同型半胱氨酸对大鼠心肌细胞钙摄取的影响
作者：李载权 马 健 张钧华 高 炜 周爱儒 唐朝枢 刘乃奎
单位：李载权 张钧华 高 炜 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所，北京 100034；马 健 中国人民解放军海军总医院心内科；周爱儒 北京医科大学心血管基础研究所)
关键词：半胱氨酸；药理学；钙；代谢；心肌；代谢
北京医科大学学报990404 摘 要 目的：研究同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)对心肌细胞钙摄取的影响及其作用机制。方法：采用同位素技术测定培养大鼠心肌细胞钙的摄取，观察不同HCY浓度对培养心肌细胞钙摄取的影响及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制剂或蛋白磷酸酶抑制剂与HCY同时培养对培养心肌细胞钙摄取的影响。结果：HCY呈浓度依赖性促进心肌细胞钙的摄取，HCY促进心肌细胞钙摄取的作用为PKC抑制剂H7和多粘菌素(polymycin B, PB)所抑制，并且受蛋白磷酸酶抑制剂Okadaic acid 作用而增强。结论：HCY促进心肌细胞钙摄取，可能与PKC所介导的蛋白磷酸化过程有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R542.2
Effect of homocysteine on calcium uptake in rat cardiomyocyte
LI Zai-Quan＃, MA Jian, ZHANG Jun-Hua, GAO Wei, ZHOU Ai-Ru, TANG Chao-Shu, et al
(＃Department of Cardiovascular Research, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To study the effect of homocysteine (HCY) on calcium uptake in rat cardiomyocyte and its mechanism. Methods: The calcium uptake by rat cardiomyocyte was assayed with isotopic methods. The in vitro study observed the influences of liner increasing concentrations of HCY, and those of protein kinase C (PKC) inhibitors and selective inhibitor of protein phosphatase type 1 and 2A, Okadaic acid, combined with HCY on the calcium uptake in rat cardiomyocyte. Results: HCY promoted the calcium uptake in a dose-dependent way, and this promoting effect was blocked by PKC inhibitors, H7 and polymycin B, but stimulated by selective inhibitor of protein phosphatase type 1 and 2A, Okadaic acid. Conclusion：The calcium uptake in rat cardiomyocytes was induced by HCY possibly through cellular PKC pathway.
, 百拇医药
MeSH Cysteine/pharmacol Myocardium/metab Calcium/metab
近年大量流行病学和实验资料都证实高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化、冠心病的一个独立危险因子[1，2]，但其作用机制目前尚未完全阐明。实验发现同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)对大鼠血管平滑肌细胞具有较强的促增殖效应[3]，但对心肌细胞的直接影响还未见报道。本工作利用培养心肌细胞观察同型半胱氨酸对心肌细胞钙摄取的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠(7 d龄)为北京医科大学实验动物部提供，45Ca为Amersham Life Science 公司产品，RPMI-1640为Gibco公司产品，小牛血清、HCY、H7、PB(polymycin B)及OA(Okadaic acid)均为Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 大鼠心肌细胞的培养及其药物处理
按本室报道的方法[4]分离培养大鼠心肌细胞，实验用第3代细胞。按每孔5×105细胞接种在24孔培养板中，待细胞贴壁生长后更换为以下含不同药物的培养液继续培养1 h，弃去培养液用PBS洗涤细胞1次后，加入RPMI-1640培养液进行45Ca摄取的测定。
实验分组：单纯HCY组培养液中含HCY 1 mmol.L-1；HCY不同浓度组培养液中分别含HCY 0、0.5、1.2 mmol.L-1。H7组或PB组培养液中分别含蛋白激酶C(protein kinase C)抑制剂H7 40 μmol.L-1或PB 0.48 g.L-1，OA组培养液中含蛋白磷酸化酶抑制剂OA 40 nmol.L-1，各联合用药组培养液中分别含HCY 1 mmol.L-1加H7 40 μmol.L-1、PB 0.48 g.L-1或OA 40 nmol.L-1。对照组培养液中不含HCY和上述抑制剂。
, 百拇医药
1.3 心肌细胞45Ca摄取的测定
向上述各组经预孵育过的细胞中加入2.7×103 Bq.ml-1 45Ca培养液(钙浓度为0.85 mmol.L-1)，然后再孵育15 min，迅速刮取各孔贴壁细胞，在Millipore上经微孔滤膜(0.45 μm)抽滤，PBS洗涤3次和10%(体积分数)三氯醋酸1次。将滤膜干燥后加入闪烁液在β液闪仪上测定钙的放射活性。
1.4 资料的统计学处理
实验平行操作6次，结果以
±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
2 结果
, 百拇医药
本实验同型半胱氨酸在0.5～2 mmol.L-1范围内呈浓度依赖性促进心肌细胞钙的摄取，HCY各组对心肌细胞钙摄取值较对照组增加43%～350%(P<0.01)，结果如图1所示。
**P<0.01, vs control group (n=6,±s).
图1 同型半胱氨酸对心肌细胞钙摄取的影响
Figure 1 Effect of homocysteine on calcium uptake in rat cardiomyocyte
应用H7 40 μmol.L-1 、PB 0.48 g.L-1或OA 40 nmol.L-1孵育心肌细胞，结果心肌细胞钙摄取分别为每106细胞(6.3±1.1)、(6.4±1.3)和(6.4±1.3) nmol，与对照组(5.6±0.4) nmol相近，差异无统计学意义(P>0.05)。但是同时与1 mmol.L-1 HCY联合孵育时，H7或PB则显著抑制由HCY引起的促心肌细胞钙摄取作用，与单纯1 mmol.L-1 HCY组心肌细胞钙摄取(每106细胞钙摄取nmol量)相比,H7和PB分别降低38%(7.2±0.7 vs 11.7±1.8, P<0.01)、42%(7.7±1.0 vs 11.7±1.8, P<0.01)；反之，OA与1 mmol.L-1 HCY同时孵育则明显增强HCY促心肌细胞钙摄取作用，较单纯1 mmol.L-1 HCY组心肌细胞钙摄取增加17%(13.8±1.3 vs 11.7±1.8, P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
本工作在培养大鼠心肌细胞上观察到HCY呈浓度依赖性刺激心肌细胞钙摄取；PKC抑制剂H7组和PB组与对照组心肌细胞钙摄取差异无统计学意义，但H7和PB与HCY同时孵育心肌细胞与单纯HCY组相比，心肌细胞钙摄取作用明显受到抑制，因此H7和PB均能明显抑制HCY刺激的心肌细胞钙摄取作用，提示HCY刺激心肌细胞钙摄取为细胞内PKC所介导；OA是1和2A型蛋白磷酸酶特异性抑制剂，能抑制细胞内去磷酸化反应而增强磷酸化效应，本实验OA对于对照组心肌细胞钙摄取没有影响，但能显著增强HCY刺激的心肌细胞钙摄取作用。提示HCY促进心肌细胞钙摄取可能与通过PKC所介导的蛋白磷酸化过程有关。
HCY是体内蛋氨酸代谢的中间产物，正常人禁食时血浆中总HCY浓度很低，约为7.0～21.7 μmol.L-1，但冠心病病人血浆中浓度可高达数百μmol.L-1。HCY生物学效应的信号转导机制目前尚不清楚。田清平等[5]在血管平滑肌细胞上研究发现，HCY可通过质膜上特殊受体/转运体激活细胞内丝裂素活化蛋白激酶系统、促进原癌基因的表达，进而导致细胞的增殖。从本工作结果我们推测HCY可能是经过心肌细胞特殊受体/转运体途径，激活细胞内PKC，然后增强包括钙通道蛋白在内的PKC底物蛋白的磷酸化反应，进而导致心肌细胞钙摄取的增加。
, 百拇医药
心肌细胞内钙稳态是维持心肌细胞正常功能和代谢的基础条件，而心肌细胞钙负荷超载是心肌缺血、心肌梗死和心肌缺血再损伤等发病过程中的重要环节。因此HCY刺激心肌细胞钙摄取的作用及其在心血管疾病中的病理生理意义值得深入研究。
国家自然科学基金(39570300，39730220)资助项目。
参考文献
1 Ueland PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk factor for vascular disease: plasma levels in health, disease, and drug therapy. J Lab Clin Med, 1989,114:473-501
2 朱燕青，张晨晖，陈光慧.同型半胱氨酸——心血管疾病的一个独立危险因素.生理科学进展，1997，28：333-335
, 百拇医药
3 Dalton ML, Gadson PF, Wermm RM, et al. Homocysteine signal cascade: production of phospholipids, activation of protein kinase C, and induction of c-fos and c-myb in smooth muscle cells. FASEB J, 1997,11:703-711
4 刘秀华,庞永正,唐朝枢，等.缺氧预处理对乳鼠心肌细胞蛋白激酶C活性的影响.生理学报，1995，47：357-365
5 田清平，刘乃奎，朱燕青，等.丝裂素活化蛋白激酶介导同型半胱氨酸的血管平滑肌细胞增殖.北京医科大学学报，1998，30：197-198
(1998-09-03收稿), http://www.100md.com
单位：李载权 张钧华 高 炜 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所，北京 100034；马 健 中国人民解放军海军总医院心内科；周爱儒 北京医科大学心血管基础研究所)
关键词：半胱氨酸；药理学；钙；代谢；心肌；代谢
北京医科大学学报990404 摘 要 目的：研究同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)对心肌细胞钙摄取的影响及其作用机制。方法：采用同位素技术测定培养大鼠心肌细胞钙的摄取，观察不同HCY浓度对培养心肌细胞钙摄取的影响及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制剂或蛋白磷酸酶抑制剂与HCY同时培养对培养心肌细胞钙摄取的影响。结果：HCY呈浓度依赖性促进心肌细胞钙的摄取，HCY促进心肌细胞钙摄取的作用为PKC抑制剂H7和多粘菌素(polymycin B, PB)所抑制，并且受蛋白磷酸酶抑制剂Okadaic acid 作用而增强。结论：HCY促进心肌细胞钙摄取，可能与PKC所介导的蛋白磷酸化过程有关。
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中国图书资料分类法分类号 R542.2
Effect of homocysteine on calcium uptake in rat cardiomyocyte
LI Zai-Quan＃, MA Jian, ZHANG Jun-Hua, GAO Wei, ZHOU Ai-Ru, TANG Chao-Shu, et al
(＃Department of Cardiovascular Research, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To study the effect of homocysteine (HCY) on calcium uptake in rat cardiomyocyte and its mechanism. Methods: The calcium uptake by rat cardiomyocyte was assayed with isotopic methods. The in vitro study observed the influences of liner increasing concentrations of HCY, and those of protein kinase C (PKC) inhibitors and selective inhibitor of protein phosphatase type 1 and 2A, Okadaic acid, combined with HCY on the calcium uptake in rat cardiomyocyte. Results: HCY promoted the calcium uptake in a dose-dependent way, and this promoting effect was blocked by PKC inhibitors, H7 and polymycin B, but stimulated by selective inhibitor of protein phosphatase type 1 and 2A, Okadaic acid. Conclusion：The calcium uptake in rat cardiomyocytes was induced by HCY possibly through cellular PKC pathway.
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MeSH Cysteine/pharmacol Myocardium/metab Calcium/metab
近年大量流行病学和实验资料都证实高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化、冠心病的一个独立危险因子[1，2]，但其作用机制目前尚未完全阐明。实验发现同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)对大鼠血管平滑肌细胞具有较强的促增殖效应[3]，但对心肌细胞的直接影响还未见报道。本工作利用培养心肌细胞观察同型半胱氨酸对心肌细胞钙摄取的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
SD大鼠(7 d龄)为北京医科大学实验动物部提供，45Ca为Amersham Life Science 公司产品，RPMI-1640为Gibco公司产品，小牛血清、HCY、H7、PB(polymycin B)及OA(Okadaic acid)均为Sigma公司产品。
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1.2 大鼠心肌细胞的培养及其药物处理
按本室报道的方法[4]分离培养大鼠心肌细胞，实验用第3代细胞。按每孔5×105细胞接种在24孔培养板中，待细胞贴壁生长后更换为以下含不同药物的培养液继续培养1 h，弃去培养液用PBS洗涤细胞1次后，加入RPMI-1640培养液进行45Ca摄取的测定。
实验分组：单纯HCY组培养液中含HCY 1 mmol.L-1；HCY不同浓度组培养液中分别含HCY 0、0.5、1.2 mmol.L-1。H7组或PB组培养液中分别含蛋白激酶C(protein kinase C)抑制剂H7 40 μmol.L-1或PB 0.48 g.L-1，OA组培养液中含蛋白磷酸化酶抑制剂OA 40 nmol.L-1，各联合用药组培养液中分别含HCY 1 mmol.L-1加H7 40 μmol.L-1、PB 0.48 g.L-1或OA 40 nmol.L-1。对照组培养液中不含HCY和上述抑制剂。
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1.3 心肌细胞45Ca摄取的测定
向上述各组经预孵育过的细胞中加入2.7×103 Bq.ml-1 45Ca培养液(钙浓度为0.85 mmol.L-1)，然后再孵育15 min，迅速刮取各孔贴壁细胞，在Millipore上经微孔滤膜(0.45 μm)抽滤，PBS洗涤3次和10%(体积分数)三氯醋酸1次。将滤膜干燥后加入闪烁液在β液闪仪上测定钙的放射活性。
1.4 资料的统计学处理
实验平行操作6次，结果以
±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。2 结果
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本实验同型半胱氨酸在0.5～2 mmol.L-1范围内呈浓度依赖性促进心肌细胞钙的摄取，HCY各组对心肌细胞钙摄取值较对照组增加43%～350%(P<0.01)，结果如图1所示。
**P<0.01, vs control group (n=6,
±s).图1 同型半胱氨酸对心肌细胞钙摄取的影响
Figure 1 Effect of homocysteine on calcium uptake in rat cardiomyocyte
应用H7 40 μmol.L-1 、PB 0.48 g.L-1或OA 40 nmol.L-1孵育心肌细胞，结果心肌细胞钙摄取分别为每106细胞(6.3±1.1)、(6.4±1.3)和(6.4±1.3) nmol，与对照组(5.6±0.4) nmol相近，差异无统计学意义(P>0.05)。但是同时与1 mmol.L-1 HCY联合孵育时，H7或PB则显著抑制由HCY引起的促心肌细胞钙摄取作用，与单纯1 mmol.L-1 HCY组心肌细胞钙摄取(每106细胞钙摄取nmol量)相比,H7和PB分别降低38%(7.2±0.7 vs 11.7±1.8, P<0.01)、42%(7.7±1.0 vs 11.7±1.8, P<0.01)；反之，OA与1 mmol.L-1 HCY同时孵育则明显增强HCY促心肌细胞钙摄取作用，较单纯1 mmol.L-1 HCY组心肌细胞钙摄取增加17%(13.8±1.3 vs 11.7±1.8, P<0.01)。
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3 讨论
本工作在培养大鼠心肌细胞上观察到HCY呈浓度依赖性刺激心肌细胞钙摄取；PKC抑制剂H7组和PB组与对照组心肌细胞钙摄取差异无统计学意义，但H7和PB与HCY同时孵育心肌细胞与单纯HCY组相比，心肌细胞钙摄取作用明显受到抑制，因此H7和PB均能明显抑制HCY刺激的心肌细胞钙摄取作用，提示HCY刺激心肌细胞钙摄取为细胞内PKC所介导；OA是1和2A型蛋白磷酸酶特异性抑制剂，能抑制细胞内去磷酸化反应而增强磷酸化效应，本实验OA对于对照组心肌细胞钙摄取没有影响，但能显著增强HCY刺激的心肌细胞钙摄取作用。提示HCY促进心肌细胞钙摄取可能与通过PKC所介导的蛋白磷酸化过程有关。
HCY是体内蛋氨酸代谢的中间产物，正常人禁食时血浆中总HCY浓度很低，约为7.0～21.7 μmol.L-1，但冠心病病人血浆中浓度可高达数百μmol.L-1。HCY生物学效应的信号转导机制目前尚不清楚。田清平等[5]在血管平滑肌细胞上研究发现，HCY可通过质膜上特殊受体/转运体激活细胞内丝裂素活化蛋白激酶系统、促进原癌基因的表达，进而导致细胞的增殖。从本工作结果我们推测HCY可能是经过心肌细胞特殊受体/转运体途径，激活细胞内PKC，然后增强包括钙通道蛋白在内的PKC底物蛋白的磷酸化反应，进而导致心肌细胞钙摄取的增加。
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心肌细胞内钙稳态是维持心肌细胞正常功能和代谢的基础条件，而心肌细胞钙负荷超载是心肌缺血、心肌梗死和心肌缺血再损伤等发病过程中的重要环节。因此HCY刺激心肌细胞钙摄取的作用及其在心血管疾病中的病理生理意义值得深入研究。
国家自然科学基金(39570300，39730220)资助项目。
参考文献
1 Ueland PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk factor for vascular disease: plasma levels in health, disease, and drug therapy. J Lab Clin Med, 1989,114:473-501
2 朱燕青，张晨晖，陈光慧.同型半胱氨酸——心血管疾病的一个独立危险因素.生理科学进展，1997，28：333-335
, 百拇医药
3 Dalton ML, Gadson PF, Wermm RM, et al. Homocysteine signal cascade: production of phospholipids, activation of protein kinase C, and induction of c-fos and c-myb in smooth muscle cells. FASEB J, 1997,11:703-711
4 刘秀华,庞永正,唐朝枢，等.缺氧预处理对乳鼠心肌细胞蛋白激酶C活性的影响.生理学报，1995，47：357-365
5 田清平，刘乃奎，朱燕青，等.丝裂素活化蛋白激酶介导同型半胱氨酸的血管平滑肌细胞增殖.北京医科大学学报，1998，30：197-198
(1998-09-03收稿), http://www.100md.com