原发性帕金森病线粒体酶复合体Ⅰ功能缺陷*
作者：高枫 陈清棠
单位：北京医科大学第一医院神经内科，北京 100034
关键词：
990324 原发性帕金森病(Parkinson disease，PD)是神经系统变性性疾病,病因不清。10多年前发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶能通过抑制线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ导致PD[1]，国外陆续有报道PD患者黑质、血小板、骨骼肌等多种组织存在线粒体酶复合体功能障碍[2～4]。弄清酶复合体缺陷产生的原因，对认识PD病因与发病具有重要意义。线粒体酶复合体的亚基由核DNA和线粒体DNA(mtDNA)共同编码，二者突变均可导致其功能障碍[2～4]。我们用无线粒体DNA的细胞系(ρ0细胞)对患者血小板线粒体功能进行研究，分析我国PD患者线粒体功能缺陷类型及其基因突变基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
20例PD患者来自本院1996年4～12月间神经内科门诊，平均年龄(66±9)岁，男13例,女7例。正常对照20例，为同期门诊正常查体的健康自愿者，男11例，女9例，平均年龄(64±8)岁，与PD患者相比差别无统计学意义。
分离外周血血小板：取外周血10ml，离心分离血小板，计数后，冻存于液氮中备用。
ρ0细胞培养与鉴定：参照文献报道将人食管癌细胞系在含EB50μg.L-1培养液中制备出ρ0细胞，用选择性培养液(不含尿嘧啶和丙酮酸钠)进行鉴定[5]。
血小板与ρ0细胞融合：收集106个ρ0细胞，加入0.1ml420g.L-1聚乙二醇，混匀后轻轻加在107血小板沉淀上。1min后加入适量培养液，混匀。3d后将培养液更换为选择性培养液。
, 百拇医药
融合细胞线粒体功能测定：于细胞融合后40d左右，收集107个细胞，以差速离心法分离线粒体。用极谱法测定融合细胞线粒体功能：分别以苹果酸+谷氨酸、琥珀酸、维生素C+四甲基-对-苯二胺为底物测量氧耗率及抗氰呼吸[5，6]。
2 结果与讨论
1989年King等[7]构建了ρ0细胞。给予外源线粒体，可以重建ρ0细胞的呼吸链功能，这为研究线粒体功能缺陷的分子遗传机制提供了可能。由于PD患者血小板有特征性酶复合体活性下降，而外周成熟血小板又是天然的仅有mtDNA无核基因的细胞，因此可用来与ρ0细胞融合，融合细胞的mtDNA来自患者血小板，核基因由ρ0细胞提供，因此融合细胞的线粒体功能来源于提供mtDNA的血小板。如果PD患者线粒体生化缺陷是由mtDNA突变所致，那么由于它的mtDNA是患者血小板提供的，因此其线粒体功能仍然是异常的；如果患者线粒体生化缺陷是来自核基因突变，那么由于融合细胞的核基因是相对正常的，其线粒体生化缺陷就会得到纠正。通过本实验就能确定出PD患者线粒体生化缺陷及其产生的遗传背景。我们将血小板与ρ0细胞融合后测定线粒体呼吸氧耗率，发现以苹果酸和谷氨酸为底物时(反映酶复合体Ⅰ、Ⅲ～Ⅴ功能)，患者组(1.25±0.08)明显低于正常对照组(1.75±0.08)，降低28.6%，差别有统计学意义(P<0.001)；以琥珀酸为底物时(反映酶复合体Ⅱ～Ⅴ功能)，患者组(3.21±0.08)与正常对照组(3.27±0.07)差别无统计学意义(P>0.05)；维生素C和TMPD为底物(反映酶复合体Ⅳ、Ⅴ功能)，患者组(4.47±0.09)与对照组(4.54±0.10)差别无统计学意义(P>0.05)。这些结果表明线粒体酶复合体Ⅱ～Ⅴ活性正常，以苹果酸和谷氨酸为底物时的氧耗率的降低来源于酶复合体Ⅰ活性受损。由于融合细胞的核背景一致，其线粒体功能的差别仅受mtDNA影响，因此本实验发现的患者酶复合体Ⅰ缺陷来源于mtDNA的突变。
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抗氰呼吸是指在线粒体呼吸链中漏出的电子与氧结合所消耗的氧，代表着氧自由基的水平，抗氰呼吸越多，自由基水平越高。本实验发现患者组抗氰呼吸(8.76±0.25)%高于正常对照组(6.20±0.10)%，二者差别有统计学意义(P<0.05)表明患者的自由基增多。线粒体酶复合体Ⅰ抑制可导致自由基增多，可能是本实验PD患者抗氰呼吸增多的原因。
* 国家自然科学基金(39870725)和高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。
参考文献
1 Langton JW, Ballard P, Tetrud JW, et al. Chronic Parkinsonism in human due to product of meperidine-analog synthesis. Science, 1983, 219:979-980
, 百拇医药 2 Schapira AHV, Cooper JW, Dexter D, et al. Mitochondrial complex Ⅰ deficiency in Parkinson's disease. J Neurochem, 1989, 54:823-827
3 Parker WD, Boyson SJ, Parks JK., et al. Abnormalities of the electron transport chain in idiopathic Parkinson's disease. Ann Neurol, 1989, 26:719-723
4 Shoffner JM, Watts RL, Juncos JL, et al. Mitochondrial oxidative phosphorylation defects in Parkinson's disease. Ann Neurol, 1991, 30:332-339
, 百拇医药
5 King MP, Attardi G. Isolation of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods Enzymol, 1996, 264:304-313
6 King MP, Attardi G. Mitochondrial mediated transformation of human cells. Methods Enzymol, 1996, 264:313-334
7 King MP, Attardi G. Human cell lines lacking mitochondrial DNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science, 1989, 246:500-503
(1999-03-12收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第一医院神经内科，北京 100034
关键词：
990324 原发性帕金森病(Parkinson disease，PD)是神经系统变性性疾病,病因不清。10多年前发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶能通过抑制线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ导致PD[1]，国外陆续有报道PD患者黑质、血小板、骨骼肌等多种组织存在线粒体酶复合体功能障碍[2～4]。弄清酶复合体缺陷产生的原因，对认识PD病因与发病具有重要意义。线粒体酶复合体的亚基由核DNA和线粒体DNA(mtDNA)共同编码，二者突变均可导致其功能障碍[2～4]。我们用无线粒体DNA的细胞系(ρ0细胞)对患者血小板线粒体功能进行研究，分析我国PD患者线粒体功能缺陷类型及其基因突变基础。
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1 材料与方法
20例PD患者来自本院1996年4～12月间神经内科门诊，平均年龄(66±9)岁，男13例,女7例。正常对照20例，为同期门诊正常查体的健康自愿者，男11例，女9例，平均年龄(64±8)岁，与PD患者相比差别无统计学意义。
分离外周血血小板：取外周血10ml，离心分离血小板，计数后，冻存于液氮中备用。
ρ0细胞培养与鉴定：参照文献报道将人食管癌细胞系在含EB50μg.L-1培养液中制备出ρ0细胞，用选择性培养液(不含尿嘧啶和丙酮酸钠)进行鉴定[5]。
血小板与ρ0细胞融合：收集106个ρ0细胞，加入0.1ml420g.L-1聚乙二醇，混匀后轻轻加在107血小板沉淀上。1min后加入适量培养液，混匀。3d后将培养液更换为选择性培养液。
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融合细胞线粒体功能测定：于细胞融合后40d左右，收集107个细胞，以差速离心法分离线粒体。用极谱法测定融合细胞线粒体功能：分别以苹果酸+谷氨酸、琥珀酸、维生素C+四甲基-对-苯二胺为底物测量氧耗率及抗氰呼吸[5，6]。
2 结果与讨论
1989年King等[7]构建了ρ0细胞。给予外源线粒体，可以重建ρ0细胞的呼吸链功能，这为研究线粒体功能缺陷的分子遗传机制提供了可能。由于PD患者血小板有特征性酶复合体活性下降，而外周成熟血小板又是天然的仅有mtDNA无核基因的细胞，因此可用来与ρ0细胞融合，融合细胞的mtDNA来自患者血小板，核基因由ρ0细胞提供，因此融合细胞的线粒体功能来源于提供mtDNA的血小板。如果PD患者线粒体生化缺陷是由mtDNA突变所致，那么由于它的mtDNA是患者血小板提供的，因此其线粒体功能仍然是异常的；如果患者线粒体生化缺陷是来自核基因突变，那么由于融合细胞的核基因是相对正常的，其线粒体生化缺陷就会得到纠正。通过本实验就能确定出PD患者线粒体生化缺陷及其产生的遗传背景。我们将血小板与ρ0细胞融合后测定线粒体呼吸氧耗率，发现以苹果酸和谷氨酸为底物时(反映酶复合体Ⅰ、Ⅲ～Ⅴ功能)，患者组(1.25±0.08)明显低于正常对照组(1.75±0.08)，降低28.6%，差别有统计学意义(P<0.001)；以琥珀酸为底物时(反映酶复合体Ⅱ～Ⅴ功能)，患者组(3.21±0.08)与正常对照组(3.27±0.07)差别无统计学意义(P>0.05)；维生素C和TMPD为底物(反映酶复合体Ⅳ、Ⅴ功能)，患者组(4.47±0.09)与对照组(4.54±0.10)差别无统计学意义(P>0.05)。这些结果表明线粒体酶复合体Ⅱ～Ⅴ活性正常，以苹果酸和谷氨酸为底物时的氧耗率的降低来源于酶复合体Ⅰ活性受损。由于融合细胞的核背景一致，其线粒体功能的差别仅受mtDNA影响，因此本实验发现的患者酶复合体Ⅰ缺陷来源于mtDNA的突变。
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抗氰呼吸是指在线粒体呼吸链中漏出的电子与氧结合所消耗的氧，代表着氧自由基的水平，抗氰呼吸越多，自由基水平越高。本实验发现患者组抗氰呼吸(8.76±0.25)%高于正常对照组(6.20±0.10)%，二者差别有统计学意义(P<0.05)表明患者的自由基增多。线粒体酶复合体Ⅰ抑制可导致自由基增多，可能是本实验PD患者抗氰呼吸增多的原因。
* 国家自然科学基金(39870725)和高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。
参考文献
1 Langton JW, Ballard P, Tetrud JW, et al. Chronic Parkinsonism in human due to product of meperidine-analog synthesis. Science, 1983, 219:979-980
, 百拇医药 2 Schapira AHV, Cooper JW, Dexter D, et al. Mitochondrial complex Ⅰ deficiency in Parkinson's disease. J Neurochem, 1989, 54:823-827
3 Parker WD, Boyson SJ, Parks JK., et al. Abnormalities of the electron transport chain in idiopathic Parkinson's disease. Ann Neurol, 1989, 26:719-723
4 Shoffner JM, Watts RL, Juncos JL, et al. Mitochondrial oxidative phosphorylation defects in Parkinson's disease. Ann Neurol, 1991, 30:332-339
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5 King MP, Attardi G. Isolation of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods Enzymol, 1996, 264:304-313
6 King MP, Attardi G. Mitochondrial mediated transformation of human cells. Methods Enzymol, 1996, 264:313-334
7 King MP, Attardi G. Human cell lines lacking mitochondrial DNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science, 1989, 246:500-503
(1999-03-12收稿), http://www.100md.com