急性炎性脱鞘性多神经根神经病TCRβ链基因重排的研究*
作者：王立军 钟延丰△ 康德瑄 王盛兰△ 杨金辉△
单位：北京医科大学第三医院神经科 △北京医科大学病理学系，北京 100083
关键词：
990320 急性炎性脱鞘性多神经根神经病(acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy, AIDP)为一种主要累及脊神经、颅神经的周围神经系统疾病，病变部位神经髓鞘脱失，伴大量淋巴细胞浸润，严重时可有轴索变性；巨噬细胞、MHCⅡ类分子阳性的抗原呈递细胞及分泌细胞因子的活化T细胞亦在局部大量聚集。研究表明活化的T细胞在AIDP的病理损伤中起重要作用，T细胞通过T 细胞受体(T cell receptor, TCR) 发挥作用，TCR基因经过V-D-J-C区的基因重排显示多样性和特异性。对其它的自身免疫性疾病研究发现TCR基因呈限制性基因重排，与疾病的发生或损伤程度密切相关，在AIDP的病理机制中是否也存在类似机制目前尚无定论[1]。
, 百拇医药
本研究采用一种反向PCR技术(inverse polymerase chain reaction，IPCR)对14例AIDP病人TCRβ链基因重排作了初步研究。
1 材料与方法
1.1 标本来源
14例AIDP病人为我科1996～1997年收治的住院病人，经临床、电生理或病理加以确诊，发病1周内取新鲜抗凝外周静脉血。
1.2 总RNA的提取
从外周血分离淋巴细胞，异硫氰酸胍法提取总RNA[2]，测A260/280，对RNA定量并分析纯度，甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。
1.3 双链cDNA的合成及环化
, 百拇医药
双链cDNA的合成采用Gibco公司的cDNA synthesis system，用1μg 总RNA，加Oligo(dT)12-18随机引物，在M-MLV(鼠源反转录酶)的作用下，37℃水浴1h进行反转录，合成cDNA第一链。随后进行cDNA第二链合成，10×第二链buffer 16μl(188mmol.L-1 Tris-HCl，906mmol.L-1 KCl，10mmol.L-1 (NH4)2SO4，46mmol.L-1 MgCl2，37.5mmol.L-1 DTT，1.5mmol.L-1 β-NAD)，加DNA聚合酶20U，RNaseH1.4U(无RNase活性)，DNA连接酶5U，加无RNA酶水至终反应体系160 μl，16℃水浴2h，合成cDNA第二链。加T4DNA聚合酶2U(Biolab公司)，14℃水浴30min，将双链cDNA末端补平，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。在T4DNA连接酶(Promega公司)的作用下，16℃环化24h，65℃水浴15min后备用[3～5]。
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1.4 IPCR
用于IPCR扩增的引物由北京赛百盛公司合成，正向引物：5′-GTGCGTCGACGTGTGCACCTCCTTCCCATT-3′，反向引物：5′-TGTAGAATTCGCCATGGTCAAGAGAAAGG-3′，取环化产物为模板在50μl反应体系中进行扩增，反应参数为：95℃变性5min，加Taq酶2.5U，80 ℃保温10min(热启动)，然后95℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后一个循环延伸时间为7min，保证扩增产物充分延伸。扩增产物经18g.L-1的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，记录并照像。
2 结果
共检测AIDP病人14例，正常对照5例，总RNA测定A260/280的比值大于1.8，甲醛变性凝胶电泳显示有清晰的28S和18S两条带，二者比例为2∶1，提示所提取的总RNA质量较高，无降解(见图1)，可以进行下一步的反转录和IPCR扩增。
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图1 RNA甲醛变性凝胶电泳
Figure 1 Formaldehyde gel electrophoresis of denatured total RNA
14例病人中有8例(8/14)最后经IPCR扩增后有特异性集中的扩增产物，条带主要集中于600bp左右(见图2)；2例(2/14)病人IPCR扩增产物扩增效率较低，特异性较差，在300～1000bp之间呈弥散的不规则分布；其余4例(4/14)病人紫外灯下未检测到IPCR扩增产物。
图2 IPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
Figure 2 Gel electrophoresis of IPCR amplification products
, 百拇医药
正常对照组1例紫外灯下可检测到少量非特异扩增产物，其余4例的IPCR扩增均无可检测到的扩增产物。
发病3周后对上述8例病人重复进行IPCR扩增，仍可扩增出多量扩增产物，但条带的集中趋势发生改变，300、600、800、1 000 bp附近均有分布，特异性有所下降。
3 讨论
AIDP是临床较为常见的周围神经系统疾病，以前主要着眼于体液免疫损伤在AIDP中的作用，近来研究显示细胞免疫在疾病的发生、发展中起重要作用[6]。T细胞的作用受到越来越多的关注，T细胞通过TCR识别抗原发挥作用，在外来抗原或自身组织刺激下，T细胞活化并增殖成相应的克隆。以前文献对于TCR的研究多限于白血病、淋巴瘤等较为明确的单克隆性增殖为主的疾病，而对神经系统的自身免疫性疾病，如AIDP等的研究不多见。AIDP中是否也存在一种共同活化的、克隆特异的T细胞一直未有定论，因此分析与之对应的TCR基因有重要意义。
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TCR是由α、β两条肽链以二硫键形成的异源二聚体，编码人的TCRβ链基因可分为V、D、J、C区，位于染色体7q32，C区为保守区，恒定不变，其序列已克隆出，V区为可变区，基因大部尚不清楚。目前对TCR基因的研究主要采用常规的PCR技术和锚定PCR技术，前者是根据已知的TCR V区基因序列设计5′端引物，由于V区的基因复杂多样，许多基因尚未克隆，使该方法的应用受到很大限制，况且不同V区的特异引物进行PCR扩增的条件均不同，所以扩增出的产物特异性和准确性均大大降低，同时也无法扩增未知的V区基因。锚定PCR技术对模板的要求非常严格，由于5′端使用的是 Oligo(dT)n通用引物，仅3′端引物是特异的，所以扩增结果的特异性常常受到质疑。IPCR是近年来发展起来的一种用于扩增已知基因两侧未知基因序列的新技术[3～5]，本研究利用已知的TCR β链C区基因设计出一对反向引物，分别合成双链cDNA，补平末端并环化，使待扩增的V、D、J区位于两条特异引物之间，经IPCR扩增，可扩增出所有重排的TCRβ链基因，较好地避免了上述两种技术的弊端。
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我们的初步研究结果提示AIDP发病早期重排的TCRβ链较为集中，主要位于600bp附近，有一定的特异性。我们采用的IPCR扩增技术使所有发生重排的TCRβ链基因在同一个PCR反应中进行扩增，最大限度减少了由PCR反应本身条件变化所致扩增效率及产物的差异。因此，我们推测部分AIDP发病早期有一种具有优势数量的活化的T细胞克隆及相应TCRβ链的基因表达，其TCRβ链基因片段的长度大约为600bp。这些活化的T细胞是否为主要的致病性T细胞，其对应的TCRβ链基因如何重排，均需进一步研究。在疾病的中期，重排的TCRβ链集中趋势明显改变，可能与疾病发展中脱鞘损伤的神经髓鞘等激活相应的T细胞，引发一系列的免疫损伤反应有关，此时可出现种类数量繁多的活化的T细胞克隆及相应TCRβ链的基因表达，AIDP在此期的损伤机制可能有多种因素参与。
近来研究表明，在其它的自身免疫性疾病中，存在有单克隆T细胞的免疫损伤反应。如在B10.PL 小鼠诱发的EAE中(一种多发性硬化的动物模型)，T细胞的免疫损伤作用是通过TCR Vβ8.2或Vβ13来介导的。来自病人和动物实验模型的资料表明，TCR V基因针对MBP的反应性克隆为限制性，提示与疾病的某些方面密切相关[6，7]。在AIDP中是否也存在TCR Vβ基因的限制性表达，尚未见文献报道，我们的初步研究提示有类似趋势。倘若如此，利用抗TCR Vβ抗体等方法阻断活化的T细胞与TCR Vβ的结合作用，将阻止或减缓免疫损伤，这对于AIDP的治疗可能会有一定意义。
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* 卫生部科学研究基金(96-1-287)资助课题。
参考文献
1 Hartung HP, Pollard J, Harvey G, et al. Immunopathogenesis and treatment of the Guillain-Barre syndrome. Muscle Nerve, 1995, 18:137-153
2 Bowman SJ, Hall MA, Panayi GS， et al. T cell receptor alpha-chain and beta-chain junctional region homology in clonal CD3+,CD8+ T lymphocyte expansions in Felty's syndrome. Arthitis Rheum, 1997, 40:615-623
, 百拇医药
3 Weber-Arden J, Wilbert OM, Kabelitz D, et al. Inverse PCR amplification of low-abundancy message of γδ T cell receptor genes. J Immunol Methods, 1996, 197:187-192
4 Huang SH. Inverse PCR approach to cloning cDNA ends. Methods Mol Biol, 1997,69:89-96
5 Huang SH. Inverse polymerase chain reaction: An efficient approach to cloning cDNA ends. Mol Biotechnol, 1994, 2:15-22
6 Offner H, Malotky MH, Pope L, et al. Increased severity of experimental autoimmune encephalomyelitis in rats tolerized as adults but not neonatally to a protective TCR V β 8 CDR2 idiotope. J Immunol, 1995,154:928-935
7 Hafler DA, Saadeh MG, Kuchroo VK, et al. TCR usage in human and experimental demyelinating disease. Immunol Today, 1996, 17:152-159
(1999-02-25收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第三医院神经科 △北京医科大学病理学系，北京 100083
关键词：
990320 急性炎性脱鞘性多神经根神经病(acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy, AIDP)为一种主要累及脊神经、颅神经的周围神经系统疾病，病变部位神经髓鞘脱失，伴大量淋巴细胞浸润，严重时可有轴索变性；巨噬细胞、MHCⅡ类分子阳性的抗原呈递细胞及分泌细胞因子的活化T细胞亦在局部大量聚集。研究表明活化的T细胞在AIDP的病理损伤中起重要作用，T细胞通过T 细胞受体(T cell receptor, TCR) 发挥作用，TCR基因经过V-D-J-C区的基因重排显示多样性和特异性。对其它的自身免疫性疾病研究发现TCR基因呈限制性基因重排，与疾病的发生或损伤程度密切相关，在AIDP的病理机制中是否也存在类似机制目前尚无定论[1]。
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本研究采用一种反向PCR技术(inverse polymerase chain reaction，IPCR)对14例AIDP病人TCRβ链基因重排作了初步研究。
1 材料与方法
1.1 标本来源
14例AIDP病人为我科1996～1997年收治的住院病人，经临床、电生理或病理加以确诊，发病1周内取新鲜抗凝外周静脉血。
1.2 总RNA的提取
从外周血分离淋巴细胞，异硫氰酸胍法提取总RNA[2]，测A260/280，对RNA定量并分析纯度，甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。
1.3 双链cDNA的合成及环化
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双链cDNA的合成采用Gibco公司的cDNA synthesis system，用1μg 总RNA，加Oligo(dT)12-18随机引物，在M-MLV(鼠源反转录酶)的作用下，37℃水浴1h进行反转录，合成cDNA第一链。随后进行cDNA第二链合成，10×第二链buffer 16μl(188mmol.L-1 Tris-HCl，906mmol.L-1 KCl，10mmol.L-1 (NH4)2SO4，46mmol.L-1 MgCl2，37.5mmol.L-1 DTT，1.5mmol.L-1 β-NAD)，加DNA聚合酶20U，RNaseH1.4U(无RNase活性)，DNA连接酶5U，加无RNA酶水至终反应体系160 μl，16℃水浴2h，合成cDNA第二链。加T4DNA聚合酶2U(Biolab公司)，14℃水浴30min，将双链cDNA末端补平，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。在T4DNA连接酶(Promega公司)的作用下，16℃环化24h，65℃水浴15min后备用[3～5]。
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1.4 IPCR
用于IPCR扩增的引物由北京赛百盛公司合成，正向引物：5′-GTGCGTCGACGTGTGCACCTCCTTCCCATT-3′，反向引物：5′-TGTAGAATTCGCCATGGTCAAGAGAAAGG-3′，取环化产物为模板在50μl反应体系中进行扩增，反应参数为：95℃变性5min，加Taq酶2.5U，80 ℃保温10min(热启动)，然后95℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后一个循环延伸时间为7min，保证扩增产物充分延伸。扩增产物经18g.L-1的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，记录并照像。
2 结果
共检测AIDP病人14例，正常对照5例，总RNA测定A260/280的比值大于1.8，甲醛变性凝胶电泳显示有清晰的28S和18S两条带，二者比例为2∶1，提示所提取的总RNA质量较高，无降解(见图1)，可以进行下一步的反转录和IPCR扩增。
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图1 RNA甲醛变性凝胶电泳
Figure 1 Formaldehyde gel electrophoresis of denatured total RNA
14例病人中有8例(8/14)最后经IPCR扩增后有特异性集中的扩增产物，条带主要集中于600bp左右(见图2)；2例(2/14)病人IPCR扩增产物扩增效率较低，特异性较差，在300～1000bp之间呈弥散的不规则分布；其余4例(4/14)病人紫外灯下未检测到IPCR扩增产物。
图2 IPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
Figure 2 Gel electrophoresis of IPCR amplification products
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正常对照组1例紫外灯下可检测到少量非特异扩增产物，其余4例的IPCR扩增均无可检测到的扩增产物。
发病3周后对上述8例病人重复进行IPCR扩增，仍可扩增出多量扩增产物，但条带的集中趋势发生改变，300、600、800、1 000 bp附近均有分布，特异性有所下降。
3 讨论
AIDP是临床较为常见的周围神经系统疾病，以前主要着眼于体液免疫损伤在AIDP中的作用，近来研究显示细胞免疫在疾病的发生、发展中起重要作用[6]。T细胞的作用受到越来越多的关注，T细胞通过TCR识别抗原发挥作用，在外来抗原或自身组织刺激下，T细胞活化并增殖成相应的克隆。以前文献对于TCR的研究多限于白血病、淋巴瘤等较为明确的单克隆性增殖为主的疾病，而对神经系统的自身免疫性疾病，如AIDP等的研究不多见。AIDP中是否也存在一种共同活化的、克隆特异的T细胞一直未有定论，因此分析与之对应的TCR基因有重要意义。
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TCR是由α、β两条肽链以二硫键形成的异源二聚体，编码人的TCRβ链基因可分为V、D、J、C区，位于染色体7q32，C区为保守区，恒定不变，其序列已克隆出，V区为可变区，基因大部尚不清楚。目前对TCR基因的研究主要采用常规的PCR技术和锚定PCR技术，前者是根据已知的TCR V区基因序列设计5′端引物，由于V区的基因复杂多样，许多基因尚未克隆，使该方法的应用受到很大限制，况且不同V区的特异引物进行PCR扩增的条件均不同，所以扩增出的产物特异性和准确性均大大降低，同时也无法扩增未知的V区基因。锚定PCR技术对模板的要求非常严格，由于5′端使用的是 Oligo(dT)n通用引物，仅3′端引物是特异的，所以扩增结果的特异性常常受到质疑。IPCR是近年来发展起来的一种用于扩增已知基因两侧未知基因序列的新技术[3～5]，本研究利用已知的TCR β链C区基因设计出一对反向引物，分别合成双链cDNA，补平末端并环化，使待扩增的V、D、J区位于两条特异引物之间，经IPCR扩增，可扩增出所有重排的TCRβ链基因，较好地避免了上述两种技术的弊端。
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我们的初步研究结果提示AIDP发病早期重排的TCRβ链较为集中，主要位于600bp附近，有一定的特异性。我们采用的IPCR扩增技术使所有发生重排的TCRβ链基因在同一个PCR反应中进行扩增，最大限度减少了由PCR反应本身条件变化所致扩增效率及产物的差异。因此，我们推测部分AIDP发病早期有一种具有优势数量的活化的T细胞克隆及相应TCRβ链的基因表达，其TCRβ链基因片段的长度大约为600bp。这些活化的T细胞是否为主要的致病性T细胞，其对应的TCRβ链基因如何重排，均需进一步研究。在疾病的中期，重排的TCRβ链集中趋势明显改变，可能与疾病发展中脱鞘损伤的神经髓鞘等激活相应的T细胞，引发一系列的免疫损伤反应有关，此时可出现种类数量繁多的活化的T细胞克隆及相应TCRβ链的基因表达，AIDP在此期的损伤机制可能有多种因素参与。
近来研究表明，在其它的自身免疫性疾病中，存在有单克隆T细胞的免疫损伤反应。如在B10.PL 小鼠诱发的EAE中(一种多发性硬化的动物模型)，T细胞的免疫损伤作用是通过TCR Vβ8.2或Vβ13来介导的。来自病人和动物实验模型的资料表明，TCR V基因针对MBP的反应性克隆为限制性，提示与疾病的某些方面密切相关[6，7]。在AIDP中是否也存在TCR Vβ基因的限制性表达，尚未见文献报道，我们的初步研究提示有类似趋势。倘若如此，利用抗TCR Vβ抗体等方法阻断活化的T细胞与TCR Vβ的结合作用，将阻止或减缓免疫损伤，这对于AIDP的治疗可能会有一定意义。
, http://www.100md.com
* 卫生部科学研究基金(96-1-287)资助课题。
参考文献
1 Hartung HP, Pollard J, Harvey G, et al. Immunopathogenesis and treatment of the Guillain-Barre syndrome. Muscle Nerve, 1995, 18:137-153
2 Bowman SJ, Hall MA, Panayi GS， et al. T cell receptor alpha-chain and beta-chain junctional region homology in clonal CD3+,CD8+ T lymphocyte expansions in Felty's syndrome. Arthitis Rheum, 1997, 40:615-623
, 百拇医药
3 Weber-Arden J, Wilbert OM, Kabelitz D, et al. Inverse PCR amplification of low-abundancy message of γδ T cell receptor genes. J Immunol Methods, 1996, 197:187-192
4 Huang SH. Inverse PCR approach to cloning cDNA ends. Methods Mol Biol, 1997,69:89-96
5 Huang SH. Inverse polymerase chain reaction: An efficient approach to cloning cDNA ends. Mol Biotechnol, 1994, 2:15-22
6 Offner H, Malotky MH, Pope L, et al. Increased severity of experimental autoimmune encephalomyelitis in rats tolerized as adults but not neonatally to a protective TCR V β 8 CDR2 idiotope. J Immunol, 1995,154:928-935
7 Hafler DA, Saadeh MG, Kuchroo VK, et al. TCR usage in human and experimental demyelinating disease. Immunol Today, 1996, 17:152-159
(1999-02-25收稿), http://www.100md.com