大鼠血管功能性α1肾上腺素受体的亚型分析*
作者：韩江莉 吕志珍 陈明哲 韩启德
单位：北京医科大学第三医院血管医学研究所，北京 100083
关键词：血管；受体；亚型☆；受体；肾上腺素能α1；分析
北京医科大学学报990610 摘 要 目的：研究大鼠不同血管中α1肾上腺素受体(α1-adrenoceptor, α1-AR)亚型的分布情况及其功能意义。方法：采用离体血管收缩功能实验，测定α1-AR选择性拮抗剂抑制大鼠血管NE收缩反应的功能性亲和常数(pA2)，与分别表达α1A-、α1B-和α1D-AR的克隆细胞上结合常数(pKi)作相关性分析，以判断血管中的α1-AR亚型分布。结果：哌唑嗪、WB4101、5-MU、BMY7378和RS17053分别竞争性地抑制血管对NE的收缩效应，pA2值与这些拮抗剂对克隆α1A-、α1B-、α1D-AR 的pKi值间的决定系数在肺动脉分别为0.05、0.45、0.77；在肠系膜动脉分别为0.02、0.47、0.87;在尾动脉分别为0.77、0.77、0.44；在门静脉分别为0.79、0.81、0.27。结论：大鼠肺动脉、肠系膜动脉的功能性α1-AR主要为α1D-AR；而尾动脉与门静脉的功能性α1-AR主要是α1A和α1B亚型。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R322.12-332
Functional distribution of α1-adrenoceptor subtypes in rat vessels
HAN Jiang-Li， LU Zhi-Zhen， CHEN Ming-Zhe， HAN Qi-De
(Institute of Vascular Medicine, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Blood vessels Receptor, subtype☆ Receptors, adrenergic, alpha 1/anal
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: The distribution of three α1-adrenoceptor(α1-AR) subtypes and their functional roles in rat different vessels was investigated. Methods: The effects of α1-AR subtype selective antagonists on norepinephrine (NE)-induced contraction were observed by in vitro contractile studies. And correlation analysis between pA2 value of α1-AR selective antagonists in functional experiments and binding pKi value in cloned α1-AR subtypes expressed in HEK293 cells was used to characterize the distribution of α1-AR subtype in rat vessels. Results: Cumulative concentration-contractile response curves (CRC) for NE were competitively antagonized in rat pulmonary artery, mesenteric artery , caudal artery and portal vein by prazosin, WB4101, 5-MU, RS17053 and BMY7378. CEC shifted the NE-CRC to the right and reduced the maximal contraction response in these vessels. The coefficients of determination with α1A-, α1B- and α1D-AR in pulmonary artery were 0.05,0.45 and 0.77; in mesenteric artery 0.02, 0.47 and 0.87; in caudal artery and portal vein 0.77,0.77,0.44 and 0.79, 0.81,0.27 respectively. Conclusion: The functional α1-AR in rat pulmonary artery and mesenteric artery is mainly α1D-AR, and in rat caudal artery and portal vein mainly α1A- and α1B-AR.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:516-519)
α1肾上腺素受体(α1-adrenoceptor, α1-AR)可分为α1A、α1B和α1D 3种亚型，通过分子生物学的方法已经克隆出这3种亚型相应的cDNA[1，2]。目前关于这3种亚型在血管中的分布尚有争议。本实验室曾基于两种亚型的分型方法，观察到大鼠不同血管中α1-AR亚型在分布、调节及信号转导等方面均存在差异；基于3种亚型的分型方法，我们的研究显示，大鼠主动脉和肾动脉的功能性α1-AR分别属于α1D和α1A亚型[3]。本文采用特异性的工具药进行离体血管收缩功能实验并结合相关分析方法，按照α1-AR 3种亚型的新的分类方法进一步研究大鼠肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉中功能性α1-AR的分布情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
3月龄雄性Wistar大鼠，体重(200±10) g，由北京医科大学实验动物中心提供。去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、哌唑嗪(prazosin, Praz)、普萘洛尔(propranolol, Prop)、育亨宾(yohimbine, Yoh)、去甲丙咪嗪(desmethylimipramine, DMI )、间甲肾上腺素(normetanephrine, NMN)购自Sigma公司，BMY7378、WB4101、5-methyl-urapidil(5-MU)、氯乙基可乐定(chlorethylclonidine, CEC)购自Research Biochemicals 公司，RS17053为Roche Bioscience(USA)惠赠，BE2254购自Beiersddorf公司，Na125I购自中国原子能研究所，人胚胎肾细胞(HEK293细胞)及含仓鼠α1b、牛α1a和大鼠α1dcDNA的质粒由Kenneth P.Minneman教授馈赠。
, http://www.100md.com
1.2 离体血管收缩功能试验
以颈椎脱位法处死大鼠后取出所需血管，在95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2饱和的Krebs液中去除血管周围的结缔组织，制成3mm长的环形血管标本，去内皮后悬挂于10ml浴槽内，以乙酰胆碱的舒张血管作用消失作为内皮破坏成功的标志，以Han等[4]报道的方法，在37℃及通以95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2气体的Krebs液中灌流标本。标本负荷张力分别为：肺动脉1.0g，肠系膜动脉、尾动脉、门静脉各0.5g。在灌流液中加入10-7mol.L-1Yoh及10-6 mol.L-1Prop分别阻断α2和β-AR(在此基础上NE仅激动α1-AR)，另加入10-7mol.L-1DMI和10-6mol.L-1NMN以阻断神经末梢与其它组织对NE的摄取。用NE10-5mol.L-1预激标本2次，总平衡时间约为2h。平衡后，制备NE的累积浓度-收缩效应曲线(CRC)，作为对照。
, http://www.100md.com
1.3 竞争性α1-AR拮抗剂对NE介导的血管收缩的影响
标本分别在每种拮抗剂的3个浓度(最大与最小浓度之间的差别为10倍)存在下重复制备NE的CRC，与对照情况下的CRC比较，采用Schild作图法求出Praz、WB4101、5-MU、BMY7378和RS17053拮抗NE介导收缩血管的半效抑制浓度(以其负对数值pA2表示)。各种浓度的拮抗剂均预先加入灌流的Krebs液中预温育30～40min。预试验中已证明本实验条件下连续4次NE的CRC无显著差别。
1.4 CEC对NE介导的血管收缩的影响
实验条件同上，同一标本先作对照曲线，计算EC50值，以其负对数值pD2值表示。然后将标本用50 μmol.L-1CEC温育30 min，洗出40min后重复NE的CRC。
, 百拇医药
1.5 放射配体结合实验
采用氯胺T法将125I标记到非选择性α1-AR 拮抗剂BE2254上。收集分别表达α1-AR 3种亚型的克隆的HEK293细胞，按本室方法[5]制备细胞粗制膜, 通过竞争抑制实验和Hill作图求得α1-AR及其亚型的选择性拮抗剂Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053的IC50值，根据Cheng和Prusoff公式进一步算出pKi值。
1.6 统计学分析
数据均以
±s表示，显著性检验采用t检验，以P<0.05为差异有显著性的标准。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 α1-AR亚型选择性拮抗剂抑制NE所致血管收缩的pA2值
在肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053均竞争性地抑制NE引起的血管收缩。经Schild作图得出每种拮抗剂的pA2值和斜率(表1)。
表1 α1-AR选择性拮抗剂抑制NE收缩血管的pA2值和斜率
Table 1 pA2 values and slopes of α1-AR selective antagonist on inhibiting vascular contractions induced by NE Antagonist
, http://www.100md.com
pA2/slope
Pulmonary artery
Mesenteric artery
Caudal artery
Portal vein
Prazosin
10.30±0.16/1.02±0.07
10.26±0.14/0.98±0.04
10.01±0.05/0.84±0.10△
9.93±0.17/0.75±0.07*
, 百拇医药
WB4101
9.49±0.18/0.87±0.07
9.27±0.08/0.97±0.04△
9.19±0.07/0.73±0.03△*
9.14±0.09/0.72±0.04*
5-MU
7.99±0.14/1.12±0.04
7.72±0.07/1.24±0.10△
8.28±0.10/0.78±0.08*
, 百拇医药
7.89±0.05/0.81±0.13△
BMY7378
8.92±0.16/0.81±0.04
9.11±0.05/0.73±0.06*
7.23±0.14/1.01±0.14
7.03±0.09/0.84±0.07△△
RS17053
7.09±0.14/1.30±0.11
7.28±0.03/1.24±0.15△
, 百拇医药
8.12±0.04/1.10±0.09△
8.15±0.11/1.13±0.07
*P<0.05 compared with 1.0； n=4 (△n=5， △△n=6).
2.2 α1-AR亚型选择性拮抗剂与克隆的α1A-、α1B-和α1D-AR的pKi值
α1-AR及其亚型的选择性拮抗剂Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053均以浓度依赖性竞争抑制125I-BE2254与表达在HEK293细胞的α1-AR亚型结合。竞争性抑制曲线经Hill作图得pKi和Hill系数见表2。
, http://www.100md.com
表2 α1-AR选择性拮抗剂对克隆α1A-、α1B-和α1D-AR细胞的亲和性(pKi)及Hill系数(nH)
Table 2 The affinities (pKi) and Hill coefficients (nH) in cloned α1A-、α1B-和α1D-AR cells by α1-AR selective antagonist Antagonist
α1A
α1B
α1D
, 百拇医药
pKi
nH
pKi
nH
pKi
nH
Prazosin
9.34±0.10
0.67±0.04
9.16±0.08
0.92±0.02
, 百拇医药
9.69±0.16
0.78±0.01*
WB4101
9.28±0.13
0.75±0.05*
7.29±0.17
0.85±0.10△
8.42±0.08
0.55±0.10*
5-MU
8.24±0.11
, 百拇医药
0.85±0.10△
6.40±0.13
0.75±0.12△
6.76±0.14
0.85±0.15
BMY7378
6.11±0.10
1.10±0.10
6.40±0.16
1.10±0.10
8.29±0.16
, 百拇医药
0.85±0.10
RS17053
8.59±0.08
0.93±0.08
7.06±0.09
0.86±0.05
7.40±0.11
0.93±0.10
* P<0.05 compared with 1.0； n=4(△n=5).
2.3 α1-AR选择性拮抗剂pA2值与Ki值的相关性分析(图1)
, 百拇医药
结果显示肺动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR 的决定系数(r2)分别为0.05、0.45、0.77，肠系膜动脉的r2分别为0.02、0.47、0.87，尾动脉r2分别为0.77、0.77、0.44，门静脉r2分别为0.79、0.81、0.27。
A, pulmonary artery; B,mesenteric artery; C,caudal artery; D,portal vein.
, 百拇医药
图1 4种血管上的pA2值与克隆细胞上的pKi值的相关分析
Figure 1 Correlation analysis between pA2 in rat vessels and pKi in cloned cells
2.4 CEC对NE收缩血管作用的影响
经50 μmol.L-1CEC预温育30min后，最大收缩效应除尾动脉外均有显著下降，而除门静脉NE-CRC外均有显著右移(表3)。
表3 CEC预温育对NE介导大鼠离体血管收缩功能的影响
Table 3 Effects of chlorethylclonidine on vascular contractions induced by NE in rat Vessels
, 百拇医药
n
pD2
F(maximal contraction)/mN
Control
Treatment
Control
Treatment
Pulmonary artery
4
7.58±0.20
6.40±0.22*
, http://www.100md.com
10.12±1.31
6.11±0.18*
Mesenteric artery
4
7.76±0.12
4.64±0.18*
9.14±1.06
4.46±0.66*
Caudal artery
4
6.94±0.18
, 百拇医药
5.91±0.25*
9.49±1.32
8.23±0.12
Portal vein
5
6.24±0.14
5.77±0.17
10.47±1.09
4.74±0.41*
*P<0.05 compared with control; F,force.
3 讨论
, 百拇医药
我们先前曾基于α1-AR两种亚型的分型方法证明大鼠不同血管中α1-AR亚型分布不同，介导主动脉和肺动脉收缩的是α1B-AR，肾动脉是α1A-AR，在肠系膜动脉和尾动脉则是由两种亚型共同介导[6～8]。后来的研究表明α1-AR实际上分为α1A、α1B和α1D3种亚型。在3种亚型的分型基础上，我们发现在肾动脉介导收缩功能的是α1A-AR，但在主动脉上是α1D-AR[3]。关于肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉上功能性α1-AR亚型的分布尚不清楚。Monira等[9]的研究提示在肺动脉和肠系膜动脉上，其收缩功能部分是由α1D介导的。Lachnit[10]等和Marshall等[11]分别报道了大鼠尾动脉和门静脉上功能性α1-AR为α1A亚型；而Take等[12]用RT-PCR的分析方法发现，在大鼠门静脉中以α1B-AR的mRNA表达占主要地位。
, 百拇医药
本实验选用α1-AR选择性拮抗剂Praz和α1-AR亚型选择性拮抗剂，其中5-MU 、RS17053是α1A的选择性拮抗剂，WB4101是α1A和α1D的选择性拮抗剂，而BMY7378是α1D的选择性拮抗剂。由于上述拮抗剂的亚型选择性还不够强，加上目前尚缺少对α1B-AR选择性较好的竞争性拮抗剂，通常将选择性拮抗剂的功能性拮抗效应(pA2值)与从克隆细胞或组织的放射配体结合实验得到α1-AR 3种亚型的解离常数(pKi值)作相关分析，根据两者相关程度来判断功能性受体的亚型特征，以确定组织中功能性受体分布。本实验结果显示，肺动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.05、0.45、0.77，而肠系膜动脉的r2分别为0.02、0.47、0.87，说明在这两种血管的NE主要是通过α1D-AR 引起收缩效应，α1B-AR也可能参与作用。但是，本实验中α1D-AR的选择性拮抗剂BMY7378抑制NE收缩反应的pA2值在肺动脉呈高拮抗效应，且斜率与1.0差异没有显著性，支持在此血管上存在单一亚型的α1D-AR。在肠系膜动脉BMY7378也呈高拮抗效应，斜率与1.0差异有显著性，提示可能存在其他亚型α1-AR，但是在WB4101、5-MU和RS17053的斜率均与1没有差别，综合考虑可能仅有少量的α1B-AR参与收缩作用。上述结果与Monira等[9]的研究结果相似，Monira等也认为有α1D-AR以外的亚型介导收缩功能，但其未证实是何种亚型。本实验结果显示尾动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.77、0.77、0.44，WB4101和5-MU的斜率均与1.0有显著差异，提示在尾动脉是多种亚型共同介导收缩反应。BMY7378呈低拮抗效应，且斜率与1.0差别无显著性，说明α1D-AR参与NE收缩效应的可能性很小，在该血管以α1A-和α1B- AR为主，此结果与Lachnit等[10]不同。门静脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.79、0.81、0.27，且门静脉WB4101的斜率与1.0差异有显著性，结果似与尾动脉相似，即以α1A和α1B亚型为主，该结果也与Marshall等[11]及Take等[12]的结果不同。
, 百拇医药
由于CEC能选择性地不可逆阻断α1B-和α1D-AR ，但对α1A-AR的不可逆阻断作用很小，故采用CEC 预处理标本，观察NE收缩效应的变化，可协助判断介导NE收缩效应的α1-AR是α1B-或α1D-AR，还是α1A-AR。 本实验经CEC预处理后，在所有4种血管NE收缩效应的最大值或/和EC50都发生显著改变，说明没有一种血管的效应是由单独α1A-AR介导的。
综上所述，大鼠肺动脉和肠系膜动脉中的功能性α1-AR主要为α1D-AR；尾动脉、门静脉则主要由α1A和α1B两种亚型共同介导收缩反应。这种在不同血管上α1-AR亚型分布的差别的病理生理意义有待进一步研究。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金(39730490)资助项目；
参考文献
1 ichel MC, Kenny B, Schwinn DA, et al. Classification of alpha 1-adrenoceptor subtypes. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1995,352:1-10
2 Hieble JP, Bylund DB, Clarke DE, et al. International union of pharmacology recommendation for nomenclature of α1-adrenoceptor. Consensus update. Pharmacol Rev,1995, 47: 267-270
, 百拇医药 3 董尔丹，许开明，曲 鹏，等. 大鼠主动脉和肾动脉中的α1肾上腺素受体亚型分析. 科学通报, 1996, 41(8): 749-752
4 Han C, Li JL, Minnemen KP. Subtypes of α1-adrenoceptors in rat blood vessles. Eur J Pharmacol, 1990, 190: 97-104
5 Han C, Wu JH, Yang LH, et al. The two subtypes of α1-adrenoceptors existing in rat heart. Chin Sci Bull, 1991, 36(9):743-747
6 韩启德，李金玲，陈明哲. 大鼠血管中α1肾上腺素受体的两种亚型. 中国药理学与毒理学杂志. 1991, 5(2):122-124
, 百拇医药
7 韩启德，李金玲，Bakhilov VL. 大鼠尾动脉平滑肌中α肾上腺素受体的分析. 中国药理学与毒理学杂志. 1992, 6(3):214-217
8 陈咏梅，韩启德. 大鼠肺动脉平滑肌α肾上腺素受体的亚型分析. 中国药理学报, 1992, 13(6): 505-508
9 Hussain MB, Marshall I. Characterization of α1-adrenoceptor subtypes mediating contractions to phenylephrine in rat thoracic aorta, mesenteric artery and pulmonary artery. Br J Pharmacol, 1997,122: 849-858
10 Lachnit WG, Tran AM, Clarke DE, et al. Pharmacological characterization of an α1A-adrenoceptor mediating contractile responses to noradrenaline in isolated caudal artery of rat. Br J Pharmacol, 1997, 120: 819-826
, 百拇医药
11 Marshall I, Richard P, Burt G, et al. Different subtypes of α1A-adrenoceptor mediating contraction of rat epididymal vas deferens, rat hepatic portal vein and human prostate distinguished by the antagonist RS 17053. Br J Pharmacol, 1996, 119: 407-415
12 Take H, Shibata K, Awaji T, et al. Vascular alpha-adrenoceptor subtype selectivity and alpha-blocker-induced orthostatic hypotension. Jpn J Pharmacol, 1998, 77(1): 61-70
(1999-09-14收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第三医院血管医学研究所，北京 100083
关键词：血管；受体；亚型☆；受体；肾上腺素能α1；分析
北京医科大学学报990610 摘 要 目的：研究大鼠不同血管中α1肾上腺素受体(α1-adrenoceptor, α1-AR)亚型的分布情况及其功能意义。方法：采用离体血管收缩功能实验，测定α1-AR选择性拮抗剂抑制大鼠血管NE收缩反应的功能性亲和常数(pA2)，与分别表达α1A-、α1B-和α1D-AR的克隆细胞上结合常数(pKi)作相关性分析，以判断血管中的α1-AR亚型分布。结果：哌唑嗪、WB4101、5-MU、BMY7378和RS17053分别竞争性地抑制血管对NE的收缩效应，pA2值与这些拮抗剂对克隆α1A-、α1B-、α1D-AR 的pKi值间的决定系数在肺动脉分别为0.05、0.45、0.77；在肠系膜动脉分别为0.02、0.47、0.87;在尾动脉分别为0.77、0.77、0.44；在门静脉分别为0.79、0.81、0.27。结论：大鼠肺动脉、肠系膜动脉的功能性α1-AR主要为α1D-AR；而尾动脉与门静脉的功能性α1-AR主要是α1A和α1B亚型。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R322.12-332
Functional distribution of α1-adrenoceptor subtypes in rat vessels
HAN Jiang-Li， LU Zhi-Zhen， CHEN Ming-Zhe， HAN Qi-De
(Institute of Vascular Medicine, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Blood vessels Receptor, subtype☆ Receptors, adrenergic, alpha 1/anal
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: The distribution of three α1-adrenoceptor(α1-AR) subtypes and their functional roles in rat different vessels was investigated. Methods: The effects of α1-AR subtype selective antagonists on norepinephrine (NE)-induced contraction were observed by in vitro contractile studies. And correlation analysis between pA2 value of α1-AR selective antagonists in functional experiments and binding pKi value in cloned α1-AR subtypes expressed in HEK293 cells was used to characterize the distribution of α1-AR subtype in rat vessels. Results: Cumulative concentration-contractile response curves (CRC) for NE were competitively antagonized in rat pulmonary artery, mesenteric artery , caudal artery and portal vein by prazosin, WB4101, 5-MU, RS17053 and BMY7378. CEC shifted the NE-CRC to the right and reduced the maximal contraction response in these vessels. The coefficients of determination with α1A-, α1B- and α1D-AR in pulmonary artery were 0.05,0.45 and 0.77; in mesenteric artery 0.02, 0.47 and 0.87; in caudal artery and portal vein 0.77,0.77,0.44 and 0.79, 0.81,0.27 respectively. Conclusion: The functional α1-AR in rat pulmonary artery and mesenteric artery is mainly α1D-AR, and in rat caudal artery and portal vein mainly α1A- and α1B-AR.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:516-519)
α1肾上腺素受体(α1-adrenoceptor, α1-AR)可分为α1A、α1B和α1D 3种亚型，通过分子生物学的方法已经克隆出这3种亚型相应的cDNA[1，2]。目前关于这3种亚型在血管中的分布尚有争议。本实验室曾基于两种亚型的分型方法，观察到大鼠不同血管中α1-AR亚型在分布、调节及信号转导等方面均存在差异；基于3种亚型的分型方法，我们的研究显示，大鼠主动脉和肾动脉的功能性α1-AR分别属于α1D和α1A亚型[3]。本文采用特异性的工具药进行离体血管收缩功能实验并结合相关分析方法，按照α1-AR 3种亚型的新的分类方法进一步研究大鼠肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉中功能性α1-AR的分布情况。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
3月龄雄性Wistar大鼠，体重(200±10) g，由北京医科大学实验动物中心提供。去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、哌唑嗪(prazosin, Praz)、普萘洛尔(propranolol, Prop)、育亨宾(yohimbine, Yoh)、去甲丙咪嗪(desmethylimipramine, DMI )、间甲肾上腺素(normetanephrine, NMN)购自Sigma公司，BMY7378、WB4101、5-methyl-urapidil(5-MU)、氯乙基可乐定(chlorethylclonidine, CEC)购自Research Biochemicals 公司，RS17053为Roche Bioscience(USA)惠赠，BE2254购自Beiersddorf公司，Na125I购自中国原子能研究所，人胚胎肾细胞(HEK293细胞)及含仓鼠α1b、牛α1a和大鼠α1dcDNA的质粒由Kenneth P.Minneman教授馈赠。
, http://www.100md.com
1.2 离体血管收缩功能试验
以颈椎脱位法处死大鼠后取出所需血管，在95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2饱和的Krebs液中去除血管周围的结缔组织，制成3mm长的环形血管标本，去内皮后悬挂于10ml浴槽内，以乙酰胆碱的舒张血管作用消失作为内皮破坏成功的标志，以Han等[4]报道的方法，在37℃及通以95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2气体的Krebs液中灌流标本。标本负荷张力分别为：肺动脉1.0g，肠系膜动脉、尾动脉、门静脉各0.5g。在灌流液中加入10-7mol.L-1Yoh及10-6 mol.L-1Prop分别阻断α2和β-AR(在此基础上NE仅激动α1-AR)，另加入10-7mol.L-1DMI和10-6mol.L-1NMN以阻断神经末梢与其它组织对NE的摄取。用NE10-5mol.L-1预激标本2次，总平衡时间约为2h。平衡后，制备NE的累积浓度-收缩效应曲线(CRC)，作为对照。
, http://www.100md.com
1.3 竞争性α1-AR拮抗剂对NE介导的血管收缩的影响
标本分别在每种拮抗剂的3个浓度(最大与最小浓度之间的差别为10倍)存在下重复制备NE的CRC，与对照情况下的CRC比较，采用Schild作图法求出Praz、WB4101、5-MU、BMY7378和RS17053拮抗NE介导收缩血管的半效抑制浓度(以其负对数值pA2表示)。各种浓度的拮抗剂均预先加入灌流的Krebs液中预温育30～40min。预试验中已证明本实验条件下连续4次NE的CRC无显著差别。
1.4 CEC对NE介导的血管收缩的影响
实验条件同上，同一标本先作对照曲线，计算EC50值，以其负对数值pD2值表示。然后将标本用50 μmol.L-1CEC温育30 min，洗出40min后重复NE的CRC。
, 百拇医药
1.5 放射配体结合实验
采用氯胺T法将125I标记到非选择性α1-AR 拮抗剂BE2254上。收集分别表达α1-AR 3种亚型的克隆的HEK293细胞，按本室方法[5]制备细胞粗制膜, 通过竞争抑制实验和Hill作图求得α1-AR及其亚型的选择性拮抗剂Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053的IC50值，根据Cheng和Prusoff公式进一步算出pKi值。
1.6 统计学分析
数据均以
±s表示，显著性检验采用t检验，以P<0.05为差异有显著性的标准。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 α1-AR亚型选择性拮抗剂抑制NE所致血管收缩的pA2值
在肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053均竞争性地抑制NE引起的血管收缩。经Schild作图得出每种拮抗剂的pA2值和斜率(表1)。
表1 α1-AR选择性拮抗剂抑制NE收缩血管的pA2值和斜率
Table 1 pA2 values and slopes of α1-AR selective antagonist on inhibiting vascular contractions induced by NE Antagonist
, http://www.100md.com
pA2/slope
Pulmonary artery
Mesenteric artery
Caudal artery
Portal vein
Prazosin
10.30±0.16/1.02±0.07
10.26±0.14/0.98±0.04
10.01±0.05/0.84±0.10△
9.93±0.17/0.75±0.07*
, 百拇医药
WB4101
9.49±0.18/0.87±0.07
9.27±0.08/0.97±0.04△
9.19±0.07/0.73±0.03△*
9.14±0.09/0.72±0.04*
5-MU
7.99±0.14/1.12±0.04
7.72±0.07/1.24±0.10△
8.28±0.10/0.78±0.08*
, 百拇医药
7.89±0.05/0.81±0.13△
BMY7378
8.92±0.16/0.81±0.04
9.11±0.05/0.73±0.06*
7.23±0.14/1.01±0.14
7.03±0.09/0.84±0.07△△
RS17053
7.09±0.14/1.30±0.11
7.28±0.03/1.24±0.15△
, 百拇医药
8.12±0.04/1.10±0.09△
8.15±0.11/1.13±0.07
*P<0.05 compared with 1.0； n=4 (△n=5， △△n=6).
2.2 α1-AR亚型选择性拮抗剂与克隆的α1A-、α1B-和α1D-AR的pKi值
α1-AR及其亚型的选择性拮抗剂Praz、WB4101、5-MU、BMY7378、RS17053均以浓度依赖性竞争抑制125I-BE2254与表达在HEK293细胞的α1-AR亚型结合。竞争性抑制曲线经Hill作图得pKi和Hill系数见表2。
, http://www.100md.com
表2 α1-AR选择性拮抗剂对克隆α1A-、α1B-和α1D-AR细胞的亲和性(pKi)及Hill系数(nH)
Table 2 The affinities (pKi) and Hill coefficients (nH) in cloned α1A-、α1B-和α1D-AR cells by α1-AR selective antagonist Antagonist
α1A
α1B
α1D
, 百拇医药
pKi
nH
pKi
nH
pKi
nH
Prazosin
9.34±0.10
0.67±0.04
9.16±0.08
0.92±0.02
, 百拇医药
9.69±0.16
0.78±0.01*
WB4101
9.28±0.13
0.75±0.05*
7.29±0.17
0.85±0.10△
8.42±0.08
0.55±0.10*
5-MU
8.24±0.11
, 百拇医药
0.85±0.10△
6.40±0.13
0.75±0.12△
6.76±0.14
0.85±0.15
BMY7378
6.11±0.10
1.10±0.10
6.40±0.16
1.10±0.10
8.29±0.16
, 百拇医药
0.85±0.10
RS17053
8.59±0.08
0.93±0.08
7.06±0.09
0.86±0.05
7.40±0.11
0.93±0.10
* P<0.05 compared with 1.0； n=4(△n=5).
2.3 α1-AR选择性拮抗剂pA2值与Ki值的相关性分析(图1)
, 百拇医药
结果显示肺动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR 的决定系数(r2)分别为0.05、0.45、0.77，肠系膜动脉的r2分别为0.02、0.47、0.87，尾动脉r2分别为0.77、0.77、0.44，门静脉r2分别为0.79、0.81、0.27。
A, pulmonary artery; B,mesenteric artery; C,caudal artery; D,portal vein.
, 百拇医药
图1 4种血管上的pA2值与克隆细胞上的pKi值的相关分析
Figure 1 Correlation analysis between pA2 in rat vessels and pKi in cloned cells
2.4 CEC对NE收缩血管作用的影响
经50 μmol.L-1CEC预温育30min后，最大收缩效应除尾动脉外均有显著下降，而除门静脉NE-CRC外均有显著右移(表3)。
表3 CEC预温育对NE介导大鼠离体血管收缩功能的影响
Table 3 Effects of chlorethylclonidine on vascular contractions induced by NE in rat Vessels
, 百拇医药
n
pD2
F(maximal contraction)/mN
Control
Treatment
Control
Treatment
Pulmonary artery
4
7.58±0.20
6.40±0.22*
, http://www.100md.com
10.12±1.31
6.11±0.18*
Mesenteric artery
4
7.76±0.12
4.64±0.18*
9.14±1.06
4.46±0.66*
Caudal artery
4
6.94±0.18
, 百拇医药
5.91±0.25*
9.49±1.32
8.23±0.12
Portal vein
5
6.24±0.14
5.77±0.17
10.47±1.09
4.74±0.41*
*P<0.05 compared with control; F,force.
3 讨论
, 百拇医药
我们先前曾基于α1-AR两种亚型的分型方法证明大鼠不同血管中α1-AR亚型分布不同，介导主动脉和肺动脉收缩的是α1B-AR，肾动脉是α1A-AR，在肠系膜动脉和尾动脉则是由两种亚型共同介导[6～8]。后来的研究表明α1-AR实际上分为α1A、α1B和α1D3种亚型。在3种亚型的分型基础上，我们发现在肾动脉介导收缩功能的是α1A-AR，但在主动脉上是α1D-AR[3]。关于肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉上功能性α1-AR亚型的分布尚不清楚。Monira等[9]的研究提示在肺动脉和肠系膜动脉上，其收缩功能部分是由α1D介导的。Lachnit[10]等和Marshall等[11]分别报道了大鼠尾动脉和门静脉上功能性α1-AR为α1A亚型；而Take等[12]用RT-PCR的分析方法发现，在大鼠门静脉中以α1B-AR的mRNA表达占主要地位。
, 百拇医药
本实验选用α1-AR选择性拮抗剂Praz和α1-AR亚型选择性拮抗剂，其中5-MU 、RS17053是α1A的选择性拮抗剂，WB4101是α1A和α1D的选择性拮抗剂，而BMY7378是α1D的选择性拮抗剂。由于上述拮抗剂的亚型选择性还不够强，加上目前尚缺少对α1B-AR选择性较好的竞争性拮抗剂，通常将选择性拮抗剂的功能性拮抗效应(pA2值)与从克隆细胞或组织的放射配体结合实验得到α1-AR 3种亚型的解离常数(pKi值)作相关分析，根据两者相关程度来判断功能性受体的亚型特征，以确定组织中功能性受体分布。本实验结果显示，肺动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.05、0.45、0.77，而肠系膜动脉的r2分别为0.02、0.47、0.87，说明在这两种血管的NE主要是通过α1D-AR 引起收缩效应，α1B-AR也可能参与作用。但是，本实验中α1D-AR的选择性拮抗剂BMY7378抑制NE收缩反应的pA2值在肺动脉呈高拮抗效应，且斜率与1.0差异没有显著性，支持在此血管上存在单一亚型的α1D-AR。在肠系膜动脉BMY7378也呈高拮抗效应，斜率与1.0差异有显著性，提示可能存在其他亚型α1-AR，但是在WB4101、5-MU和RS17053的斜率均与1没有差别，综合考虑可能仅有少量的α1B-AR参与收缩作用。上述结果与Monira等[9]的研究结果相似，Monira等也认为有α1D-AR以外的亚型介导收缩功能，但其未证实是何种亚型。本实验结果显示尾动脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.77、0.77、0.44，WB4101和5-MU的斜率均与1.0有显著差异，提示在尾动脉是多种亚型共同介导收缩反应。BMY7378呈低拮抗效应，且斜率与1.0差别无显著性，说明α1D-AR参与NE收缩效应的可能性很小，在该血管以α1A-和α1B- AR为主，此结果与Lachnit等[10]不同。门静脉与α1A-、α1B-和α1D-AR的r2分别为0.79、0.81、0.27，且门静脉WB4101的斜率与1.0差异有显著性，结果似与尾动脉相似，即以α1A和α1B亚型为主，该结果也与Marshall等[11]及Take等[12]的结果不同。
, 百拇医药
由于CEC能选择性地不可逆阻断α1B-和α1D-AR ，但对α1A-AR的不可逆阻断作用很小，故采用CEC 预处理标本，观察NE收缩效应的变化，可协助判断介导NE收缩效应的α1-AR是α1B-或α1D-AR，还是α1A-AR。 本实验经CEC预处理后，在所有4种血管NE收缩效应的最大值或/和EC50都发生显著改变，说明没有一种血管的效应是由单独α1A-AR介导的。
综上所述，大鼠肺动脉和肠系膜动脉中的功能性α1-AR主要为α1D-AR；尾动脉、门静脉则主要由α1A和α1B两种亚型共同介导收缩反应。这种在不同血管上α1-AR亚型分布的差别的病理生理意义有待进一步研究。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金(39730490)资助项目；
参考文献
1 ichel MC, Kenny B, Schwinn DA, et al. Classification of alpha 1-adrenoceptor subtypes. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1995,352:1-10
2 Hieble JP, Bylund DB, Clarke DE, et al. International union of pharmacology recommendation for nomenclature of α1-adrenoceptor. Consensus update. Pharmacol Rev,1995, 47: 267-270
, 百拇医药 3 董尔丹，许开明，曲 鹏，等. 大鼠主动脉和肾动脉中的α1肾上腺素受体亚型分析. 科学通报, 1996, 41(8): 749-752
4 Han C, Li JL, Minnemen KP. Subtypes of α1-adrenoceptors in rat blood vessles. Eur J Pharmacol, 1990, 190: 97-104
5 Han C, Wu JH, Yang LH, et al. The two subtypes of α1-adrenoceptors existing in rat heart. Chin Sci Bull, 1991, 36(9):743-747
6 韩启德，李金玲，陈明哲. 大鼠血管中α1肾上腺素受体的两种亚型. 中国药理学与毒理学杂志. 1991, 5(2):122-124
, 百拇医药
7 韩启德，李金玲，Bakhilov VL. 大鼠尾动脉平滑肌中α肾上腺素受体的分析. 中国药理学与毒理学杂志. 1992, 6(3):214-217
8 陈咏梅，韩启德. 大鼠肺动脉平滑肌α肾上腺素受体的亚型分析. 中国药理学报, 1992, 13(6): 505-508
9 Hussain MB, Marshall I. Characterization of α1-adrenoceptor subtypes mediating contractions to phenylephrine in rat thoracic aorta, mesenteric artery and pulmonary artery. Br J Pharmacol, 1997,122: 849-858
10 Lachnit WG, Tran AM, Clarke DE, et al. Pharmacological characterization of an α1A-adrenoceptor mediating contractile responses to noradrenaline in isolated caudal artery of rat. Br J Pharmacol, 1997, 120: 819-826
, 百拇医药
11 Marshall I, Richard P, Burt G, et al. Different subtypes of α1A-adrenoceptor mediating contraction of rat epididymal vas deferens, rat hepatic portal vein and human prostate distinguished by the antagonist RS 17053. Br J Pharmacol, 1996, 119: 407-415
12 Take H, Shibata K, Awaji T, et al. Vascular alpha-adrenoceptor subtype selectivity and alpha-blocker-induced orthostatic hypotension. Jpn J Pharmacol, 1998, 77(1): 61-70
(1999-09-14收稿), http://www.100md.com