一氧化氮及一氧化碳对碱性成纤维细胞生长因子促血管平滑肌细胞增殖作用的影响*
作者：姜志胜 符民桂 赵文 庞永正 刘乃奎 唐朝枢
单位：姜志胜 符民桂 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034；赵文 刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所
关键词：一氧化氮；药理学；一氧化碳；药理学；成纤维细胞生长因子；碱性；药理学；肌；平滑；血管；药物作用
北京医科大学学报990612 摘 要 目的:研究一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)促平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖作用的影响及其机制。方法:以3H-TdR参入法测定平滑肌细胞增殖程度,放射活性法测定VSMC内蛋白磷酸化程度、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活性。结果:孵育24 h后,bFGF刺激的VSMC增殖较对照组增加1.1倍(P<0.01),细胞内蛋白磷酸化程度增加38.2%(P<0.01),PKC及MAPK活性分别增加1.5和2.5倍(P<0.01);CO前体heme-L-lysinate(H-L-Lys)及NO前体L-Arginine(L-Arg)对静止期VSMC生长无显著影响,亦未引起细胞内蛋白磷酸化、PKC及MAPK活性发生显著改变; 5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC增殖分别减少43.4%、46.6%和47.6%(均P<0.01),细胞内PKC活性分别下降25.6%、31.8%和33.9%(均P<0.01),MAPK活性分别降低15.0%、25.5%和40.1%(均P<0.01); 5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC增殖分别降低30.2%、40.5%和51.9%(均P<0.01),细胞内PKC活性分别降低29.8%、28.9%和36.6%(均P<0.01),MAPK活性分别降低19.4%、32.4%和44.4%(均P<0.01);10 μmol.L-1 H-L-Lys和10 mmol.L-1 L-Arg引起bFGF促进的VSMC内蛋白磷酸化程度分别下降31.8%和37.4%(均P<0.01)。结论:NO和CO可抑制bFGF刺激的大鼠VSMC增殖,其机制与它们抑制bFGF促进的细胞内蛋白磷酸化及PKC和MAPK活性有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R543.5
Effect of nitric monoxide and carbon monoxide on
bFGF-stimulated proliferation of vascular smooth muscle cells
JIANG Zhi-Sheng#, FU Min-Gui, ZHAO Wen， PANG Yong-Zheng， LIU Nai-Kui， TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Disease, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
, 百拇医药 MeSH Nitric oxide/pharmacol Carbon monoxide/pharmacol Fibroblast growth factor, basic/pharmacol Muscle, smooth, vascular/drug eff
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of nitric oxide(NO) and carbon monoxide(CO) on proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMC) stimulated by basic fibroblast growth factor(bFGF) and their mechanism. Methods: VSMC proliferation was measured by 3H-TdR incorporation. Protein phosphorylation， PKC and MAPK activity in VSMC were determined by radioactivity assay. Results: Compared with control, VSMC amplification induced by bFGF was increased by 1.1-fold after 24 h incubation (P<0.01). Protein phophorylation，PKC and MAPK activities in VSMC were augmented by 38.2%，1.5 and 2.5 times, respectively (P<0.01); H-L-Lys and L-Arg had no significant influence on both growth and intracellular protein phosphorylation， PKC and MAPK activities in quiescent VSMC. 5，10 and 20μmol.L-1 H-L-Lys decreased bFGF-stimulated VSMC proliferation by 43.4%，46.6% and 47.6%,respectively (P<0.01). Intracellular PKC activities were lowered by 25.6%, 31.8% and 33.9%, respectively (P<0.01), and MAPK activities were reduced by 15.0%, 25.5% and 40.1%, respectively (P<0.01); 5, 10 and 20mmol.L-1 L-Arg decreased bFGF-stimulated VSMC proliferation by 30.2%, 40.5% and 51.9%, respectively (P<0.01). Intracellular PKC activities were lowered by 29.8%, 28.9% and 36.6%，respectively (P<0.01), and MAPK activities were reduced by 19.4%, 32.4% and 44.4%, respectively (P<0.01). bFGF-induced protein phosphorylation in VSMC was inhibited by 10μmol.L-1 H-L-Lys and 10mmol.L-1 L-Arg by 31.8% and 37.4%, respectively (P<0.01). Conclusion: NO and CO may have an inhibitive role against VSMC proliferation caused by bFGF, whose mechanism has a close relationship with inhibition of intracellular protein phosphorylation, PKC and MAPK activities stimulated by bFGF.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:524-527)
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖是动脉粥样硬化、再狭窄及高血压等疾病发病过程中的重要病理变化。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是VSMC的强丝裂素原。近来发现，bFGF还可诱导血管壁细胞一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化碳(carbon monoxide, CO)的产生[1～3]。NO及CO均可抑制VSMC的增殖[4，5]，提示这两种小分子在VSMC增殖方面与bFGF可能具有相互调节作用。本文利用体外培养的大鼠主动脉VSMC，观察NO前体L-Arginine(L-Arg)及CO前体heme-L-lysinate(H-L-Lys)对bFGF刺激的SMC增殖的调节作用及其机制。
1 材料与方法
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1.1 细胞培养及实验分组
取Wistar大鼠(100～150g)胸主动脉，按贴块法[6]在细胞培养箱中以含20%(体积分数)小牛血清的MEM培养。实验用第4～5代细胞。按每ml 2×105 cells的密度接种于培养板，培养24h后换为低血清(体积分数1%)培养24h。按下述实验分组加入不同试剂：(1) 对照组,不加特殊试剂；(2)bFGF组,培养液中加入10μg.L-1 bFGF。(3)～(5)组，培养液中加入CO前体H-L-Lys 终浓度分别为5、10、20μmol.L-1及bFGF 10μg.L-1。(6)～(8)组，培养液中加入NO前体L-Arg 终浓度分别为5、10、20mmol.L-1及bFGF 10μg.L-1。(9) H-L-Lys组，培养液中仅加入H-L-Lys (终浓度10μmol.L-1)。(10) L-Arg组，培养液中仅加入L-Arg(终浓度10 mmol.L-1) 。
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1.2 3H-胸腺嘧啶(3H -TdR)参入测定
上述各组细胞培养14 h后向各培养孔中加入3H-TdR每孔1.85×104Bq，再孵育10h，以冷PBS终止反应，在millipore上经微孔滤膜(0.45μm)收集并洗净细胞，滤膜干燥后加入闪烁液，以β-液闪仪测定3H放射活性。
1.3 平滑肌细胞蛋白磷酸化测定
向培养的细胞中分别加入32P正磷酸盐(每孔37 kBq),37℃振荡孵育2 h，以4℃ PBS洗3次后，加入细胞溶解液[mmol.L-1:Tris/HCl 25.0,pH7.4,Na4P2O7 10.0,Na2VO3 1.0,NaF 50,并加入20g.L-1SDS,1%(体积分数)甘油,Leupeptin 10mg.L-1]，超声破碎细胞，6500×g离心5min，取上清以Lowry's法测定蛋白含量，然后加入样本缓冲液，作SDS-PAGE电泳(体积分数5%隔层胶，体积分数10%分离胶，恒压90V)。电泳结束，胶板经固定、染色、脱色、干胶，于暗室放置X光胶片，-80℃放射自显影72h,然后进行图像扫描分析。
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1.4 丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性测定
参照本室报告的方法[7]测定VSMC内MAPK活性。实验各组细胞孵育2h后，用冷PBS洗涤3次，加入细胞溶解液，冰上孵育30min，并超声破碎细胞(5s)。离心，13000×g,10min。取上清液0.3ml加入0.1ml激酶缓冲液(mmol.L-1: HEPES 20.0,pH7.2, MgCl2 10.0, MnCl2 2.0,DTT2.0,Na2VO3 0.5,EGTA 1.0,BSA 0.1g.L-1,蛋白激酶A抑制剂2.0；ATP-Na2 50 μmol.L-1；[γ-32P]ATP 37kBq；髓磷脂碱性蛋白1.0g.L-1)于30℃反应15min。冰浴终止反应。取100μl反应液点于p81 phosphocellulose滤纸(Whatman)上，凉干后以0.5%(体积分数)磷酸液冲洗6次，烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液。在β-液闪仪上测定32P放射活性,同时作空白对照检测，以实验管与空白管的差值表示MAPK活性。
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1.5 平滑肌细胞内蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性测定[8]
实验各组细胞孵育2h后，以PBS洗3次，细胞悬浮于穿细胞液(mmol.L-1: HEPES 12.5,EGTA 12.5,pH 7.4,MgCl2 5.2, KCl 194.0, CaCl2 8.2； PKC底物肽每管0.2 U； streptolysin 每管0.3 U)中(反应终体积150 μl)，37℃孵育10min后，加入[γ-32P]ATP(每管37kBq)启动反应，孵育10min后加入冷终止液(体积分数25%三氯醋酸-2mol.L-1乙酸)100μl终止反应。冰浴10min 后离心(1200×g,15min)。取上清液120μl点于p81滤纸上，晾干后以洗脱液(体积分数30%乙酸-1%磷酸)洗2次，再以无水乙醇洗1次，干燥后加入闪烁液，以β-液闪仪测定32P放射活性。同时作不加PKC底物肽的对照检测，实验管与对照管的差值表示PKC活性。
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1.6 实验材料
bFGF、L-Arg、H-L-Lys、Leupeptin、ATP-Na2、髓磷脂碱性蛋白、PKC底物肽和蛋白酶A抑制剂均购自Sigma公司，余均为市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析
上述各组实验分别进行6次，实验结果以
±s表示。One way ANOVA方差分析，组间q检验，P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 L-Arg 和H-L-Lys抑制bFGF促大鼠SMC增殖的作用
bFGF具有显著的刺激VSMC增殖的作用，孵育24 h后，bFGF组3H-TdR参入量较对照组增加1.1倍(P<0.01)。L-Arg及H-L-Lys对静止期SMC无明显的抑增殖作用，但5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC增殖分别降低43.4%、46.6%和47.6%(均P<0.01)，5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC增殖分别减少30.2%、40.5%和51.9%(均P<0.01)，结果见表1。
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表1 L-Arg和H-L-Lys对bFGF刺激的VSMC增殖及细胞内PKC、MAPK活性的影响(±s, n=6)
Table 1 Effect of L-Arg and H-L-Lys on proliferation of VSMC and PKC、MAPK activity in VSMC stimulated by bFGF(±s, n=6)A/Bq Groups
3H-incorporation
PKC activity△
MAPK activity△
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Control
58±14
528±60
387±27
bFGF
124±16**
1330±147**
1361±35**
L-Arg
47±4
534±118
, http://www.100md.com 391±63
H-L-Lys
51±11
508±64
434±35
H-L-Lys1+bFGF
70±9##
989±93##
1157±55##
H-L-Lys2+bFGF
66±4##
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908±152##
1013±34##
H-L-Lys3+bFGF
65±7##
879±128##
815±35##
L-Arg1+bFGF
86±8##
934±68##
1098±113##
, 百拇医药
L-Arg2+bFGF
74±5##
945±140##
921±42##
L-Arg3+bFGF
60±5##
844±52##
757±66##
A,activity; ** P<0.01, compared with control; ## P<0.01, compared with bFGF group; △ 3×105 cells in total.
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2.2 L-Arg和H-L-Lys减轻bFGF促VSMC蛋白磷酸化的作用
bFGF刺激细胞蛋白磷酸化增强，尤以相对分子质量32×103蛋白32P参入显著增加，较对照组高38.2%(P<0.01)；L-Arg(10mmol.L-1)和H-L-Lys(10μmol.L-1)明显抑制bFGF刺激的VSMC蛋白磷酸化程度(P<0.01)，结果见图1。
** P<0.01, compared with control；compared with bFGF group, ##P<0.01.
图1 L-Arg和H-L-Lys对bFGF诱导的VSMC内
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蛋白磷酸化的影响(±s, n=6)
Figure 1 Effect of L-Arg and H-L-Lys on bFGF-stimulated
protein phosphorylation in VSMC (±s, n=6)
2.3 L-Arg和H-L-Lys抑制bFGF激活VSMC内PKC及MAPK活性的作用
bFGF组VSMC内PKC及MAPK活性分别较对照组增加1.5倍和2.5倍(表1,P<0.01)。L-Arg和H-L-Lys对静止期细胞PKC及MAPK活性无明显影响(P>0.05)。5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC内PKC活性分别降低29.8%、28.9%和36.6%(P<0.01)，MAPK活性分别降低19.4%、32.4%和44.4%(P<0.01)；5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC内PKC活性分别降低 25.6%、31.8%和33.9%(P<0.01)，MAPK活性分别降低15.0%、25.5%和40.1%(P<0.01)。
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3 讨论
bFGF是体内广泛分布的一种多功能生长因子，具有强烈的促VSMC增殖效应。但体内bFGF的作用受到神经-体液因素和组织细胞旁/自分泌因子组成的网络体系的调控。有研究发现VSMC存在有一氧化氮合酶(NOS)/NO系统和血红素加氧酶(HO)/CO系统，分别利用底物L-Arg和H-L-Lys经NOS和HO合成NO和CO[9,10]。VSMC产生的NO和CO具有抑制血管收缩、抑制VSMC增殖的作用[4,5]。bFGF还具有激活和诱导NOS与HO，增加NO和CO产生的作用[1～3]。本工作在培养的大鼠VSMC上观察到NOS及HO的底物L-Arg和H-L-Lys显著抑制bFGF的促VSMC增殖效应。
bFGF介导的引起SMC增殖的细胞内信号转导途径已得到广泛的研究，当该因子与细胞上的相应受体结合后，使受体酪氨酸激酶激活，再顺序激活c-Ras、c-Raf、MAPKK;同时，受体酪氨酸激酶的激活，通过PLCγ途径激活PKC。两条途径最终可激活MAPK[11,12]，后者通过核转位引起平滑肌细胞的增殖反应。本工作发现L-Arg和H-L-Lys抑制bFGF刺激的细胞蛋白磷酸化，降低bFGF诱导的细胞PKC和MAPK活性，推测NO和CO对bFGF刺激的VSMC增殖的抑制效应作用于bFGF引起的细胞内信号转导途径上。
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近年发现，L-Arg、H-L-Lys对动脉粥样硬化、高血压和再狭窄等的发生发展具有一定的拮抗效应，机制尚未完全阐明。通过内源性L-Arg/NOS/NO和H-L-Lys/HO/CO途径，干扰bFGF引起的蛋白磷酸化及细胞内信号转导，进而拮抗该因子的促VSMC的增殖效应，可能是其机制之一。
*国家自然科学基金(39730220)及“九五”国家科技攻关项目(96-906-02-07)资助课题。
参考文献
1 Cuevas P, Carceller F, Orltega S, et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science,1991,254:12108-12120
2 姜志胜，王相智，龚曼丽，等.碱性成纤维细胞生长因子对猴冠状动脉NO生成的影响. 北京医科大学学报，1997，29：565
, 百拇医药
3 Cuevas P, Calvo MG, Carceller F, et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rat. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:11996-12001
4 Morita T, Perrella MA, Lee ME, et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1475-1479
5 Morita T, Mitsialis SA, Koike H, et al. Carbon monoxide controls the proliferation of hypoxoc vascular smooth muscle cells. J Biol Chem, 1997,272:32804-32809
, 百拇医药
6 Hirata Y. CGRP-receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells. Biochem Biophys Res Commu, 1988, 151:1113-1118
7 李田昌，庞永政，唐朝枢.丝裂素蛋白激酶活性测定.基础医学与临床， 1996，16：155-158
8 Fiorani M, Cantoni O, Tasinato A, et al. Hydrogen peroxide and fetal bovine serum-induced DNA synthesis in vascular smooth muscle cells: positive and negative regulation by protein kinase C isoforms. Biochem Biophys Acta,1995, 1269:98-104
, http://www.100md.com
9 Nanaokawa Y, Nobuhiro I, Shoji T. Cloning of inducible nitric oxide synthase in rat vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commu, 1993,191:89-94
10 Morita T, Perrella MA,Lee ME, et al. Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors is regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide. J Clin Invest, 1995, 96:2672-2682
11 Frodin M, Peraldi P, Obberghen EV. Cyclic AMP activites the mitogen-activated protein kinase cascade in PC12 cells. J Biol Chem, 1994, 269: 6207-6214
12 Pelech SL, Charest DL, Mordret GP, et al. Networking with mitogen-activated protein kinase. Mol Cellular Biochem, 1993, 127-128: 157-169
(1998-11-11收稿), http://www.100md.com
单位：姜志胜 符民桂 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京 100034；赵文 刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所
关键词：一氧化氮；药理学；一氧化碳；药理学；成纤维细胞生长因子；碱性；药理学；肌；平滑；血管；药物作用
北京医科大学学报990612 摘 要 目的:研究一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)促平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖作用的影响及其机制。方法:以3H-TdR参入法测定平滑肌细胞增殖程度,放射活性法测定VSMC内蛋白磷酸化程度、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活性。结果:孵育24 h后,bFGF刺激的VSMC增殖较对照组增加1.1倍(P<0.01),细胞内蛋白磷酸化程度增加38.2%(P<0.01),PKC及MAPK活性分别增加1.5和2.5倍(P<0.01);CO前体heme-L-lysinate(H-L-Lys)及NO前体L-Arginine(L-Arg)对静止期VSMC生长无显著影响,亦未引起细胞内蛋白磷酸化、PKC及MAPK活性发生显著改变; 5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC增殖分别减少43.4%、46.6%和47.6%(均P<0.01),细胞内PKC活性分别下降25.6%、31.8%和33.9%(均P<0.01),MAPK活性分别降低15.0%、25.5%和40.1%(均P<0.01); 5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC增殖分别降低30.2%、40.5%和51.9%(均P<0.01),细胞内PKC活性分别降低29.8%、28.9%和36.6%(均P<0.01),MAPK活性分别降低19.4%、32.4%和44.4%(均P<0.01);10 μmol.L-1 H-L-Lys和10 mmol.L-1 L-Arg引起bFGF促进的VSMC内蛋白磷酸化程度分别下降31.8%和37.4%(均P<0.01)。结论:NO和CO可抑制bFGF刺激的大鼠VSMC增殖,其机制与它们抑制bFGF促进的细胞内蛋白磷酸化及PKC和MAPK活性有关。
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中国图书资料分类法分类号 R543.5
Effect of nitric monoxide and carbon monoxide on
bFGF-stimulated proliferation of vascular smooth muscle cells
JIANG Zhi-Sheng#, FU Min-Gui, ZHAO Wen， PANG Yong-Zheng， LIU Nai-Kui， TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Disease, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
, 百拇医药 MeSH Nitric oxide/pharmacol Carbon monoxide/pharmacol Fibroblast growth factor, basic/pharmacol Muscle, smooth, vascular/drug eff
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of nitric oxide(NO) and carbon monoxide(CO) on proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMC) stimulated by basic fibroblast growth factor(bFGF) and their mechanism. Methods: VSMC proliferation was measured by 3H-TdR incorporation. Protein phosphorylation， PKC and MAPK activity in VSMC were determined by radioactivity assay. Results: Compared with control, VSMC amplification induced by bFGF was increased by 1.1-fold after 24 h incubation (P<0.01). Protein phophorylation，PKC and MAPK activities in VSMC were augmented by 38.2%，1.5 and 2.5 times, respectively (P<0.01); H-L-Lys and L-Arg had no significant influence on both growth and intracellular protein phosphorylation， PKC and MAPK activities in quiescent VSMC. 5，10 and 20μmol.L-1 H-L-Lys decreased bFGF-stimulated VSMC proliferation by 43.4%，46.6% and 47.6%,respectively (P<0.01). Intracellular PKC activities were lowered by 25.6%, 31.8% and 33.9%, respectively (P<0.01), and MAPK activities were reduced by 15.0%, 25.5% and 40.1%, respectively (P<0.01); 5, 10 and 20mmol.L-1 L-Arg decreased bFGF-stimulated VSMC proliferation by 30.2%, 40.5% and 51.9%, respectively (P<0.01). Intracellular PKC activities were lowered by 29.8%, 28.9% and 36.6%，respectively (P<0.01), and MAPK activities were reduced by 19.4%, 32.4% and 44.4%, respectively (P<0.01). bFGF-induced protein phosphorylation in VSMC was inhibited by 10μmol.L-1 H-L-Lys and 10mmol.L-1 L-Arg by 31.8% and 37.4%, respectively (P<0.01). Conclusion: NO and CO may have an inhibitive role against VSMC proliferation caused by bFGF, whose mechanism has a close relationship with inhibition of intracellular protein phosphorylation, PKC and MAPK activities stimulated by bFGF.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:524-527)
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖是动脉粥样硬化、再狭窄及高血压等疾病发病过程中的重要病理变化。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是VSMC的强丝裂素原。近来发现，bFGF还可诱导血管壁细胞一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化碳(carbon monoxide, CO)的产生[1～3]。NO及CO均可抑制VSMC的增殖[4，5]，提示这两种小分子在VSMC增殖方面与bFGF可能具有相互调节作用。本文利用体外培养的大鼠主动脉VSMC，观察NO前体L-Arginine(L-Arg)及CO前体heme-L-lysinate(H-L-Lys)对bFGF刺激的SMC增殖的调节作用及其机制。
1 材料与方法
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1.1 细胞培养及实验分组
取Wistar大鼠(100～150g)胸主动脉，按贴块法[6]在细胞培养箱中以含20%(体积分数)小牛血清的MEM培养。实验用第4～5代细胞。按每ml 2×105 cells的密度接种于培养板，培养24h后换为低血清(体积分数1%)培养24h。按下述实验分组加入不同试剂：(1) 对照组,不加特殊试剂；(2)bFGF组,培养液中加入10μg.L-1 bFGF。(3)～(5)组，培养液中加入CO前体H-L-Lys 终浓度分别为5、10、20μmol.L-1及bFGF 10μg.L-1。(6)～(8)组，培养液中加入NO前体L-Arg 终浓度分别为5、10、20mmol.L-1及bFGF 10μg.L-1。(9) H-L-Lys组，培养液中仅加入H-L-Lys (终浓度10μmol.L-1)。(10) L-Arg组，培养液中仅加入L-Arg(终浓度10 mmol.L-1) 。
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1.2 3H-胸腺嘧啶(3H -TdR)参入测定
上述各组细胞培养14 h后向各培养孔中加入3H-TdR每孔1.85×104Bq，再孵育10h，以冷PBS终止反应，在millipore上经微孔滤膜(0.45μm)收集并洗净细胞，滤膜干燥后加入闪烁液，以β-液闪仪测定3H放射活性。
1.3 平滑肌细胞蛋白磷酸化测定
向培养的细胞中分别加入32P正磷酸盐(每孔37 kBq),37℃振荡孵育2 h，以4℃ PBS洗3次后，加入细胞溶解液[mmol.L-1:Tris/HCl 25.0,pH7.4,Na4P2O7 10.0,Na2VO3 1.0,NaF 50,并加入20g.L-1SDS,1%(体积分数)甘油,Leupeptin 10mg.L-1]，超声破碎细胞，6500×g离心5min，取上清以Lowry's法测定蛋白含量，然后加入样本缓冲液，作SDS-PAGE电泳(体积分数5%隔层胶，体积分数10%分离胶，恒压90V)。电泳结束，胶板经固定、染色、脱色、干胶，于暗室放置X光胶片，-80℃放射自显影72h,然后进行图像扫描分析。
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1.4 丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性测定
参照本室报告的方法[7]测定VSMC内MAPK活性。实验各组细胞孵育2h后，用冷PBS洗涤3次，加入细胞溶解液，冰上孵育30min，并超声破碎细胞(5s)。离心，13000×g,10min。取上清液0.3ml加入0.1ml激酶缓冲液(mmol.L-1: HEPES 20.0,pH7.2, MgCl2 10.0, MnCl2 2.0,DTT2.0,Na2VO3 0.5,EGTA 1.0,BSA 0.1g.L-1,蛋白激酶A抑制剂2.0；ATP-Na2 50 μmol.L-1；[γ-32P]ATP 37kBq；髓磷脂碱性蛋白1.0g.L-1)于30℃反应15min。冰浴终止反应。取100μl反应液点于p81 phosphocellulose滤纸(Whatman)上，凉干后以0.5%(体积分数)磷酸液冲洗6次，烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液。在β-液闪仪上测定32P放射活性,同时作空白对照检测，以实验管与空白管的差值表示MAPK活性。
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1.5 平滑肌细胞内蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性测定[8]
实验各组细胞孵育2h后，以PBS洗3次，细胞悬浮于穿细胞液(mmol.L-1: HEPES 12.5,EGTA 12.5,pH 7.4,MgCl2 5.2, KCl 194.0, CaCl2 8.2； PKC底物肽每管0.2 U； streptolysin 每管0.3 U)中(反应终体积150 μl)，37℃孵育10min后，加入[γ-32P]ATP(每管37kBq)启动反应，孵育10min后加入冷终止液(体积分数25%三氯醋酸-2mol.L-1乙酸)100μl终止反应。冰浴10min 后离心(1200×g,15min)。取上清液120μl点于p81滤纸上，晾干后以洗脱液(体积分数30%乙酸-1%磷酸)洗2次，再以无水乙醇洗1次，干燥后加入闪烁液，以β-液闪仪测定32P放射活性。同时作不加PKC底物肽的对照检测，实验管与对照管的差值表示PKC活性。
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1.6 实验材料
bFGF、L-Arg、H-L-Lys、Leupeptin、ATP-Na2、髓磷脂碱性蛋白、PKC底物肽和蛋白酶A抑制剂均购自Sigma公司，余均为市售分析纯试剂。
1.7 统计学分析
上述各组实验分别进行6次，实验结果以
±s表示。One way ANOVA方差分析，组间q检验，P<0.05为差异具有显著性。2 结果
2.1 L-Arg 和H-L-Lys抑制bFGF促大鼠SMC增殖的作用
bFGF具有显著的刺激VSMC增殖的作用，孵育24 h后，bFGF组3H-TdR参入量较对照组增加1.1倍(P<0.01)。L-Arg及H-L-Lys对静止期SMC无明显的抑增殖作用，但5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC增殖分别降低43.4%、46.6%和47.6%(均P<0.01)，5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC增殖分别减少30.2%、40.5%和51.9%(均P<0.01)，结果见表1。
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表1 L-Arg和H-L-Lys对bFGF刺激的VSMC增殖及细胞内PKC、MAPK活性的影响(
±s, n=6)Table 1 Effect of L-Arg and H-L-Lys on proliferation of VSMC and PKC、MAPK activity in VSMC stimulated by bFGF(
±s, n=6)A/Bq Groups3H-incorporation
PKC activity△
MAPK activity△
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Control
58±14
528±60
387±27
bFGF
124±16**
1330±147**
1361±35**
L-Arg
47±4
534±118
, http://www.100md.com 391±63
H-L-Lys
51±11
508±64
434±35
H-L-Lys1+bFGF
70±9##
989±93##
1157±55##
H-L-Lys2+bFGF
66±4##
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908±152##
1013±34##
H-L-Lys3+bFGF
65±7##
879±128##
815±35##
L-Arg1+bFGF
86±8##
934±68##
1098±113##
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L-Arg2+bFGF
74±5##
945±140##
921±42##
L-Arg3+bFGF
60±5##
844±52##
757±66##
A,activity; ** P<0.01, compared with control; ## P<0.01, compared with bFGF group; △ 3×105 cells in total.
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2.2 L-Arg和H-L-Lys减轻bFGF促VSMC蛋白磷酸化的作用
bFGF刺激细胞蛋白磷酸化增强，尤以相对分子质量32×103蛋白32P参入显著增加，较对照组高38.2%(P<0.01)；L-Arg(10mmol.L-1)和H-L-Lys(10μmol.L-1)明显抑制bFGF刺激的VSMC蛋白磷酸化程度(P<0.01)，结果见图1。
** P<0.01, compared with control；compared with bFGF group, ##P<0.01.
图1 L-Arg和H-L-Lys对bFGF诱导的VSMC内
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蛋白磷酸化的影响(
±s, n=6)Figure 1 Effect of L-Arg and H-L-Lys on bFGF-stimulated
protein phosphorylation in VSMC (
±s, n=6)2.3 L-Arg和H-L-Lys抑制bFGF激活VSMC内PKC及MAPK活性的作用
bFGF组VSMC内PKC及MAPK活性分别较对照组增加1.5倍和2.5倍(表1,P<0.01)。L-Arg和H-L-Lys对静止期细胞PKC及MAPK活性无明显影响(P>0.05)。5、10、20mmol.L-1 L-Arg使bFGF刺激的VSMC内PKC活性分别降低29.8%、28.9%和36.6%(P<0.01)，MAPK活性分别降低19.4%、32.4%和44.4%(P<0.01)；5、10、20μmol.L-1 H-L-Lys使bFGF刺激的VSMC内PKC活性分别降低 25.6%、31.8%和33.9%(P<0.01)，MAPK活性分别降低15.0%、25.5%和40.1%(P<0.01)。
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3 讨论
bFGF是体内广泛分布的一种多功能生长因子，具有强烈的促VSMC增殖效应。但体内bFGF的作用受到神经-体液因素和组织细胞旁/自分泌因子组成的网络体系的调控。有研究发现VSMC存在有一氧化氮合酶(NOS)/NO系统和血红素加氧酶(HO)/CO系统，分别利用底物L-Arg和H-L-Lys经NOS和HO合成NO和CO[9,10]。VSMC产生的NO和CO具有抑制血管收缩、抑制VSMC增殖的作用[4,5]。bFGF还具有激活和诱导NOS与HO，增加NO和CO产生的作用[1～3]。本工作在培养的大鼠VSMC上观察到NOS及HO的底物L-Arg和H-L-Lys显著抑制bFGF的促VSMC增殖效应。
bFGF介导的引起SMC增殖的细胞内信号转导途径已得到广泛的研究，当该因子与细胞上的相应受体结合后，使受体酪氨酸激酶激活，再顺序激活c-Ras、c-Raf、MAPKK;同时，受体酪氨酸激酶的激活，通过PLCγ途径激活PKC。两条途径最终可激活MAPK[11,12]，后者通过核转位引起平滑肌细胞的增殖反应。本工作发现L-Arg和H-L-Lys抑制bFGF刺激的细胞蛋白磷酸化，降低bFGF诱导的细胞PKC和MAPK活性，推测NO和CO对bFGF刺激的VSMC增殖的抑制效应作用于bFGF引起的细胞内信号转导途径上。
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近年发现，L-Arg、H-L-Lys对动脉粥样硬化、高血压和再狭窄等的发生发展具有一定的拮抗效应，机制尚未完全阐明。通过内源性L-Arg/NOS/NO和H-L-Lys/HO/CO途径，干扰bFGF引起的蛋白磷酸化及细胞内信号转导，进而拮抗该因子的促VSMC的增殖效应，可能是其机制之一。
*国家自然科学基金(39730220)及“九五”国家科技攻关项目(96-906-02-07)资助课题。
参考文献
1 Cuevas P, Carceller F, Orltega S, et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science,1991,254:12108-12120
2 姜志胜，王相智，龚曼丽，等.碱性成纤维细胞生长因子对猴冠状动脉NO生成的影响. 北京医科大学学报，1997，29：565
, 百拇医药
3 Cuevas P, Calvo MG, Carceller F, et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rat. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:11996-12001
4 Morita T, Perrella MA, Lee ME, et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1475-1479
5 Morita T, Mitsialis SA, Koike H, et al. Carbon monoxide controls the proliferation of hypoxoc vascular smooth muscle cells. J Biol Chem, 1997,272:32804-32809
, 百拇医药
6 Hirata Y. CGRP-receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells. Biochem Biophys Res Commu, 1988, 151:1113-1118
7 李田昌，庞永政，唐朝枢.丝裂素蛋白激酶活性测定.基础医学与临床， 1996，16：155-158
8 Fiorani M, Cantoni O, Tasinato A, et al. Hydrogen peroxide and fetal bovine serum-induced DNA synthesis in vascular smooth muscle cells: positive and negative regulation by protein kinase C isoforms. Biochem Biophys Acta,1995, 1269:98-104
, http://www.100md.com
9 Nanaokawa Y, Nobuhiro I, Shoji T. Cloning of inducible nitric oxide synthase in rat vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commu, 1993,191:89-94
10 Morita T, Perrella MA,Lee ME, et al. Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors is regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide. J Clin Invest, 1995, 96:2672-2682
11 Frodin M, Peraldi P, Obberghen EV. Cyclic AMP activites the mitogen-activated protein kinase cascade in PC12 cells. J Biol Chem, 1994, 269: 6207-6214
12 Pelech SL, Charest DL, Mordret GP, et al. Networking with mitogen-activated protein kinase. Mol Cellular Biochem, 1993, 127-128: 157-169
(1998-11-11收稿), http://www.100md.com