pREP8和pREP4质粒对HEK293细胞β2-肾上腺素受体的表达及其介导cAMP蓄积的影响*
作者：李云芳 雷蓓蕾 张幼怡 韩启德
单位：北京医科大学第三医院血管医学研究所，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990625 以质粒携带某一亚型受体的cDNA转染细胞株，通过亚细胞克隆得到稳定表达某亚型受体的亚克隆细胞株，是肾上腺素受体(AR)研究中常用的方法。我们最近的研究发现，α1A-、α1B-和α1D-AR全长cDNA分别由pREP8、pREP4和pREP9质粒携带 (pREP8/α1A 、pREP4/α1B、pREP9/α1D)，转入人胚肾(HEK293)细胞并稳定表达后，均显著增加原先细胞天然β2-AR的表达量及其介导的cAMP蓄积最大效应。本研究拟排除上述作用是由于携带外源cDNA的质粒本身带来的影响,而非转入α1-AR的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HEK293细胞、质粒pREP8和pREP4由美国Emory大学Kenneth P.Minneman教授赠送。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate (cAMP)、3-isobutyl-xanthin(IBMX)、组胺醇(histidinol)和潮霉素B(hygromycin B)均购自Sigma公司。
1.2 细胞培养与转染
HEK293细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%(体积分数)CO2孵育箱中培养。采用磷酸钙沉淀法将质粒pREP8和pREP4分别转染到 HEK293细胞中，每个35mm平皿分别加入10μg pREP8和pREP4，转染72h后，根据质粒的筛选标记分别加入2g.L-1组胺醇和0.25g.L-1潮霉素B进行筛选，并持续在含有筛选抗生素的DMEM培养基中培养、传代。
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1.3 β2-AR表达量的测定
参照Engel与Hoyer[1]报道的方法,将培养瓶中的细胞刮下并收集于10ml PBS中，再分别以3000×g和15000×g、4℃条件各离心10 min,最后加入4 ml PBS混匀，制成细胞粗制膜标本。将125I-BE2254稀释成6种不同的浓度各50μl，分别与100μl细胞粗制膜标本、100μl牛血清白蛋白(BSA)或50μl BSA与50μl普萘洛尔(50μmol.L-1)冰浴中混匀后，37℃温育20min,用10mmol.L-1冷Tris-HCl缓冲液终止反应，经玻璃纤维滤膜抽滤，再用Tris-HCl缓冲液洗两次，抽干滤膜，用γ计数器测定滤膜的放射活性(Bq值)得出125I-BE2254结合饱和曲线,计算机做非线性回归和Scatchard分析，求出受体与拮抗剂的最大结合容量 ( Bmax),采用考马斯亮蓝蛋白定量法测定膜标本中蛋白含量。
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1.4 cAMP蓄积测定
参照Esbenshade等[2]的方法,将转染pREP8和pREP4后及未转染的HEK293细胞，分别种人24孔培养板,待细胞长满后,加入1.8×104Bq 3H-adenine/孔，孵育2h，弃培养液，用温krebs液洗2次,在含有200μmol.L-1IBMX的1ml krebs液中加人不同浓度的NE 20μl 孵育30min,4.7mol.L-1三氯醋酸终止反应,3000×g、4℃离心20min,取50μl,测cAMP值为总管计数,余液入Dowex柱,再经Aluminal柱后,加2 ml Tris-HCl于Aluminal柱,将流出的洗脱液收集于闪烁瓶并加10 ml闪烁液,测cAMP值为测定管计数, cAMP生成量以生成之cAMP的Bq值占参入之3H-adenine的Bq值的百分比(亦即cAMP蓄积)来表示。
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1.5 统计学处理
数据用
±s表示,两组之间比较用t检验,P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 质粒pREP8和pREP4对HEK293细胞β2-AR表达的影响
未转染的HEK293细胞基础表达量为(36±12) fmol.mg-1,成功转染pREP8和pREP4后，β2-AR的表达量分别为(68±11)和(99±30) fmol.mg-1，较基础表达分别增加88%和170%(P<0.01)。
2.2 质粒pREP8和pREP4对HEK293细胞β2-AR介导cAMP蓄积的影响
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100 μmol.L-1NE引起的未转染的HEK293细胞基础cAMP蓄积的最大效应为(0.17±0.08)%，在分别成功转染pREP8和pREP4后，cAMP蓄积最大效应分别为(0.45±0.17)%和(0.30±0.12)，较基础蓄积分别增加164%和77%(P<0.05)。
3 讨论
HEK293细胞株具有仅天然表达β2-AR ,而不表达任何其它亚型AR的特点,我们用其研究α-AR与β-AR间交互作用时发现，pREP8、pREP4和pREP9分别携带α1A-、α1B-和α1D-AR的全长cDNA，用磷酸钙沉淀法分别转染细胞并使α1-AR 3种亚型稳定表达后，均有细胞 β2-AR 的表达和介导cAMP最大蓄积效应不同程度的增加。最近赵文等[3]报道肌肉注射不携带外源目的cDNA的质粒使肌细胞cAMP升高。那么,我们实验中β2-AR的表达和介导cAMP蓄积的增加,是由转入后表达的α1-AR与β2-AR分子间的直接的相互作用引起的[4],还是所转入的质粒DNA所引起的效应？本实验采用与转染pREP8/α1A和pREP4/α1B同样的方法,发现不携带α1-AR cDNA的质粒pREP8和pREP4的转入也能使HEK293细胞β2-AR的表达和介导cAMP最大蓄积效应增加。由于无法确定转入pREP8和pREP4的量,因此,无法比较带或不带α1-AR cDNA的pREP8或pREP4转入量是否相同,也就无法比较带或不带α1-AR cDNA时对β2-AR表达以及cAMP蓄积效应的影响。所以根据本实验结果尚不能肯定以前实验中所见转染α1-AR cDNA后对β2-AR表达以及cAMP蓄积效应的影响即完全是由于转染质粒本身所引起。但本实验结果至少可提示在采用转染目的基因来研究该基因表达或表达物效应时,必须考虑到携带目的基因的质粒DNA本身的影响,必须在实验中设立单独转染质粒DNA的对照组。
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关于质粒DNA进入细胞引起生物学效应的机制,文献报道甚少。Hagstrom等[5]在家兔骨骼肌肌浆网(SR)上发现DNA结合蛋白,但其功能尚不清楚。最近又有研究发现大鼠骨骼肌SR也存在DNA结合蛋白,对不同的DNA无选择性[6],并在以后的研究中发现质粒DNA与SR结合后,能使SR摄取和释放Ca2+增加,推测可能是质粒DNA携带的负电荷使SR膜环境发生改变,促进SR对Ca2+的摄取所致[7],并认为质粒DNA还可能与胞浆内的DNA结合蛋白结合，激活胞浆内的某些DNA结合蛋白,如STATs家族,从而使后者发生核转位,进入核内作为转录调控因子发挥作用[8]。质粒转染使β2-AR的表达量上调是否通过以上类似的机制影响β2-AR转录后的调节或激活胞浆内的某些DNA结合蛋白实现的,尚不清楚,其机制有待进一步研究。
*国家自然科学基金(39670274)资助课题。
, 百拇医药
参考文献
1 Engel G,Hoyer D. [125I]BE2254, a new high affinity radioligand for alpha1-adrenoceptors.Eur J Pharmacol,1981,73(2-3):221-224
2 Esbenshade TA,Han C,Theroux TL, et al. Coexisting β1-AR and atypical β-adrenergic receptors cause redundant increases in cyclic AMP in human neurolastoma cells.Mol Pharmacol,1992,42(5):753-759
3 赵 文,汤 健,贾弘
.直接肌注射质粒DNA对肌组织cAMP、cGMP含量的影响.基础医学与临床,1998,18(6)24-26
, 百拇医药
4 Maggio R, Vogel Z, Wess J, et al. Coexpression studies with mutant muscurincic/adrenergic receptors provide evidence for intermolecular cross-talk between G-protein-linked receptors.Proc Natl Acad Sci USA ,1993,90:3103-3109
5 Hagastrom JE, Rybakova IN, Wollf JA, et al. Nonnucleaer DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med,1996,58:113-1216
6 赵 文,汤 健,贾弘.序列非依赖性的骨骼肌膜DNA结合蛋白.北京医科大学学报,1999,31(1):5-8
7 赵 文,李载权,姜志胜,等.质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响. 北京医科大学学报,1999,31(4):297-299
8 Darnell JE JR.STATs and gene regulation. Science,1997,277:1630-1635
(1999-09-17收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第三医院血管医学研究所，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990625 以质粒携带某一亚型受体的cDNA转染细胞株，通过亚细胞克隆得到稳定表达某亚型受体的亚克隆细胞株，是肾上腺素受体(AR)研究中常用的方法。我们最近的研究发现，α1A-、α1B-和α1D-AR全长cDNA分别由pREP8、pREP4和pREP9质粒携带 (pREP8/α1A 、pREP4/α1B、pREP9/α1D)，转入人胚肾(HEK293)细胞并稳定表达后，均显著增加原先细胞天然β2-AR的表达量及其介导的cAMP蓄积最大效应。本研究拟排除上述作用是由于携带外源cDNA的质粒本身带来的影响,而非转入α1-AR的影响。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HEK293细胞、质粒pREP8和pREP4由美国Emory大学Kenneth P.Minneman教授赠送。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate (cAMP)、3-isobutyl-xanthin(IBMX)、组胺醇(histidinol)和潮霉素B(hygromycin B)均购自Sigma公司。
1.2 细胞培养与转染
HEK293细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%(体积分数)CO2孵育箱中培养。采用磷酸钙沉淀法将质粒pREP8和pREP4分别转染到 HEK293细胞中，每个35mm平皿分别加入10μg pREP8和pREP4，转染72h后，根据质粒的筛选标记分别加入2g.L-1组胺醇和0.25g.L-1潮霉素B进行筛选，并持续在含有筛选抗生素的DMEM培养基中培养、传代。
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1.3 β2-AR表达量的测定
参照Engel与Hoyer[1]报道的方法,将培养瓶中的细胞刮下并收集于10ml PBS中，再分别以3000×g和15000×g、4℃条件各离心10 min,最后加入4 ml PBS混匀，制成细胞粗制膜标本。将125I-BE2254稀释成6种不同的浓度各50μl，分别与100μl细胞粗制膜标本、100μl牛血清白蛋白(BSA)或50μl BSA与50μl普萘洛尔(50μmol.L-1)冰浴中混匀后，37℃温育20min,用10mmol.L-1冷Tris-HCl缓冲液终止反应，经玻璃纤维滤膜抽滤，再用Tris-HCl缓冲液洗两次，抽干滤膜，用γ计数器测定滤膜的放射活性(Bq值)得出125I-BE2254结合饱和曲线,计算机做非线性回归和Scatchard分析，求出受体与拮抗剂的最大结合容量 ( Bmax),采用考马斯亮蓝蛋白定量法测定膜标本中蛋白含量。
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1.4 cAMP蓄积测定
参照Esbenshade等[2]的方法,将转染pREP8和pREP4后及未转染的HEK293细胞，分别种人24孔培养板,待细胞长满后,加入1.8×104Bq 3H-adenine/孔，孵育2h，弃培养液，用温krebs液洗2次,在含有200μmol.L-1IBMX的1ml krebs液中加人不同浓度的NE 20μl 孵育30min,4.7mol.L-1三氯醋酸终止反应,3000×g、4℃离心20min,取50μl,测cAMP值为总管计数,余液入Dowex柱,再经Aluminal柱后,加2 ml Tris-HCl于Aluminal柱,将流出的洗脱液收集于闪烁瓶并加10 ml闪烁液,测cAMP值为测定管计数, cAMP生成量以生成之cAMP的Bq值占参入之3H-adenine的Bq值的百分比(亦即cAMP蓄积)来表示。
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1.5 统计学处理
数据用
±s表示,两组之间比较用t检验,P<0.05认为差异有显著性。2 结果
2.1 质粒pREP8和pREP4对HEK293细胞β2-AR表达的影响
未转染的HEK293细胞基础表达量为(36±12) fmol.mg-1,成功转染pREP8和pREP4后，β2-AR的表达量分别为(68±11)和(99±30) fmol.mg-1，较基础表达分别增加88%和170%(P<0.01)。
2.2 质粒pREP8和pREP4对HEK293细胞β2-AR介导cAMP蓄积的影响
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100 μmol.L-1NE引起的未转染的HEK293细胞基础cAMP蓄积的最大效应为(0.17±0.08)%，在分别成功转染pREP8和pREP4后，cAMP蓄积最大效应分别为(0.45±0.17)%和(0.30±0.12)，较基础蓄积分别增加164%和77%(P<0.05)。
3 讨论
HEK293细胞株具有仅天然表达β2-AR ,而不表达任何其它亚型AR的特点,我们用其研究α-AR与β-AR间交互作用时发现，pREP8、pREP4和pREP9分别携带α1A-、α1B-和α1D-AR的全长cDNA，用磷酸钙沉淀法分别转染细胞并使α1-AR 3种亚型稳定表达后，均有细胞 β2-AR 的表达和介导cAMP最大蓄积效应不同程度的增加。最近赵文等[3]报道肌肉注射不携带外源目的cDNA的质粒使肌细胞cAMP升高。那么,我们实验中β2-AR的表达和介导cAMP蓄积的增加,是由转入后表达的α1-AR与β2-AR分子间的直接的相互作用引起的[4],还是所转入的质粒DNA所引起的效应？本实验采用与转染pREP8/α1A和pREP4/α1B同样的方法,发现不携带α1-AR cDNA的质粒pREP8和pREP4的转入也能使HEK293细胞β2-AR的表达和介导cAMP最大蓄积效应增加。由于无法确定转入pREP8和pREP4的量,因此,无法比较带或不带α1-AR cDNA的pREP8或pREP4转入量是否相同,也就无法比较带或不带α1-AR cDNA时对β2-AR表达以及cAMP蓄积效应的影响。所以根据本实验结果尚不能肯定以前实验中所见转染α1-AR cDNA后对β2-AR表达以及cAMP蓄积效应的影响即完全是由于转染质粒本身所引起。但本实验结果至少可提示在采用转染目的基因来研究该基因表达或表达物效应时,必须考虑到携带目的基因的质粒DNA本身的影响,必须在实验中设立单独转染质粒DNA的对照组。
, http://www.100md.com
关于质粒DNA进入细胞引起生物学效应的机制,文献报道甚少。Hagstrom等[5]在家兔骨骼肌肌浆网(SR)上发现DNA结合蛋白,但其功能尚不清楚。最近又有研究发现大鼠骨骼肌SR也存在DNA结合蛋白,对不同的DNA无选择性[6],并在以后的研究中发现质粒DNA与SR结合后,能使SR摄取和释放Ca2+增加,推测可能是质粒DNA携带的负电荷使SR膜环境发生改变,促进SR对Ca2+的摄取所致[7],并认为质粒DNA还可能与胞浆内的DNA结合蛋白结合，激活胞浆内的某些DNA结合蛋白,如STATs家族,从而使后者发生核转位,进入核内作为转录调控因子发挥作用[8]。质粒转染使β2-AR的表达量上调是否通过以上类似的机制影响β2-AR转录后的调节或激活胞浆内的某些DNA结合蛋白实现的,尚不清楚,其机制有待进一步研究。
*国家自然科学基金(39670274)资助课题。
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参考文献
1 Engel G,Hoyer D. [125I]BE2254, a new high affinity radioligand for alpha1-adrenoceptors.Eur J Pharmacol,1981,73(2-3):221-224
2 Esbenshade TA,Han C,Theroux TL, et al. Coexisting β1-AR and atypical β-adrenergic receptors cause redundant increases in cyclic AMP in human neurolastoma cells.Mol Pharmacol,1992,42(5):753-759
3 赵 文,汤 健,贾弘
.直接肌注射质粒DNA对肌组织cAMP、cGMP含量的影响.基础医学与临床,1998,18(6)24-26, 百拇医药
4 Maggio R, Vogel Z, Wess J, et al. Coexpression studies with mutant muscurincic/adrenergic receptors provide evidence for intermolecular cross-talk between G-protein-linked receptors.Proc Natl Acad Sci USA ,1993,90:3103-3109
5 Hagastrom JE, Rybakova IN, Wollf JA, et al. Nonnucleaer DNA binding proteins in striated muscle. Biochem Mol Med,1996,58:113-1216
6 赵 文,汤 健,贾弘
.序列非依赖性的骨骼肌膜DNA结合蛋白.北京医科大学学报,1999,31(1):5-87 赵 文,李载权,姜志胜,等.质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响. 北京医科大学学报,1999,31(4):297-299
8 Darnell JE JR.STATs and gene regulation. Science,1997,277:1630-1635
(1999-09-17收稿), 百拇医药