共刺激分子B7在肾细胞癌的表达及意义
作者：李鸿伟 俞莉章 那彦群
单位：俞莉章 那彦群 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所，北京 100034；李鸿伟 现在河北省人民医院
关键词：肾肿瘤；遗传学；基因表达；免疫组织化学；基因B7☆；聚合酶链反应
北京医科大学学报990415 摘 要 目的：检测B7基因在肾细胞癌的表达及其与肾细胞癌分级、分期及预后的关系。方法：本文应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测了22例肾细胞癌组织B7的表达。结果：RT-PCR 5例阳性，免疫组化4例阳性，B7 mRNA表达与肾癌病理分级、分期无关系；病理切片HE染色显示，B7阳性肿瘤组织内淋巴细胞浸润明显增多。结论：表达B7的肿瘤组织局部抗肿瘤免疫反应增强，提示B7表达可能与肿瘤预后有关。大部分泌尿系肿瘤不表达B7，为转B7基因治疗泌尿系肿瘤提供了理论依据。
中国图书资料分类法分类号 R737.11
, http://www.100md.com
The expression and significance of costimulatory molecule B7 in renal cell carcinoma
LI Hong-Wei, YU Li-Zhang, NA Yan-Qun
(Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To clarify the correlation beween the expression of B7 and the prognosis of renal cell carcinoma. Methods: The expression of B7 in 22 cases of renal cell carcinoma was studied by RT-PCR and immunochemical methods. Results: RT-PCR analysis revealed B7 mRNA in 5 cases, 4 cases had the expression of B7 protein in different degrees. There was no statistical correlation between the expression of B7 mRNA and the grade or stage of renal cell carcinoma. Pathological sections showed that lymphocytes infiltration increased obviously in B7+ renal cell carcinoma. Conclusion: B7+ tumor tissues had enhancing antitumor immunoreaction. Most of renal cell carcinoma didn't express B7 gene. It has provided the theoretical basis for the gene therapy of urological neoplasma using B7 gene modified tumor cells.
, 百拇医药
MeSH Kidney neoplasms/genet Gene expression Immunohistochemistry Genes B7☆
Polymerase chain reaction
目前共刺激分子B7在抗肿瘤免疫的研究中成为热点，我们应用RT-PCR和免疫组织化学的方法，检测了22例肾细胞癌B7在mRNA转录水平和蛋白翻译水平的表达，以期探讨与肾细胞癌分级、分期及预后的关系。
1 材料与方法
组织标本：全部22例肾癌标本及10例癌旁组织均取自本所1996年10月～1997年6月间手术病人。手术切下的标本立即切取0.5～1 cm3大小新鲜肿瘤组织及癌旁组织，迅速放入液氮中保存。肿瘤病理类型、分级和分期明确。肾癌均为透明细胞癌，其中G1 7例，G2 12例，G3 3例；T1 4例，T2 13例，T3 5例。
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主要试剂：AMV酶、Taq酶、dNTP购自Promega公司，RNasin(SABC)，Oligo(dT)(Sigma)，琼脂糖(SABC)，DAB(Sigma)，LSAB(DAKO)，β-actin引物一对均购自北京华美生物公司。B7特异引物一对由中科院微生物所合成。抗B7蛋白抗体购自法国Immunotech公司。
组织RNA提取：将组织匀浆用异硫氢酸胍-氯仿-酸酚一步法提取总RNA[1]。提取出的RNA纯度用紫外分光光度计测定，质量用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
RT-PCR：首先逆转录合成cDNA。取2 μg总RNA为模板加oligo(dT)0.1 μg，65 ℃ 10 min，速冰浴。依次加入5×buffer 5 μl，dNTP 50 μmol.L-1，RNasin 10 U，AMV酶8 U，三蒸水加至25 μl，混匀后42℃ 1 h，94℃ 5 min，-20℃保存。取逆转录产物2 μl为模板，10×buffer 5 μl，dNTP 50 μmol.L-1，25 μmol.L-1 MgCl2 2 μl，Tag酶2 U，B7特异上下游引物，正义[5′AGTA CA AGAACCGGACC-
, 百拇医药
TAC3′]，反义[5′GGCGTACACTTTCCC TT CTC3′]各50 pmol，三蒸水加至50 μl，混匀后加石蜡油50 μl置PCR仪扩增35个循环(94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 2 min)。第1循环前94℃预变性5 min，35个循环后72℃延伸10 min。以质粒pcDNA3B7为模板做阳性对照，同时设阴性对照(不加模板)。预先扩增β-actin来证明反转录模板的有效性。
结果分析：PCR产物12 μl在10 g.L-1琼脂糖凝胶上电泳后，以0.5 mg.L-1溴化乙啶染色，使用Gel Doc1000图像分析系统(Bio-Rad USA)，在IBM586PC机上利用Molecular Analyst软件进行观察照相。
免疫组织化学：应用免疫组织化学(LSAB法)对B7 mRNA表达的肿瘤组织行冰冻切片检测其蛋白表达情况。
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1.7 肿瘤组织病理切片观察：组织病理切片HE染色观察肿瘤淋巴细胞浸润情况
统计方法：用SAS统计软件精确概率法统计。
2 结果
总RNA纯度及质量的鉴定：提取出的细胞RNA纯度用紫外分光光度计测定，A260/A280比值在1.7～2.0之间，表明RNA无明显降解，并根据A260值确定RNA质量。RNA质量用10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示18 S、28 S二条RNA电泳带。
RT-PCR结果：5例肾细胞癌表达B7 mRNA，10例癌旁组织均无表达，二者差异无显著性，P>0.05。10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳显示5例肾细胞癌及阳性对照于605 bp处可见条带，其余癌组织及10例癌旁组织均为阴性，染色强度不同表示其表达量不同，经四格表确切概率法统计，两组间P＝0.155(图1)。
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B7 mRNA表达与肾细胞癌分级、分期的关系：22例肾细胞癌中，G1阳性表达1例(1/7)，G2阳性表达3例(3/12)，G3阳性表达1例(1/3)。T1阳性表达1例(1/4)，T2阳性表达2例(2/13)，T3阳性表达2例(2/5)。各组间差异无显著性，P>0.05。
A， DNA marker; B, pcDNA3B7; C-G， renal cell carcinoma.
图1 RT-PCR 检测肾癌组织B7 mRNA的表达
Figure 1 Detection of B7 mRNA on renal cell carcinoma by RT-PCR
, 百拇医药
免疫组织化学结果：对B7 mRNA表达的5例肾癌标本进行免疫组化(LSAB法)检测其蛋白表达，4例肿瘤细胞有表达(2例++，2例+)，1例无表达。
肿瘤组织病理切片结果：组织切片HE染色示B7 mRNA表达的肿瘤组织内，淋巴细胞浸润明显增多，并伴有片状坏死灶。
3 讨论
目前认为B7作为一种重要的共刺激分子，在抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用[2～4]。Townsend等[5]将B7+的黑色素瘤K1735细胞注入小鼠体内，不仅诱导产生对母系B7-肿瘤细胞的免疫排斥反应，对其他黑色素瘤细胞也有全身性免疫保护作用。Guo等[6]将肝癌细胞与激活的B细胞融合，作为免疫原治疗已成瘤的大鼠，这个方法利用了B细胞上高表达的一些共刺激分子和粘附分子(包括B7、LFA-1和ICAM-1)，结果对已成瘤的较小肿瘤有治疗作用，这种作用具有肿瘤特异性。Fujh等[7]最近还报道了B7基因在肿瘤转移方面的作用，实验用转染B7-1的肿瘤细胞经放射线照射后作为瘤苗接种，结果对野生型肿瘤细胞在小鼠形成的肺转移瘤有治疗作用。
, 百拇医药
本研究结果显示，RT-PCR检测22例肾细胞癌5例有B7 mRNA表达，10例癌旁组织均为阴性，统计学显示差异无显著性，说明大多数肾癌组织无B7表达。这一结果与Hellstrm研究类同，他认为大多数肿瘤细胞没有B7分子的表达，由于肿瘤细胞本身缺乏足够的共刺激信号，所以在体内不能建立有效的抗肿瘤免疫。我们的结果显示5例肾细胞癌有B7 mRNA表达，进一步行冰冻切片免疫组化检测其蛋白表达，结果4例肿瘤细胞有不同程度的表达，在肿瘤组织HE染色病理切片上我们观察到，B7 mRNA表达的肿瘤组织淋巴细胞浸润明显增多，并伴有坏死灶，说明局部抗肿瘤免疫反应增强，提示B7基因表达可能与肿瘤预后有关，有助于延缓肿瘤的发展。Denfeld等[8]应用RT-PCR方法检测B7基因表达，发现表达B7基因的5例原发黑色素瘤，病变部位有抗肿瘤反应的临床和组织学征象，临床上逐渐自然消退，而不表达B7-1基因的肿瘤则呈进行性生长。进一步说明了B7在抗肿瘤中的作用。从B7 mRNA表达与肾癌分级及分期的关系看，统计学分析无相关性，或许与本组病例数少有关。Fujh[4]研究认为肿瘤细胞B7的表达不影响肿瘤的侵袭性。但可减少并治愈转移灶，这可能意味着表达B7基因肿瘤对防止肿瘤转移有作用，从而产生较好的预后。
, 百拇医药
B7基因在肾细胞癌表达及意义的揭示，将会为探讨肾癌的发生、发展及免疫生物治疗提供一条新的思路。
☆ 自由词。
参考文献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem ，1987， 162: 156-159
2 Linsley PS, Brady W, Grosmaire LS, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J Exp Med, 1991, 173: 721-730
, 百拇医药
3 Chen L, Ashe S, Brady WA, et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counter-receptor for the lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell，1992, 71: 1093-1102
4 张跃建,何球藻,方 舫,等. B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1997, 4: 14-19
5 Townsend SE, Su EW, Atherton JM, et al. Specificity and longevity of antitumor immune response induced by B7-transfected tumors. Cancer Res, 1994, 54: 6477-6483
, 百拇医药
6 Guo Y, Wu M, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994, 263: 518-520
7 Fujh H, Inobe M, KImura F, et al. Vaccination of tumor cells transfected with B7-1(CD80) gene induces the anti-metastatic effect and tumor immunity in mice. Int J Cancer, 1996, 66: 219-224
8 Denfeld RW, Dietrich A, Wutting E, et al. In situ expression of B7 and CD28 receptor families in human malignant melenoma: relevance for T cell mediated anti-tumor immunity. Int J Cancer, 1995, 62: 259-265
(1998-07-13收稿), 百拇医药
单位：俞莉章 那彦群 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所，北京 100034；李鸿伟 现在河北省人民医院
关键词：肾肿瘤；遗传学；基因表达；免疫组织化学；基因B7☆；聚合酶链反应
北京医科大学学报990415 摘 要 目的：检测B7基因在肾细胞癌的表达及其与肾细胞癌分级、分期及预后的关系。方法：本文应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测了22例肾细胞癌组织B7的表达。结果：RT-PCR 5例阳性，免疫组化4例阳性，B7 mRNA表达与肾癌病理分级、分期无关系；病理切片HE染色显示，B7阳性肿瘤组织内淋巴细胞浸润明显增多。结论：表达B7的肿瘤组织局部抗肿瘤免疫反应增强，提示B7表达可能与肿瘤预后有关。大部分泌尿系肿瘤不表达B7，为转B7基因治疗泌尿系肿瘤提供了理论依据。
中国图书资料分类法分类号 R737.11
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The expression and significance of costimulatory molecule B7 in renal cell carcinoma
LI Hong-Wei, YU Li-Zhang, NA Yan-Qun
(Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To clarify the correlation beween the expression of B7 and the prognosis of renal cell carcinoma. Methods: The expression of B7 in 22 cases of renal cell carcinoma was studied by RT-PCR and immunochemical methods. Results: RT-PCR analysis revealed B7 mRNA in 5 cases, 4 cases had the expression of B7 protein in different degrees. There was no statistical correlation between the expression of B7 mRNA and the grade or stage of renal cell carcinoma. Pathological sections showed that lymphocytes infiltration increased obviously in B7+ renal cell carcinoma. Conclusion: B7+ tumor tissues had enhancing antitumor immunoreaction. Most of renal cell carcinoma didn't express B7 gene. It has provided the theoretical basis for the gene therapy of urological neoplasma using B7 gene modified tumor cells.
, 百拇医药
MeSH Kidney neoplasms/genet Gene expression Immunohistochemistry Genes B7☆
Polymerase chain reaction
目前共刺激分子B7在抗肿瘤免疫的研究中成为热点，我们应用RT-PCR和免疫组织化学的方法，检测了22例肾细胞癌B7在mRNA转录水平和蛋白翻译水平的表达，以期探讨与肾细胞癌分级、分期及预后的关系。
1 材料与方法
组织标本：全部22例肾癌标本及10例癌旁组织均取自本所1996年10月～1997年6月间手术病人。手术切下的标本立即切取0.5～1 cm3大小新鲜肿瘤组织及癌旁组织，迅速放入液氮中保存。肿瘤病理类型、分级和分期明确。肾癌均为透明细胞癌，其中G1 7例，G2 12例，G3 3例；T1 4例，T2 13例，T3 5例。
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主要试剂：AMV酶、Taq酶、dNTP购自Promega公司，RNasin(SABC)，Oligo(dT)(Sigma)，琼脂糖(SABC)，DAB(Sigma)，LSAB(DAKO)，β-actin引物一对均购自北京华美生物公司。B7特异引物一对由中科院微生物所合成。抗B7蛋白抗体购自法国Immunotech公司。
组织RNA提取：将组织匀浆用异硫氢酸胍-氯仿-酸酚一步法提取总RNA[1]。提取出的RNA纯度用紫外分光光度计测定，质量用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
RT-PCR：首先逆转录合成cDNA。取2 μg总RNA为模板加oligo(dT)0.1 μg，65 ℃ 10 min，速冰浴。依次加入5×buffer 5 μl，dNTP 50 μmol.L-1，RNasin 10 U，AMV酶8 U，三蒸水加至25 μl，混匀后42℃ 1 h，94℃ 5 min，-20℃保存。取逆转录产物2 μl为模板，10×buffer 5 μl，dNTP 50 μmol.L-1，25 μmol.L-1 MgCl2 2 μl，Tag酶2 U，B7特异上下游引物，正义[5′AGTA CA AGAACCGGACC-
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TAC3′]，反义[5′GGCGTACACTTTCCC TT CTC3′]各50 pmol，三蒸水加至50 μl，混匀后加石蜡油50 μl置PCR仪扩增35个循环(94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 2 min)。第1循环前94℃预变性5 min，35个循环后72℃延伸10 min。以质粒pcDNA3B7为模板做阳性对照，同时设阴性对照(不加模板)。预先扩增β-actin来证明反转录模板的有效性。
结果分析：PCR产物12 μl在10 g.L-1琼脂糖凝胶上电泳后，以0.5 mg.L-1溴化乙啶染色，使用Gel Doc1000图像分析系统(Bio-Rad USA)，在IBM586PC机上利用Molecular Analyst软件进行观察照相。
免疫组织化学：应用免疫组织化学(LSAB法)对B7 mRNA表达的肿瘤组织行冰冻切片检测其蛋白表达情况。
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1.7 肿瘤组织病理切片观察：组织病理切片HE染色观察肿瘤淋巴细胞浸润情况
统计方法：用SAS统计软件精确概率法统计。
2 结果
总RNA纯度及质量的鉴定：提取出的细胞RNA纯度用紫外分光光度计测定，A260/A280比值在1.7～2.0之间，表明RNA无明显降解，并根据A260值确定RNA质量。RNA质量用10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示18 S、28 S二条RNA电泳带。
RT-PCR结果：5例肾细胞癌表达B7 mRNA，10例癌旁组织均无表达，二者差异无显著性，P>0.05。10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳显示5例肾细胞癌及阳性对照于605 bp处可见条带，其余癌组织及10例癌旁组织均为阴性，染色强度不同表示其表达量不同，经四格表确切概率法统计，两组间P＝0.155(图1)。
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B7 mRNA表达与肾细胞癌分级、分期的关系：22例肾细胞癌中，G1阳性表达1例(1/7)，G2阳性表达3例(3/12)，G3阳性表达1例(1/3)。T1阳性表达1例(1/4)，T2阳性表达2例(2/13)，T3阳性表达2例(2/5)。各组间差异无显著性，P>0.05。
A， DNA marker; B, pcDNA3B7; C-G， renal cell carcinoma.
图1 RT-PCR 检测肾癌组织B7 mRNA的表达
Figure 1 Detection of B7 mRNA on renal cell carcinoma by RT-PCR
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免疫组织化学结果：对B7 mRNA表达的5例肾癌标本进行免疫组化(LSAB法)检测其蛋白表达，4例肿瘤细胞有表达(2例++，2例+)，1例无表达。
肿瘤组织病理切片结果：组织切片HE染色示B7 mRNA表达的肿瘤组织内，淋巴细胞浸润明显增多，并伴有片状坏死灶。
3 讨论
目前认为B7作为一种重要的共刺激分子，在抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用[2～4]。Townsend等[5]将B7+的黑色素瘤K1735细胞注入小鼠体内，不仅诱导产生对母系B7-肿瘤细胞的免疫排斥反应，对其他黑色素瘤细胞也有全身性免疫保护作用。Guo等[6]将肝癌细胞与激活的B细胞融合，作为免疫原治疗已成瘤的大鼠，这个方法利用了B细胞上高表达的一些共刺激分子和粘附分子(包括B7、LFA-1和ICAM-1)，结果对已成瘤的较小肿瘤有治疗作用，这种作用具有肿瘤特异性。Fujh等[7]最近还报道了B7基因在肿瘤转移方面的作用，实验用转染B7-1的肿瘤细胞经放射线照射后作为瘤苗接种，结果对野生型肿瘤细胞在小鼠形成的肺转移瘤有治疗作用。
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本研究结果显示，RT-PCR检测22例肾细胞癌5例有B7 mRNA表达，10例癌旁组织均为阴性，统计学显示差异无显著性，说明大多数肾癌组织无B7表达。这一结果与Hellstrm研究类同，他认为大多数肿瘤细胞没有B7分子的表达，由于肿瘤细胞本身缺乏足够的共刺激信号，所以在体内不能建立有效的抗肿瘤免疫。我们的结果显示5例肾细胞癌有B7 mRNA表达，进一步行冰冻切片免疫组化检测其蛋白表达，结果4例肿瘤细胞有不同程度的表达，在肿瘤组织HE染色病理切片上我们观察到，B7 mRNA表达的肿瘤组织淋巴细胞浸润明显增多，并伴有坏死灶，说明局部抗肿瘤免疫反应增强，提示B7基因表达可能与肿瘤预后有关，有助于延缓肿瘤的发展。Denfeld等[8]应用RT-PCR方法检测B7基因表达，发现表达B7基因的5例原发黑色素瘤，病变部位有抗肿瘤反应的临床和组织学征象，临床上逐渐自然消退，而不表达B7-1基因的肿瘤则呈进行性生长。进一步说明了B7在抗肿瘤中的作用。从B7 mRNA表达与肾癌分级及分期的关系看，统计学分析无相关性，或许与本组病例数少有关。Fujh[4]研究认为肿瘤细胞B7的表达不影响肿瘤的侵袭性。但可减少并治愈转移灶，这可能意味着表达B7基因肿瘤对防止肿瘤转移有作用，从而产生较好的预后。
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B7基因在肾细胞癌表达及意义的揭示，将会为探讨肾癌的发生、发展及免疫生物治疗提供一条新的思路。
☆ 自由词。
参考文献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem ，1987， 162: 156-159
2 Linsley PS, Brady W, Grosmaire LS, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J Exp Med, 1991, 173: 721-730
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3 Chen L, Ashe S, Brady WA, et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counter-receptor for the lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell，1992, 71: 1093-1102
4 张跃建,何球藻,方 舫,等. B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1997, 4: 14-19
5 Townsend SE, Su EW, Atherton JM, et al. Specificity and longevity of antitumor immune response induced by B7-transfected tumors. Cancer Res, 1994, 54: 6477-6483
, 百拇医药
6 Guo Y, Wu M, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994, 263: 518-520
7 Fujh H, Inobe M, KImura F, et al. Vaccination of tumor cells transfected with B7-1(CD80) gene induces the anti-metastatic effect and tumor immunity in mice. Int J Cancer, 1996, 66: 219-224
8 Denfeld RW, Dietrich A, Wutting E, et al. In situ expression of B7 and CD28 receptor families in human malignant melenoma: relevance for T cell mediated anti-tumor immunity. Int J Cancer, 1995, 62: 259-265
(1998-07-13收稿), 百拇医药
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