IL-2、TNF-α、IFN-α对造血细胞及造血微环境的影响
作者：沈树红 王海侬 阮积晨 李原 章佳珠
单位：(温州医学院附属育英儿童医院，浙江 温州 325027)
关键词：白细胞介素-2；肿瘤坏死因子-α；干扰素-α；造血细胞；造血微环境
温州医学院学报000213 [摘 要] 目的:研究IL-2、TNF-α和IFN-α在激活骨髓细胞抗肿瘤活性的同时对造血细胞和造血微环境的影响。 方法和结果:IL-2、TNF-α和IFN-α以不同组合作用于标本，发现造血细胞(CFU-GM)和CFU-F形成率：IL-2组为60.58±10.12，10.25±3.89；IL-2+IFN-α组为42.58±8.26，37.85±10.31；IL-2+IFN-α+TNF-α组为35.17±5.92，58.31±19.19；IL-2+TNF-α为30.16±4.36，43.00±13.90；TNF-α组为40.16±9.73，41.75±13.28；对照组70.33±12.92，35.00±11.60，除IL-2+IFN-α组的CFU-F外，P均<0.01；而基质细胞对CFU-Blast的支持率分别为20.33±7.80，26.58±8.51，36.83±8.49，36.92±7.11，33.00±6.78，21.90±7.35，除IL-2组外P均<0.01。 结论:IFN-α、TNF-α对CFU-GM有一定抑制作用，而对FU-F以及基质细胞对造血的支持作用有一定的促进作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R331.2 [文献标识码] A [文章编号] 1000-2138(2000)02-0121-03
Effects of IL-2,IFN-α and TNF-α on hematopoietic progenitor and hematopoietic environment
HEN Shu-hong WANG Hai-nong RUAN Ji-chen
(Yu ying children's hospital of WenZhou medical collage 325027)
Abstract： Objective：To study the effects IL-2,IFN-α and TNF-α on hematopoietic progenitor and hematopoietic environment while activating anti-neoplasm activity.Methods and Results：Treated by IL-2,IFN-α and TNF-α in different combinations,the number of CFU-GM and CFU-F was:group IL-2 60.58±10.12 and 10.25±3.89;group IL-2+IFN-α 42.58±8.26 and 37.85±10.31; group IL-2+IFN-α+TNF-α 35.17±5.92 and 58.33±19.19；group IL-2+TNF-α 30.16±4.36 and 43±13.9; group TNF-α 40.16±9.73 and 41.75±13.28；contol 70.33±12.92 and 35±11.6 respectively.All were P<0.01 except CFU-F in group IL-2+IFN-α.The capacity of stromal cells supporting CFU-Blast was 20.33±7.8,26.58±8.51，36.83±8.49，36.92±7.11，33±6.78 and 21.9±7.35.All were P<0.01 except group IL-2.Conclusion：IFN-α and TNF-α may inhibit hematopoietic progenitor(CFU-GM) to some degree but stimulate CFU-F and improve stromal cells supporting hematopoiet.
, 百拇医药
Key words： interleukine-2;tumor necrosis factor-α;interferon-α;hematopoietic progenitor;hematopoietic environment
IL-2可以激活外周血细胞和骨髓细胞，使其具有杀伤肿瘤细胞作用，这是一种非主要组织相容性抗原限制性细胞毒作用，利用这一细胞毒作用可使白血病骨髓在体外得到净化。而其他一些细胞因子如IFN-α，IFN-γ，TNF-α，可以增强这种细胞毒作用，但同时这些细胞因子的作用又能影响正常造血细胞的生长。然而这种影响是否有意义各家说法不一，我们就此进行了进一步的研究，此外我们还就它们对造血微环境的影响进行了研究并报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 骨髓细胞采自本院确诊为特发性血小板减少性紫癜8例和缺铁性贫血病人4例，共12例，年龄2～12岁，其中男5例，女7例。重组IFN-α为美国先灵葆雅公司产品，IL-2为军事医学科学院生化制药厂产品，TNF-α为温州复旦生物制品厂产品，以上试剂均用RPMI-1640配制分装于-70℃冻存。
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1.2 方法标本处理 骨髓细胞常规分离单个核细胞(MNC)，分别加入IL-2、IFN-α、TNF-α，使各成分的终浓度分别为MNC2×106/ml，IL-2 1000IU/ml，IFN-α 1000IU/ml，TNF-α 100IU/ml。于6孔板内，1毫升/孔，置37℃，5.0%CO2，饱和湿度下培养3天后作CFU-GM、CFU-F培养。
1.2.1 CFU-GM和CFU-F培养：上述处理的6孔板用RPMI 1640充分冲洗，其中悬浮细胞洗涤后常规作CFU-GM培养。粘附细胞按以前建立的方法作CFU-F培养[1]。
1.2.2 基质细胞支持造血作用：培养体系和CFU-F培养相同，接种于24孔板内，接种时不加细胞因子，每周换液两次，直到基质细胞铺满24孔板底面后加入IL-2、TNF-α和IFN-α，浓度同上。24小时后去上清液，加入MNC 1×106/ml，静置2小时后除去悬浮细胞，加入同样的完全培养基(含0.3%琼脂)1周后计数集落，即CFU-Blast[1]。
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1.2.3 统计处理：采用配对资料的t检验。
2 结果
细胞因子对造血祖细胞的影响见表1，对造血微环境的影响见表2。
表1 IL-2、TFN-α、TNF-α对GFU-GM的影响(n=12) 细胞因子
CFU-GM
(CFU/105MNC)
回收率(%)
IL-2
60.58±10.12**
86.14
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IL-2+IFN-α
42.58±8.26**
60.54
IL-2+IFN-α+TNF-α
35.17±5.92**
50.00
IL-2+TNF-α
30.16±4.36**
42.88
TNF-α
40.16±9.73**
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57.10
对照组
70.33±12.92
—
与对照组相比：** P<0.01表2 IL-2、IFN-α、TNF-α对CFU-F及支持造血作用的影响(n=12) 细胞因子
CFU-F(CFU/2×106NM)
CFU-Blast
(CFU/106MNC)
IL-2
10.25± 3.81**
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20.33±7.80
IL-2+IFN-α
37.85±10.31**
26.58±8.51**
IL-2+IFN-α+TNF-α
58.33±19.19**
36.83±8.49**
L-2+TNF
43.00±13.90**
36.92±7.11**
, 百拇医药
TNF
41.75±13.28**
33.00±6.78**
对照组
35.00±11.60
21.90±7.35
与对照组相比：** P<0.01
3 讨论
已有许多学者用细胞因子来激活骨髓，使其具有杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到体外净化自身骨髓或使回输骨髓具有移植物抗白血病作用，提高自体骨髓移植的治疗作用。但骨髓移植的成功与否，首先是建立在造血多能干细胞在骨髓微环境中植入的基础上，这种植入又和造血细胞本身以及造血微环境包括基质细胞和细胞外基质有关。已有文献报道，IL-2、IFN-α、TNF-α单独使用或联合作用可以使造血细胞受到不同程度的抑制[2，3]，但由于细胞因子的来源、剂量、作用时间，以及培养体系的不同，结果也不尽相同，甚至，统计方法的不同结果也有所不同。李氏[2]认为IFN-α和IL-2合用对CFU-GM无明显抑制作用，他们用的是非配对资料的统计方法。我们对研究结果作统计分析时发现，若用随机分组资料均数的t检验，只有IL-2+INF-α和IL-2+IFN-α+TNF-α两组有明显的抑制作用(P<0.05和P<0.01)，和文献的结果相似。尽管如此，这样的代价是值得的，因为大多数研究显示，细胞因子的联合应用对激活骨髓中的抗肿瘤细胞活性有明显的协同作用[2～5]，IL-2+IFN-α的净化作用即可达2个对数级，而造血细胞的减少不到50.0%。而且有作者认为联合应用IL-2和IFN较单用IFN对造血细胞的抑制作用还要小[2]。这些都说明细胞因子体外净化自体骨髓时造成的对造血细胞的副作用是可以忍受的。
, 百拇医药
而且，我们进一下研究还发现，这些细胞因子对CFU-F的作用几乎完全相反。尤其TNF-α和IFN-α的加入，不但没使CFU-F生成受抑制，反而对其有明显的促进作用，而且受细胞因子作用的基质细胞对造血细胞的支持作用也有明显提高。这可能和TNF以及IFN有刺激基质细胞生成粘附分子以及使细胞外基质增加有关。已有实验证明，TNF-α和IFN-α可以使基质细胞增加VCAM-1、I-CAM-1等粘附分子的表达[6]，而CFU-Blast(CD34+，CD33-，HLA-DR-)表达VCAM-1的受体VLA-4。CFU-Blast主要是通过CAM-1/VAL-4之间的相互作用而粘附到基质细胞上，并得到基质细胞的支持而生长、增殖[7，8]，所以IFN和TNF不但使CFU-F增加，而且CFU-Blast形成也增加。由于IL-2可以CSF-GM使合成增加，而IFN和TNF则使CSF-GM表达减少，那么细胞因子引起的造血细胞的定居增加，基质细胞和造血细胞之间的相互作用增强，细胞因子对造血细胞的抑制作用以及它们对集落刺激因子生成的调控作用共同影响了造血微环境对造血细胞的支持作用。但在体外作CFU-Blast时，应先洗去了这些细胞因子，而自体骨髓移植时，回输的细胞因子很快被稀释和代谢，作用也很快消失。基质细胞对细胞因子的这一反应可以使其回巢加快，更早地促使在预处理中受损的造血微环境得到修复并使造血细胞定居增多，从而或多或少地抵消了细胞因子本身对造血细胞的抑制作用。
, 百拇医药
基金项目：浙江省卫生厅科研基金资助项目(1994)
作者简介：沈树红(1963-)，男，浙江象山人，硕士，主治医师，主要研究方向：血液学及肿瘤学。
参考文献
[1] 沈树红，林宝爵，夏学鸣，等.高温联合普鲁卡因体外净化急性髓细胞白血病骨髓及其优化[J].温州医学院学报，1997，7：1.
[2] 李成文，严文伟，郝玉书，等.IFN-α、IL-2联合IL-2激活的骨髓净化K562细胞的实验研究[J].中华血液学杂志，1996，17：518.
[3] Dickiinson AM,Middleton SL,Latham J,et al.Cytokine treatment of human bone marrow actives anti-leukemia effector cells:monitoring of purging by polymerase chain reaction and DNA analysis[J].Leukemia,1995,9:44.
, 百拇医药
[4] Charak BS,Agah R,Gray D,et al.Interaction of various cytok-
ines with interleukin-2 in the generation of kiler cells from human bone marrow:application in purging of leukemia[J].Leukemia Reserch,1991,15,801.
[5] Teichman TV,Luding WP,Thiel E.Cytotoxicity of interleuki-
n-2 induced lymphokine-activated killer(LAK) cells against human leukemia and augmentation of killing by interferons and tumor necrosis factor[J].Leuk Res,1992,16:187.
, 百拇医药
[6] Bendall LJ,Kortlepel K,Gotllieb DJ.Bone marrow fibroblast
exposure to the inflammatory cytokine tumor necrosis factor-α and interferon-γ increases adhesion of acute myeloid leukemia cells and alters the adhesive mechanism[J].Experimental Hematology,1997,25:132.
[7] Simmons PJ,Masinovsky B,Longenecker,et al.Vascular cell
adhesion molercule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediates the binding of hematopoietic progenitor cell[J].Blood,1992,80:388.
[8] Oostendrop RAJ,Reisbach G,Spitzer E,et al.VLA-4 and VC-
AM-1 are principal adhesion molecules involved in the interaction between blast colony-forming cells and bone marrow stromal cell[J].Brit J Haematol,1995,91:275.
收稿日期：1999-11-01
修回日期：2000-01-13, http://www.100md.com
单位：(温州医学院附属育英儿童医院，浙江 温州 325027)
关键词：白细胞介素-2；肿瘤坏死因子-α；干扰素-α；造血细胞；造血微环境
温州医学院学报000213 [摘 要] 目的:研究IL-2、TNF-α和IFN-α在激活骨髓细胞抗肿瘤活性的同时对造血细胞和造血微环境的影响。 方法和结果:IL-2、TNF-α和IFN-α以不同组合作用于标本，发现造血细胞(CFU-GM)和CFU-F形成率：IL-2组为60.58±10.12，10.25±3.89；IL-2+IFN-α组为42.58±8.26，37.85±10.31；IL-2+IFN-α+TNF-α组为35.17±5.92，58.31±19.19；IL-2+TNF-α为30.16±4.36，43.00±13.90；TNF-α组为40.16±9.73，41.75±13.28；对照组70.33±12.92，35.00±11.60，除IL-2+IFN-α组的CFU-F外，P均<0.01；而基质细胞对CFU-Blast的支持率分别为20.33±7.80，26.58±8.51，36.83±8.49，36.92±7.11，33.00±6.78，21.90±7.35，除IL-2组外P均<0.01。 结论:IFN-α、TNF-α对CFU-GM有一定抑制作用，而对FU-F以及基质细胞对造血的支持作用有一定的促进作用。
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[中图分类号] R331.2 [文献标识码] A [文章编号] 1000-2138(2000)02-0121-03
Effects of IL-2,IFN-α and TNF-α on hematopoietic progenitor and hematopoietic environment
HEN Shu-hong WANG Hai-nong RUAN Ji-chen
(Yu ying children's hospital of WenZhou medical collage 325027)
Abstract： Objective：To study the effects IL-2,IFN-α and TNF-α on hematopoietic progenitor and hematopoietic environment while activating anti-neoplasm activity.Methods and Results：Treated by IL-2,IFN-α and TNF-α in different combinations,the number of CFU-GM and CFU-F was:group IL-2 60.58±10.12 and 10.25±3.89;group IL-2+IFN-α 42.58±8.26 and 37.85±10.31; group IL-2+IFN-α+TNF-α 35.17±5.92 and 58.33±19.19；group IL-2+TNF-α 30.16±4.36 and 43±13.9; group TNF-α 40.16±9.73 and 41.75±13.28；contol 70.33±12.92 and 35±11.6 respectively.All were P<0.01 except CFU-F in group IL-2+IFN-α.The capacity of stromal cells supporting CFU-Blast was 20.33±7.8,26.58±8.51，36.83±8.49，36.92±7.11，33±6.78 and 21.9±7.35.All were P<0.01 except group IL-2.Conclusion：IFN-α and TNF-α may inhibit hematopoietic progenitor(CFU-GM) to some degree but stimulate CFU-F and improve stromal cells supporting hematopoiet.
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Key words： interleukine-2;tumor necrosis factor-α;interferon-α;hematopoietic progenitor;hematopoietic environment
IL-2可以激活外周血细胞和骨髓细胞，使其具有杀伤肿瘤细胞作用，这是一种非主要组织相容性抗原限制性细胞毒作用，利用这一细胞毒作用可使白血病骨髓在体外得到净化。而其他一些细胞因子如IFN-α，IFN-γ，TNF-α，可以增强这种细胞毒作用，但同时这些细胞因子的作用又能影响正常造血细胞的生长。然而这种影响是否有意义各家说法不一，我们就此进行了进一步的研究，此外我们还就它们对造血微环境的影响进行了研究并报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 骨髓细胞采自本院确诊为特发性血小板减少性紫癜8例和缺铁性贫血病人4例，共12例，年龄2～12岁，其中男5例，女7例。重组IFN-α为美国先灵葆雅公司产品，IL-2为军事医学科学院生化制药厂产品，TNF-α为温州复旦生物制品厂产品，以上试剂均用RPMI-1640配制分装于-70℃冻存。
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1.2 方法标本处理 骨髓细胞常规分离单个核细胞(MNC)，分别加入IL-2、IFN-α、TNF-α，使各成分的终浓度分别为MNC2×106/ml，IL-2 1000IU/ml，IFN-α 1000IU/ml，TNF-α 100IU/ml。于6孔板内，1毫升/孔，置37℃，5.0%CO2，饱和湿度下培养3天后作CFU-GM、CFU-F培养。
1.2.1 CFU-GM和CFU-F培养：上述处理的6孔板用RPMI 1640充分冲洗，其中悬浮细胞洗涤后常规作CFU-GM培养。粘附细胞按以前建立的方法作CFU-F培养[1]。
1.2.2 基质细胞支持造血作用：培养体系和CFU-F培养相同，接种于24孔板内，接种时不加细胞因子，每周换液两次，直到基质细胞铺满24孔板底面后加入IL-2、TNF-α和IFN-α，浓度同上。24小时后去上清液，加入MNC 1×106/ml，静置2小时后除去悬浮细胞，加入同样的完全培养基(含0.3%琼脂)1周后计数集落，即CFU-Blast[1]。
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1.2.3 统计处理：采用配对资料的t检验。
2 结果
细胞因子对造血祖细胞的影响见表1，对造血微环境的影响见表2。
表1 IL-2、TFN-α、TNF-α对GFU-GM的影响(n=12) 细胞因子
CFU-GM
(CFU/105MNC)
回收率(%)
IL-2
60.58±10.12**
86.14
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IL-2+IFN-α
42.58±8.26**
60.54
IL-2+IFN-α+TNF-α
35.17±5.92**
50.00
IL-2+TNF-α
30.16±4.36**
42.88
TNF-α
40.16±9.73**
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57.10
对照组
70.33±12.92
—
与对照组相比：** P<0.01表2 IL-2、IFN-α、TNF-α对CFU-F及支持造血作用的影响(n=12) 细胞因子
CFU-F(CFU/2×106NM)
CFU-Blast
(CFU/106MNC)
IL-2
10.25± 3.81**
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20.33±7.80
IL-2+IFN-α
37.85±10.31**
26.58±8.51**
IL-2+IFN-α+TNF-α
58.33±19.19**
36.83±8.49**
L-2+TNF
43.00±13.90**
36.92±7.11**
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TNF
41.75±13.28**
33.00±6.78**
对照组
35.00±11.60
21.90±7.35
与对照组相比：** P<0.01
3 讨论
已有许多学者用细胞因子来激活骨髓，使其具有杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到体外净化自身骨髓或使回输骨髓具有移植物抗白血病作用，提高自体骨髓移植的治疗作用。但骨髓移植的成功与否，首先是建立在造血多能干细胞在骨髓微环境中植入的基础上，这种植入又和造血细胞本身以及造血微环境包括基质细胞和细胞外基质有关。已有文献报道，IL-2、IFN-α、TNF-α单独使用或联合作用可以使造血细胞受到不同程度的抑制[2，3]，但由于细胞因子的来源、剂量、作用时间，以及培养体系的不同，结果也不尽相同，甚至，统计方法的不同结果也有所不同。李氏[2]认为IFN-α和IL-2合用对CFU-GM无明显抑制作用，他们用的是非配对资料的统计方法。我们对研究结果作统计分析时发现，若用随机分组资料均数的t检验，只有IL-2+INF-α和IL-2+IFN-α+TNF-α两组有明显的抑制作用(P<0.05和P<0.01)，和文献的结果相似。尽管如此，这样的代价是值得的，因为大多数研究显示，细胞因子的联合应用对激活骨髓中的抗肿瘤细胞活性有明显的协同作用[2～5]，IL-2+IFN-α的净化作用即可达2个对数级，而造血细胞的减少不到50.0%。而且有作者认为联合应用IL-2和IFN较单用IFN对造血细胞的抑制作用还要小[2]。这些都说明细胞因子体外净化自体骨髓时造成的对造血细胞的副作用是可以忍受的。
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而且，我们进一下研究还发现，这些细胞因子对CFU-F的作用几乎完全相反。尤其TNF-α和IFN-α的加入，不但没使CFU-F生成受抑制，反而对其有明显的促进作用，而且受细胞因子作用的基质细胞对造血细胞的支持作用也有明显提高。这可能和TNF以及IFN有刺激基质细胞生成粘附分子以及使细胞外基质增加有关。已有实验证明，TNF-α和IFN-α可以使基质细胞增加VCAM-1、I-CAM-1等粘附分子的表达[6]，而CFU-Blast(CD34+，CD33-，HLA-DR-)表达VCAM-1的受体VLA-4。CFU-Blast主要是通过CAM-1/VAL-4之间的相互作用而粘附到基质细胞上，并得到基质细胞的支持而生长、增殖[7，8]，所以IFN和TNF不但使CFU-F增加，而且CFU-Blast形成也增加。由于IL-2可以CSF-GM使合成增加，而IFN和TNF则使CSF-GM表达减少，那么细胞因子引起的造血细胞的定居增加，基质细胞和造血细胞之间的相互作用增强，细胞因子对造血细胞的抑制作用以及它们对集落刺激因子生成的调控作用共同影响了造血微环境对造血细胞的支持作用。但在体外作CFU-Blast时，应先洗去了这些细胞因子，而自体骨髓移植时，回输的细胞因子很快被稀释和代谢，作用也很快消失。基质细胞对细胞因子的这一反应可以使其回巢加快，更早地促使在预处理中受损的造血微环境得到修复并使造血细胞定居增多，从而或多或少地抵消了细胞因子本身对造血细胞的抑制作用。
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基金项目：浙江省卫生厅科研基金资助项目(1994)
作者简介：沈树红(1963-)，男，浙江象山人，硕士，主治医师，主要研究方向：血液学及肿瘤学。
参考文献
[1] 沈树红，林宝爵，夏学鸣，等.高温联合普鲁卡因体外净化急性髓细胞白血病骨髓及其优化[J].温州医学院学报，1997，7：1.
[2] 李成文，严文伟，郝玉书，等.IFN-α、IL-2联合IL-2激活的骨髓净化K562细胞的实验研究[J].中华血液学杂志，1996，17：518.
[3] Dickiinson AM,Middleton SL,Latham J,et al.Cytokine treatment of human bone marrow actives anti-leukemia effector cells:monitoring of purging by polymerase chain reaction and DNA analysis[J].Leukemia,1995,9:44.
, 百拇医药
[4] Charak BS,Agah R,Gray D,et al.Interaction of various cytok-
ines with interleukin-2 in the generation of kiler cells from human bone marrow:application in purging of leukemia[J].Leukemia Reserch,1991,15,801.
[5] Teichman TV,Luding WP,Thiel E.Cytotoxicity of interleuki-
n-2 induced lymphokine-activated killer(LAK) cells against human leukemia and augmentation of killing by interferons and tumor necrosis factor[J].Leuk Res,1992,16:187.
, 百拇医药
[6] Bendall LJ,Kortlepel K,Gotllieb DJ.Bone marrow fibroblast
exposure to the inflammatory cytokine tumor necrosis factor-α and interferon-γ increases adhesion of acute myeloid leukemia cells and alters the adhesive mechanism[J].Experimental Hematology,1997,25:132.
[7] Simmons PJ,Masinovsky B,Longenecker,et al.Vascular cell
adhesion molercule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediates the binding of hematopoietic progenitor cell[J].Blood,1992,80:388.
[8] Oostendrop RAJ,Reisbach G,Spitzer E,et al.VLA-4 and VC-
AM-1 are principal adhesion molecules involved in the interaction between blast colony-forming cells and bone marrow stromal cell[J].Brit J Haematol,1995,91:275.
收稿日期：1999-11-01
修回日期：2000-01-13, http://www.100md.com