃循环水浴中过夜，扩增时除延伸温度由58℃改为57℃外，其余条件和方法均同1.2.2。用未经内切酶消化的DNA作阳性对照，用缺铁性贫血病人DNA作正常对照，扩增产物为150bp。如果经HpaⅡ或KSPⅠ消化后的DNA仍能扩增出P16外显子1产物，则认为该病人P16基因有高度甲基化。
1.2.4 RT-PCR 分析P16基因mRNA的表达[3]：
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逆转录引物 5 ′-AGGACCTTCGGTGACTGAT-3 ′
第一次PCR引物，正义链 5′-CAGCATGGAGCCTTCGG-3′；反义链 5′-TCTAAGTTTCCCGAGGTTTC-3′。第二次PCR 引物，正义链 5′-CTGACTGGCTGGCCACGGCC-3′；反义链 5′-TCAGAGCCTCTCTGGTTCTT-3 ′。
RT-nest-PCR：
用常规的RT方法获得cDNA。
第一次PCR：反应体系加逆转录产物5μl,第一次PCR引物各50pmol，其余均同1.2.3，扩增条件为96℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟，共40个循环。
第二次PCR：取第一次PCR产物lμl，第二次PCR引物各50pmol,其余均同1.2.2，扩增条件同上。扩增产物为336bp.
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2 结果
2.1 ALL中，40例出现P16基因高度甲基化纯合缺失共32例，发生率80%。对照组均无出现P16基因的异常。
2.2 P16基因的纯合缺失：40例 ALL 有P16基因纯合缺失12例，占30%。B-ALL的28例中P16基因的纯合缺失6例，占21.4%；7例T-ALL P16基因的纯合缺失4例，占57.1%。前B-ALL5例中P16基因缺失2例，占40%。
2.3 P16 基因甲基化的研究：40例ALL中P16基因甲基化20例，占50%。B-ALL 28例中发生甲基化16例，占57.1%。7例T-ALL有2例甲基化，占28.6%。5例前B-ALL有2例甲基化，占40.0%。
2.4 P16 基因失活与mRNA的关系：我们采用RT-nest PCR 发现，40例ALL病人中mRNA表达率为32.5%(13/40)。8例P16基因未失活者有7例有表达，12例纯合缺失的病人仅有1例mRNA表达，20例甲基化的病人有5例有mRNA表达。
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3 讨论
急性淋巴细胞白血病中P16基因的失活主要表现为纯合缺失和高度甲基化，而点突变的频率相对较低。
我们采用PCR法检测了P16外显子1和P16外显子2，发现T-ALL的纯合缺失率较高，占57.1%；而B-ALL的缺失率相对较低，占21.4%；前B-ALL由于例数太少，无法作比较。O hnishi 等[4]报道有22% B-ALL初诊病人P16基因纯合缺失，而T-ALL可高达50%以上。我们的研究结果与之相符。P16基因的纯和缺失与ALL的复发有十分密切的关系。这些改变可导致细胞的有序增殖紊乱，加快肿瘤细胞从G1→S期，从而影响了疾病的预后，增加了复发率和难治性。Kelly W.malony等[5]报道，14例小儿ALL病人初诊时有4例P16基因纯和缺失者，均有复发，且复发时P16基因仍无表达。Ogawa[6]也认为至少有2/3以上的ALL病人在初诊和复发期间有P16基因的纯合缺失。P16基因纯合缺失与疾病的预后关系有待我们进一步研究。
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我们采用了甲基化敏感性限制酶 HpaⅡ、KspⅠ消化急性淋巴细胞白血病病人的DNA双链，发现除P16基因纯合缺失的12例外，剩余28例有20例发生高度甲基化，而正常对照组无一例甲基化，这进一步说明了高度甲基化是ALL P16基因失活的主要原因。28例B-ALL的病人有16例发生了甲基化，占57.1%，故在B-ALL的病人中P16基因的失活以甲基化为主。20例P16基因甲基化的病人中，仅有5例病人有mRNA的表达，说明基因高度甲基化是导致基因转录失败的敏感因素之一。这5例病人有mRNA的表达，是否因为P16基因甲基化程度的不同和病人的转录调控的个体差异引起，我们还需作进一步研究。还有1例病人P16基因既未发生纯合缺失也未出现高度甲基化，但没有mRNA的表达，推测可能是其它形式的基因突变或非细胞遗传学因素造成。P16基因失活可导致基因的转录异常，可直接影响P16蛋白的表达。有人[7]用Western blot检测20例P16基因失活的儿童ALL发现有18例P16蛋白无表达。但对这些病人骨髓细胞去甲基化诱导后，16例重新表达P16蛋白，说明ALL病人P16基因失活主要是因为P16基因寂静子的高度甲基化。目前，临床上已有用一些去甲基化的药物治疗ALL，并取得一定的疗效，进一步说明了P16基因失活在ALL的病程和预后中扮演了重要的角色。
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总之，无论是P16基因纯合缺失还是高度甲基化，均能使mRNA表达障碍，但目前对于ALL病人是如何引起P16基因调节通路的异常，尚需做进一步的研究。■
基金项目：浙江省卫生厅科研基金课题(98B065)
作者简介：张君丽(1946-)，女，温州医学院附属第一医院血液科副主任医师。
参考文献：
[1] 张之南主编.血液病诊断及疗效标准 [M].第2版.北京科学出版社，1998.
[2] Chaubert P,Guillou L,Kurt Am,et al. Frequent P16 INK4(MTSl) gene inactivation in testicular germ cell tumors[J]. Am J Pathol, 1997,151：859.
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[3] Ogawa S, Idrrano N, Sato N,et al. Homozgous loss of the cycilin-dependent kinase 4-inhibitor (P16) gene in human leukemias [J]. Bood, 1994,84(8)：2431-2435.
[4] Ohnishi H, Kawamura M,Ida K,et al. Homozygous deletions of P16/MTSl gene are frequent in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood,1995,86：1269.
[5] Kelly W Maloney,Loris McGavran, Lorrie F Odom,et al. Acquistion of P16 INK4 and P16 INK4B gene abnormalities between initial diagnosis and relapse in children with acute leukemia [J]. Blood，1999，93：2380.
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[6] Ogawa s,Idargaishi A, Miyawalci s,et al. Loss of the cyclin-dependent kinase 4-inhibitor (P16 MTS) gene is frequent in and highly specific to lymphoid tumors in primary human hematopoietic malignancies [J]. Blood 1995,86：1548.
[7] Nakamure-M,Sugita K, Inukai T,et al. P16/MTSl/INK4A gene is frequently inactivation by hypermethylation in childhood acute lymphoblastic leukemia with 11q23 translocation[J]. Leukemia, 1999,13(6)：884.
收稿日期：1999-11-29
改稿日期：1999-12-29, 百拇医药