小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析
作者：宋泉声 韩文玲 刘红涛 马大龙
单位：北京医科大学免疫学系，北京 100083
关键词：TFAR19☆；脱噬作用；DNA拓扑异构酶；序列分析；克隆；分子；序列同源性
北京医科大学学报990407 摘 要 目的：了解一个细胞凋亡相关新基因TFAR19在不同种属间的序列同源性。方法：利用表达序列标签(expressed sequence tag, EST)拼接技术、RT-PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术。结果：首次成功进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析，发现小鼠和人TFAR19 在核苷酸水平上有81.4%的同源性，在氨基酸水平上有高达96%的同源性。功能区分析发现，小鼠TFAR19 cDNA序列含编码126个氨基酸的开放性读码框架，含1个可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，4个可能的PKC 磷酸化位点。其C端的“EDDADY”序列与人DNA拓扑异构酶I141-147位残基序列完全相同。结论：小鼠TFAR19是与人TFAR19高度同源的新基因, 与DNA拓扑异构酶I可能有功能相关性。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q343.11-332
The cDNA cloning and sequencing of a novel mouse apoptosis related gene TFAR19
SONG Quan-Sheng, HAN Wen-Ling, LIU Hong-Tao, MA Da-Long
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To find out the sequence homology of a novel gene TFAR19 (TF-1 cell apoptosis-related gene 19) between different species. Methods: The EST (expressed sequence tag) sequence alignment method, RT-PCR, DNA sequencing, and computer analysis were used for the cDNA cloning. Results: The coding region of mouse TFAR19 cDNA was successfully cloned and sequenced. It was found that there was 81.4% homology at the nucleotide level and 96% homology at the amino acid level between human and mouse TFAR19 cDNA. The sequence revealed an open reading frame encoding 126 amino acids, one potential cAMP and cGMP dependent and four potential protein kinase C phosphorylation sites. A motif “EDDADY” localized at its C terminal end was the same as the residues 141-147 of human DNA topoisomerase I. Conclusion: The mouse TFAR19 sequence is highly homologous with human TFAR19 and may have functional relationship with DNA topoisomerase I.
, 百拇医药
MeSH TFAR19☆ Apoptosis DNA topoisomerase Sequence analysis Cloning, molecular Sequence homology
凋亡(apoptosis)或程序化死亡是基因控制的细胞自我毁灭的过程，在机体发育和内稳定的维持中起着非常重要的作用[1]。凋亡过程受严格控制，涉及到许多基因的参与, 这些基因在种属之间往往非常保守。本室在研究人红白血病细胞株TF-1细胞的去除细胞因子诱导凋亡的机制时，利用cDNA-RDA方法研究了在凋亡过程中差异表达的基因[2]并克隆化成功一个新的全长人类cDNA克隆[3]，发现其编码产物能够促进肿瘤细胞的凋亡，将其命名为TFAR19(TF-1 apoptosis-related gene 19)。为进一步了解不同种属间TFAR19序列的同源性，并且为小鼠体内TFAR19功能研究做准备，本研究借助EST数据库，成功地进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
Quick prep micro mRNA 纯化试剂盒购自Pharmacia 公司；Marathon cDNA 扩增试剂盒购自Clontech 公司；8周龄雄性C57-BL-6小鼠购自我校动物部；pGEM-T easy载体购自Promega公司。
1.2 GenBank数据库检索和EST序列拼接
经国际互联网进入美国GenBank数据库，利用Blast检索nr数据库和EST数据库。将EST数据库检索到的与人TFAR19 cDNA 具有高度同源性的小鼠EST序列在DNAsis 计算机软件进行多序列排列(multiple alignment)，拼接成小鼠TFAR19的完整序列，其中每一碱基至少经2条以上的EST序列的验证。
, 百拇医药 1.3 PCR引物
根据拼接的序列的编码区核苷酸序列合成小鼠TFAR19的PCR引物：上游引物从起始密码子下游第一个氨基酸编码序列开始，序列为：5′-GC GGA CGA AGA ACT TGA GGC-3′，下游引物含终止密码子和HindⅢ酶切点，序列为：5′-CAT AAG CTT AGT AAT CGG CGT CGT CTT-3′
1.4 逆转录PCR和cDNA克隆化
利用quick prep micro mRNA 纯化试剂盒提取雄性C57-BL-6小鼠的骨髓mRNA，再经marathon cDNA 扩增试剂盒构建小鼠骨髓细胞cDNA文库，直接进行小鼠TFAR19 cDNA 的PCR扩增。将扩增产物利用AT 克隆技术克隆进pGEM-T easy 载体，构建成pGEMT-mTFAR19质粒，用于序列测定。
1.5 DNA序列分析
, 百拇医药
由大连宝生物工程公司利用ABI公司的377全自动DNA测序仪进行DNA序列分析。
1.6 序列同源性和功能区分析
利用Hitachi软件公司的DNAsis，PROSITE，Stanford 大学的EMOTIF软件进行小鼠TFAR19的核酸和蛋白序列同源分析及功能区分析[4]。
2 结果
2.1 GenBank数据库检索和EST序列拼接结果
根据本室克隆的人TFAR19 cDNA 序列(GenBank 登记号为AF014955)，经国际互联网进入美国GenBank，利用Blast检索nr数据库，未发现小鼠的TFAR19同源序列；再经EST数据库检索，发现至少有21个长度不一的与人TFAR19高度同源的小鼠EST序列。经过其中的8个互相重叠的EST序列(GenBank登记号分别为AA870917，AA870712，AA253672，AA500885，AA089135，AA611548，AA027638，AA241291)进行计算机拼接，推断出小鼠全长TFAR19 cDNA 序列(图1)。通过计算机同源性分析证明，小鼠和人的TFAR19 cDNA之间有81.4%的同源性，其中编码区的核苷酸序列同源性高达91.8%(小鼠TFAR19序列已在GenBank登记，登记号为AF161074)。
, 百拇医药
图1 小鼠TFAR19 cDNA全序列
Figure 1 The full length sequence of mouse TFAR19 cDNA
2.2 PCR扩增和克隆化结果
由于cDNA的编码区具有重要的应用意义，因而根据推断出小鼠TFAR19 cDNA 编码序列设计引物，从小鼠骨髓cDNA文库中成功地扩增出约380 bp的cDNA片段，证明EST拼接是成功的(图2)。将PCR产物克隆化至pGEM-TeASY载体，获得pGEMT-mTFAR19质粒克隆，经内切酶鉴定证明克隆化成功(图2)。
2.3 序列分析结果
经过对pGEMT-mTFAR19质粒进行序列分析，获得小鼠TFAR19 编码区核酸序列，与预期序列一致(图1)。此序列编码126个氨基酸的开放读码框架，比人TFAR19蛋白多出1个氨基酸，两者间的氨基酸同源性高达96%(图3)。
, 百拇医药
2.4 蛋白质序列的功能区分析
利用DNAsis，PROSITE计算机软件对小鼠TFAR19 蛋白进行分析，发现其缺乏信号肽，缺乏穿膜区序列，计算相对分子质量为14 275，等电点为pI 5.35，Ser100为可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，有4个可能的PKC 磷酸化位点。利用EMOTIF计算机软件分析，发现其C端的“EDDADY”序列与人DNA拓扑异构酶I(DNA topoisomerase Ⅰ)141-147位残基序列完全相同。
Lane 1, M.W Maker(λ DNA+EcoRⅠ+HindⅢ); Lane 2, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA; Lane 3, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA cut by SmaⅠ; Lane 4, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA cut by EcoRⅠ; Lane 5, mouse TFAR19 PCR product.
, 百拇医药
图2 小鼠TFAR19 cDNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Figure 2 Identification of mouse TFAR19 cDNA
by using agarose gel electrophoresis
图3 小鼠(上)和人(下)TFAR19蛋白的序列同源性
Figure 3 The homology of mouse(up)and
human (down)TFAR19 proteins
3 讨论
, 百拇医药 本实验室的研究已经在国际上首次证明，人TFAR19是一种定位于细胞核的具有促进凋亡和抑制增殖效应的重要蛋白分子，对多种白血病细胞株如HL-60、TF-1、K562等具有促进凋亡功能[3]。在进行TFAR19的功能研究中，需要进行小鼠体内外研究和基因敲除研究，因此，克隆小鼠TFAR19 cDNA具有重要的意义。在进行人TFAR19的序列检索时，我们意外发现在EST数据库中有大量小鼠EST与人TFAR19高度同源，因而为小鼠的TFAR19基因克隆提供了便利条件。通过互为重叠的小鼠EST序列进行排列(alignment)，我们成功地获知全长小鼠TFAR19 的cDNA序列，经其编码区序列的PCR扩增和序列分析获得验证，从而为进一步的TFAR19 功能研究打下了基础。这种EST重叠序列拼接技术已经越来越广泛地应用于cDNA克隆化之中，是一条简便快捷的技术路线，可节约大量的工作。但亦应注意假阳性和错误拼接的情况，最终必须经过实验的验证方能作出结论。通过不同种属间TFAR19 同源基因的分析比较，发现TFAR19是一个进化上非常保守的基因，在酵母、线虫、小鼠、大鼠等种属均有未知功能的基因与TFAR19有高度的同源性，证明了这一基因的重要性。小鼠与人TFAR19 在氨基酸水平上有96%的同源性，表明两者在功能上无种属特异性，但两者间在非编码区的同源性较低，提示两者在表达调控中可能有一定差异。利用不同的计算机软件分析小鼠TFAR19的功能区，发现其基本上与人TFAR19的功能区类似，均含有PKA和PKC磷酸化位点，因而可能都具有细胞内信号传导作用。引人注目的是，EMOTIF软件分析发现小鼠TFAR19的C末端序列“EDDADY”与人DNA拓扑异构酶I的141-147位残基的序列完全相同，而人TFAR19的相应位置序列为“EDDDY”，其中缺少一个丙氨酸，因而不能被EMOTIF 软件分析出与人DNA拓扑异构酶I的相似性。文献已经证实，DNA拓扑异构酶I可定位于细胞核[5]，其抑制剂可诱导细胞凋亡[6]。本室已经证实人TFAR19蛋白定位于细胞核，并且可促进细胞凋亡[3]，因而，深入探讨TFAR19与DNA拓扑异构酶I的结构与功能关联是值得研究的课题。总之，小鼠TFAR19的克隆化成功将进一步促进对TFAR19的结构与功能研究，特别是为TFAR19基因knockout或knock in技术打下了基础，为揭示TFAR19生理病理功能提供了条件。
, http://www.100md.com
☆ 自由词。
参考文献
1 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995，267:1 445-1 449
2 刘红涛，王玉刚，张颖妹,等. TF-1细胞凋亡基因的研究.生物化学和生物物理学进展，1999，26(1):38-43
3 Liu HT, Wang YG, Zhang YM, et al. TFAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 254:203-210
, 百拇医药
4 Craig G, Manning N, Thomas D, et al. Highly specific protein sequence motifs for genome analysis. Science, 1998, 95(11): 5 865-5 871
5 Kaufmann SH, Charron M, Burke PJ, et al. Changes in topoisomerase I levels and localization during myeloid maturation in vitro and in vivo. Cancer Res, 1995, 55(6): 1 255-1 260
6 Philip NA, Scott HK, Wai-Yee L, et al. Selective induction of apoptosis in Hep 3B cells by topoisomerase I inhibitors: Evidence for a protease-dependent pathway that does not activate cysteine protease P32. J Clin Invest， 1996, 98( 11) : 2 588-2 596
(1998-07-14收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学免疫学系，北京 100083
关键词：TFAR19☆；脱噬作用；DNA拓扑异构酶；序列分析；克隆；分子；序列同源性
北京医科大学学报990407 摘 要 目的：了解一个细胞凋亡相关新基因TFAR19在不同种属间的序列同源性。方法：利用表达序列标签(expressed sequence tag, EST)拼接技术、RT-PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术。结果：首次成功进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析，发现小鼠和人TFAR19 在核苷酸水平上有81.4%的同源性，在氨基酸水平上有高达96%的同源性。功能区分析发现，小鼠TFAR19 cDNA序列含编码126个氨基酸的开放性读码框架，含1个可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，4个可能的PKC 磷酸化位点。其C端的“EDDADY”序列与人DNA拓扑异构酶I141-147位残基序列完全相同。结论：小鼠TFAR19是与人TFAR19高度同源的新基因, 与DNA拓扑异构酶I可能有功能相关性。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q343.11-332
The cDNA cloning and sequencing of a novel mouse apoptosis related gene TFAR19
SONG Quan-Sheng, HAN Wen-Ling, LIU Hong-Tao, MA Da-Long
(Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To find out the sequence homology of a novel gene TFAR19 (TF-1 cell apoptosis-related gene 19) between different species. Methods: The EST (expressed sequence tag) sequence alignment method, RT-PCR, DNA sequencing, and computer analysis were used for the cDNA cloning. Results: The coding region of mouse TFAR19 cDNA was successfully cloned and sequenced. It was found that there was 81.4% homology at the nucleotide level and 96% homology at the amino acid level between human and mouse TFAR19 cDNA. The sequence revealed an open reading frame encoding 126 amino acids, one potential cAMP and cGMP dependent and four potential protein kinase C phosphorylation sites. A motif “EDDADY” localized at its C terminal end was the same as the residues 141-147 of human DNA topoisomerase I. Conclusion: The mouse TFAR19 sequence is highly homologous with human TFAR19 and may have functional relationship with DNA topoisomerase I.
, 百拇医药
MeSH TFAR19☆ Apoptosis DNA topoisomerase Sequence analysis Cloning, molecular Sequence homology
凋亡(apoptosis)或程序化死亡是基因控制的细胞自我毁灭的过程，在机体发育和内稳定的维持中起着非常重要的作用[1]。凋亡过程受严格控制，涉及到许多基因的参与, 这些基因在种属之间往往非常保守。本室在研究人红白血病细胞株TF-1细胞的去除细胞因子诱导凋亡的机制时，利用cDNA-RDA方法研究了在凋亡过程中差异表达的基因[2]并克隆化成功一个新的全长人类cDNA克隆[3]，发现其编码产物能够促进肿瘤细胞的凋亡，将其命名为TFAR19(TF-1 apoptosis-related gene 19)。为进一步了解不同种属间TFAR19序列的同源性，并且为小鼠体内TFAR19功能研究做准备，本研究借助EST数据库，成功地进行了小鼠TFAR19 cDNA 编码区的cDNA 克隆化和序列分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
Quick prep micro mRNA 纯化试剂盒购自Pharmacia 公司；Marathon cDNA 扩增试剂盒购自Clontech 公司；8周龄雄性C57-BL-6小鼠购自我校动物部；pGEM-T easy载体购自Promega公司。
1.2 GenBank数据库检索和EST序列拼接
经国际互联网进入美国GenBank数据库，利用Blast检索nr数据库和EST数据库。将EST数据库检索到的与人TFAR19 cDNA 具有高度同源性的小鼠EST序列在DNAsis 计算机软件进行多序列排列(multiple alignment)，拼接成小鼠TFAR19的完整序列，其中每一碱基至少经2条以上的EST序列的验证。
, 百拇医药 1.3 PCR引物
根据拼接的序列的编码区核苷酸序列合成小鼠TFAR19的PCR引物：上游引物从起始密码子下游第一个氨基酸编码序列开始，序列为：5′-GC GGA CGA AGA ACT TGA GGC-3′，下游引物含终止密码子和HindⅢ酶切点，序列为：5′-CAT AAG CTT AGT AAT CGG CGT CGT CTT-3′
1.4 逆转录PCR和cDNA克隆化
利用quick prep micro mRNA 纯化试剂盒提取雄性C57-BL-6小鼠的骨髓mRNA，再经marathon cDNA 扩增试剂盒构建小鼠骨髓细胞cDNA文库，直接进行小鼠TFAR19 cDNA 的PCR扩增。将扩增产物利用AT 克隆技术克隆进pGEM-T easy 载体，构建成pGEMT-mTFAR19质粒，用于序列测定。
1.5 DNA序列分析
, 百拇医药
由大连宝生物工程公司利用ABI公司的377全自动DNA测序仪进行DNA序列分析。
1.6 序列同源性和功能区分析
利用Hitachi软件公司的DNAsis，PROSITE，Stanford 大学的EMOTIF软件进行小鼠TFAR19的核酸和蛋白序列同源分析及功能区分析[4]。
2 结果
2.1 GenBank数据库检索和EST序列拼接结果
根据本室克隆的人TFAR19 cDNA 序列(GenBank 登记号为AF014955)，经国际互联网进入美国GenBank，利用Blast检索nr数据库，未发现小鼠的TFAR19同源序列；再经EST数据库检索，发现至少有21个长度不一的与人TFAR19高度同源的小鼠EST序列。经过其中的8个互相重叠的EST序列(GenBank登记号分别为AA870917，AA870712，AA253672，AA500885，AA089135，AA611548，AA027638，AA241291)进行计算机拼接，推断出小鼠全长TFAR19 cDNA 序列(图1)。通过计算机同源性分析证明，小鼠和人的TFAR19 cDNA之间有81.4%的同源性，其中编码区的核苷酸序列同源性高达91.8%(小鼠TFAR19序列已在GenBank登记，登记号为AF161074)。
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图1 小鼠TFAR19 cDNA全序列
Figure 1 The full length sequence of mouse TFAR19 cDNA
2.2 PCR扩增和克隆化结果
由于cDNA的编码区具有重要的应用意义，因而根据推断出小鼠TFAR19 cDNA 编码序列设计引物，从小鼠骨髓cDNA文库中成功地扩增出约380 bp的cDNA片段，证明EST拼接是成功的(图2)。将PCR产物克隆化至pGEM-TeASY载体，获得pGEMT-mTFAR19质粒克隆，经内切酶鉴定证明克隆化成功(图2)。
2.3 序列分析结果
经过对pGEMT-mTFAR19质粒进行序列分析，获得小鼠TFAR19 编码区核酸序列，与预期序列一致(图1)。此序列编码126个氨基酸的开放读码框架，比人TFAR19蛋白多出1个氨基酸，两者间的氨基酸同源性高达96%(图3)。
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2.4 蛋白质序列的功能区分析
利用DNAsis，PROSITE计算机软件对小鼠TFAR19 蛋白进行分析，发现其缺乏信号肽，缺乏穿膜区序列，计算相对分子质量为14 275，等电点为pI 5.35，Ser100为可能的cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，有4个可能的PKC 磷酸化位点。利用EMOTIF计算机软件分析，发现其C端的“EDDADY”序列与人DNA拓扑异构酶I(DNA topoisomerase Ⅰ)141-147位残基序列完全相同。
Lane 1, M.W Maker(λ DNA+EcoRⅠ+HindⅢ); Lane 2, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA; Lane 3, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA cut by SmaⅠ; Lane 4, pGEMT-mTFAR19 plasmid DNA cut by EcoRⅠ; Lane 5, mouse TFAR19 PCR product.
, 百拇医药
图2 小鼠TFAR19 cDNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Figure 2 Identification of mouse TFAR19 cDNA
by using agarose gel electrophoresis
图3 小鼠(上)和人(下)TFAR19蛋白的序列同源性
Figure 3 The homology of mouse(up)and
human (down)TFAR19 proteins
3 讨论
, 百拇医药 本实验室的研究已经在国际上首次证明，人TFAR19是一种定位于细胞核的具有促进凋亡和抑制增殖效应的重要蛋白分子，对多种白血病细胞株如HL-60、TF-1、K562等具有促进凋亡功能[3]。在进行TFAR19的功能研究中，需要进行小鼠体内外研究和基因敲除研究，因此，克隆小鼠TFAR19 cDNA具有重要的意义。在进行人TFAR19的序列检索时，我们意外发现在EST数据库中有大量小鼠EST与人TFAR19高度同源，因而为小鼠的TFAR19基因克隆提供了便利条件。通过互为重叠的小鼠EST序列进行排列(alignment)，我们成功地获知全长小鼠TFAR19 的cDNA序列，经其编码区序列的PCR扩增和序列分析获得验证，从而为进一步的TFAR19 功能研究打下了基础。这种EST重叠序列拼接技术已经越来越广泛地应用于cDNA克隆化之中，是一条简便快捷的技术路线，可节约大量的工作。但亦应注意假阳性和错误拼接的情况，最终必须经过实验的验证方能作出结论。通过不同种属间TFAR19 同源基因的分析比较，发现TFAR19是一个进化上非常保守的基因，在酵母、线虫、小鼠、大鼠等种属均有未知功能的基因与TFAR19有高度的同源性，证明了这一基因的重要性。小鼠与人TFAR19 在氨基酸水平上有96%的同源性，表明两者在功能上无种属特异性，但两者间在非编码区的同源性较低，提示两者在表达调控中可能有一定差异。利用不同的计算机软件分析小鼠TFAR19的功能区，发现其基本上与人TFAR19的功能区类似，均含有PKA和PKC磷酸化位点，因而可能都具有细胞内信号传导作用。引人注目的是，EMOTIF软件分析发现小鼠TFAR19的C末端序列“EDDADY”与人DNA拓扑异构酶I的141-147位残基的序列完全相同，而人TFAR19的相应位置序列为“EDDDY”，其中缺少一个丙氨酸，因而不能被EMOTIF 软件分析出与人DNA拓扑异构酶I的相似性。文献已经证实，DNA拓扑异构酶I可定位于细胞核[5]，其抑制剂可诱导细胞凋亡[6]。本室已经证实人TFAR19蛋白定位于细胞核，并且可促进细胞凋亡[3]，因而，深入探讨TFAR19与DNA拓扑异构酶I的结构与功能关联是值得研究的课题。总之，小鼠TFAR19的克隆化成功将进一步促进对TFAR19的结构与功能研究，特别是为TFAR19基因knockout或knock in技术打下了基础，为揭示TFAR19生理病理功能提供了条件。
, http://www.100md.com
☆ 自由词。
参考文献
1 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995，267:1 445-1 449
2 刘红涛，王玉刚，张颖妹,等. TF-1细胞凋亡基因的研究.生物化学和生物物理学进展，1999，26(1):38-43
3 Liu HT, Wang YG, Zhang YM, et al. TFAR19, a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 254:203-210
, 百拇医药
4 Craig G, Manning N, Thomas D, et al. Highly specific protein sequence motifs for genome analysis. Science, 1998, 95(11): 5 865-5 871
5 Kaufmann SH, Charron M, Burke PJ, et al. Changes in topoisomerase I levels and localization during myeloid maturation in vitro and in vivo. Cancer Res, 1995, 55(6): 1 255-1 260
6 Philip NA, Scott HK, Wai-Yee L, et al. Selective induction of apoptosis in Hep 3B cells by topoisomerase I inhibitors: Evidence for a protease-dependent pathway that does not activate cysteine protease P32. J Clin Invest， 1996, 98( 11) : 2 588-2 596
(1998-07-14收稿), 百拇医药