金属硫蛋白对活性氧诱导的平滑肌细胞增殖的抑制作用
作者：葛淑君 凤志慧 仲崇霞 陶家平 程时
单位：葛淑君 凤志慧 仲崇霞 程时 北京医科大学生物物理系；陶家平 医药卫生分析中心，北京 100083
关键词：金属硫蛋白；药理学；肌；平滑；血管；生长和发育；活性氧组分；副作用；肌；平滑；血管；药物作用
北京医科大学学报990609 摘 要 目的：研究金属硫蛋白对活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：用过氧化氢和甲萘醌分别作为内源性和外源性活性氧刺激平滑肌细胞增殖，应用细胞总蛋白定量，3H-TdR参入，细胞周期时相测定等方法测定细胞增殖。结果：过氧化氢(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可诱导培养的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖, 使其蛋白总量增加，S期细胞比例增高，DNA合成率增加。金属硫蛋白可以抑制过氧化氢和甲萘醌诱导的血管平滑肌细胞增殖。结论：金属硫蛋白对预防由活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖所引起的疾病可能具有重要作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R332.11-332
The inhibitory effect of metallothionein on the proliferation
of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species
GE Shu-Jun#, FENG Zhi-Hui, ZHONG Chong-Xia, TAO Jia-Ping, CHENG Shi
(#Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Metallothionein/pharmacol Muscle, smooth, vascular/growth Reactive oxygen species/adv eff Muscle, smooth, vascular/drug eff
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of metallothionein on the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species. Methods: Menadione and H2O2 were added to the medium of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells as internal and extraneous reactive oxygen species respectively. Protein quantitative assay,3H-TdR incorporation and cell cycle phase analysis were used to detect proliferation of vascular smooth muscle cells. Results: The results showed that menadione(0.5 μmol.L-1) and H2O2 (25 μmol.L-1) enhanced the proliferation of vascular smooth muscle cells with protein concentration increased, and the ratio of S phase became higher and 3H-TdR incorporation increased. Metallothionein could inhibit the effects of menadione and H2O2 on the proliferation of vascular smooth muscle cells. Conclusion: Metallothionein may have certain effect in preventing disease caused by reactive oxygen species induced vascular smooth muscle cells proliferation.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:512-515)
血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成及经皮腔内冠状动脉成形术( percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA ) 后再狭窄的重要原因[1]。对VSMC增殖机制以及抑制其增殖的研究近年来一直是心血管领域的热点。有证据表明，动脉血管在损伤、炎症等情况下局部产生的过量活性氧( reactive oxygen species, ROS)对刺激VSMC增生起了重要作用[2～6]。因此，有效地阻断活性氧对VSMC的增殖作用是控制动脉粥样硬化和预防血管成形术后再狭窄的重要途径之一。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是含多量巯基和金属的非酶类应激蛋白，对自由基有很强的清除作用，是体内目前已知最强的·OH清除剂[7]。本实验室制备的锌7-金属硫蛋白(Zn7-MT )不但去除了有毒金属镉，而且有更强清除自由基作用[8，9]。据此，本实验以培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为对象，观察Zn7-MT对活性氧促VSMC增殖的影响，为MT在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病上的应用提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
主要试剂：DMEM、小牛血清、胰蛋白酶和RNA酶购自Gibco公司，甲萘醌(menadione，2-methyl-1,4-naphthaquinone)、碘化丙啶购自Sigma公司, 氚标胸腺嘧啶核苷([3H]thymidine,[3H]TdR)购自中科院上海原子能所，锌7-金属硫蛋白(Zn7-MT)由本室制备。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
主要仪器：CO2孵箱(美国Napco), Wallac 1410液闪计数仪(Pharmacia)，FACS流式细胞仪(德国Becton Dickison)
1.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养
, 百拇医药
Wistar大鼠(由北京医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g，200g.L-1乌拉 坦麻醉(每千克体重5 ml)，无菌条件下，取出胸主动脉，去除血管内膜及外膜，将中膜组织以贴块法进行SMC原代培养。培养液为含20%(体积分数)小牛血清(NCS)的DMEM培养液，细胞融合后，用 1.25 g.L-1 胰蛋白酶消化传代。光镜下观察细胞呈典型的峰-谷状表现，经肌动蛋白抗体免疫组化鉴定后，证实为VSMC。实验用4～10 代细胞。
1.3 蛋白含量测定
将VSMC按1×105ml-1密度接种于24孔培养板，每孔0.5 ml。用含10%(体积分数)NCS的DMEM培养24 h后，更换不含NCS的DMEM培养24 h，使细胞同步化于G0期。然后换成含5%(体积分数)NCS的DMEM培养液，实验组同时加入药物处理，继续培养24 h，1.25 g.L-1的胰蛋白酶消化细胞，2 mol.L-1 NaOH 溶解细胞，最后用考马斯亮蓝法测定每孔细胞总蛋白量。以此反映每孔细胞总数。
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1.4 流式细胞仪测定细胞周期时相
将VSMC按1×105 ml-1 接种于100 ml细胞培养瓶。每瓶4 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，1.25 g.L-1的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞约1×106，制成单细胞悬液，将其固定于80%(体积分数)乙醇24 h以上，离心弃去固定液，PBS洗3次，加RNA酶(10 g.L-1)20μl，37℃ 消化30min。最后加入50g.L-1碘化丙啶250μl,上机测试。
1.5 细胞合成DNA测定
将VSMC按每孔1×105密度接种于96孔培养板，每孔0.1 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，在实验结束前4～6h加入3H-TdR(3.7×105 Bq.ml-1)每孔7.4×103 Bq，实验结束后，PBS冲洗细胞3次，1.25g.L-1胰蛋白酶消化细胞，2mol.L-1 NaOH 溶解细胞，用多头细胞收集器将其抽滤到玻璃纤维滤膜上，晾干后将其放入液闪瓶中，加入闪烁液，避光放置过夜，用Wallac1410液体闪烁计数仪测定滤膜的放射活性(Bq)。
, 百拇医药
1.6 统计学方法
实验结果以
±s表示。统计学分析采用方差分析组间q检验。P<0.01为差异具有显著性。
2 实验结果
2.1 过氧化氢(H2O2)和甲萘醌对VSMC蛋白定量的影响
分别用12.5、25、50、100、200和300 μmol.L-1浓度的H2O2作用于VSMC，结果显示12.5，25 和50μmol.L-1的H2O2使VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且25μmol.L-1 H2O2刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。
, 百拇医药
分别用0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol.L-1甲萘醌作用于VSMC，结果显示在0.1和0.5 μmol.L-1甲萘醌作用下，VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且0.5μmol.L-1甲萘醌刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。
2.2 MT对H2O2和甲萘醌促VSMC细胞增殖的影响
由表1可看出，H2O2 (25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可明显增加VSMC蛋白总量(P<0.01)。Zn7-MT(5×10-6mol.L-1) 可明显抑制上述浓度H2O2和甲萘醌引起的VSMC蛋白总量的增加(P<0.01)。而单纯Zn7-MT(5×10-6mol.L-1)本身对VSMC蛋白总量无影响。
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3H-TdR参入实验显示，H2O2(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可明显增加VSMC细胞3H-TdR参入量，由表1可以看出，与空白对照组比较，3H-TdR参入分别增加了68.8%(P<0.01)和55.0%(P<0.01)。说明H2O2和甲萘醌可明显促进VSMC细胞DNA合成，刺激VSMC增殖。Zn7-MT(5×10-6mol.L-1)可对抗H2O2和甲萘醌对VSMC细胞DNA合成的刺激作用。而单纯Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)本身对VSMC细胞DNA合成无影响。
, 百拇医药
表1 Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1) 对甲萘醌(0.5μmol.L-1)和过氧化氢(H2O2，25μmol.L-1)诱导的VSMC增殖的影响(%，±s)
Table 1 The effects of Zn7-MT(5×10-6mol.L-1) on proliferation of induced by 0.5 μ mol.L-1 menadione
and 25 μmol.L-1 hydrogen peroxide (%，±s)
, http://www.100md.com
Blank
MT control
H2O2
Menadione
H2O2+MT
Menadione+MT
m(protein)/mg
0.244±0.032
0.258±0.028
0.321±0.029＃＃
, 百拇医药
0.309±0.017＃＃
0.256±0.024**
0.261±0.041△△
A(3H-TdR incorporation)/Bq
5.100±0.491
5.505±0.510
8.610±0.902＃＃
7.905±0.806＃＃
5.920±0.562**
, http://www.100md.com
5.490±0.611△△
n=6, ##P<0.01, compared with blank control; **P<0.01, compared with H2O2 group, △△P<0.01, compared with menadione group.
2.3 MT、H2O2和甲萘醌对VSMC细胞周期的影响
对照及处理后的VSMC经流式细胞计测定，所得数据经过专用DNA拟合软件处理后即可得到不同时相细胞的数目和百分比。图1中左边第1峰为样品中的碎片峰，第2峰为二倍体细胞峰，代表G0/G1期细胞，第3峰为四倍体细胞峰，代表G2/M期细胞，第2，3峰中间部分代表S期细胞。从表1中可以看出，与空白对照比较，加入H2O2(25μmol.L-1)或甲萘醌(0.5μmol.L-1)后，S期细胞百分比分别升高了66.0 %(P<0.01)和57.0%(P<0.01)，而G0/G1期细胞百分比则下降。说明H2O2和甲萘醌能够促进细胞由G0期向S期的转化。Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)可消除H2O2和甲萘醌对细胞周期的这一影响。而单纯Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)本身对VSMC细胞周期无影响。
, 百拇医药
图1 细胞周期分析图
Figure 1 Cell-cycle analysis graph
表2 Zn7-MT (5×10-6 mol.L-1) ，甲萘醌(0.5μmol.L-1)和过氧化氢 (H2O2，25 μmol.L-1)对VSMC细胞周期的影响(%，±s)
Table 2 The effects of Zn7-MT (5×10-6mol.L-1), menadione (0.5μmol.L-1)
, http://www.100md.com
and hydrogen peroxide (H2O2 25μmol.L-1) on the cell cycle of VSMC (%，±s)
Blank
MT control
H2O2
Menadione
H2O2+MT
Menadione+MT
, 百拇医药
G0/G1
67.5±6.0
65.8±6.2
54.7±5.2＃＃
57.1±3.0＃＃
68.7±6.7**
65.2±6.2△△
S
15.6±0.8
16.8±1.5
, http://www.100md.com 25.9±2.7＃＃
24.5±2.2＃＃
15.0±1.4**
16.3±1.8△△
G2/M
16.9±0.4
17.3±1.1
19.4±0.8
18.6±1.4
16.3±0.5
14.5±0.5
, 百拇医药
n=5, ##P<0.01, compared with blank control; ** P<0.01, compared with H2O2 group； △△P<0.01; compared with menadione group.
3 讨论
VSMC增殖是AS和血管成形术后再狭窄的主要病理特征。在VSMC增殖中，ROS起了重要作用。正常情况下，VSMC位于动脉中膜，处于生长静止状态。在血管内皮损伤时，VSMC增殖并迁移到血管内膜。本实验选用H2O2和甲萘醌( 也称维生素K3，进入细胞后，经代谢可产生活性氧，如H2O2，.O2-，.OH等)分别作为外源性和内源性ROS。实验结果表明，H2O2(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)均可增加VSMC蛋白量和促进3H-TdR参入。增加S期细胞比例，表明外源性和内源性活性氧都可诱导培养的VSMC的增殖。此与文献[2～6]报道一致。
, 百拇医药
细胞增殖是受许多因素严格调控的。90年代以来，有关ROS调节细胞增殖的研究已引起人们广泛关注。研究提示，ROS促进细胞增殖可能通过信号转导途径激活细胞内生长相关基因如，c-fos,c-myc,jun等，引起DNA合成增加[2～4]。
MT是一个内源性小分子应激蛋白。多年来，我们在多层次生命体系中研究表明，MT有很强的清除自由基功能。并且，MT可以通过细胞膜上的特异结合位点进入细胞内[10]。因此提示，MT抑制ROS诱导的细胞增殖主要是由于MT的清除自由基作用。
本研究显示，MT能够抑制活性氧诱导的VSMC增殖。MT是机体内源性物质，易于代谢，外源给予MT对机体无明显毒性作用。而锌本身又是机体所必需的微量元素，具有损伤修复功能。MT能有效抑制活性氧促进的VSMC增殖，对于预防和控制VSMC增殖有关疾病具有重要的潜在应用价值。
参考文献
, 百拇医药
1 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature， 1993,362:801-805
2 Rao GN, Berk BC. Active oxygen species stimulate vascular smooth muscle cell growth and proto-oncogene expression. Circ Res,1992, 70: 593-599
3 Delafontaine P, Ku L. Reactive oxygen species stimulate insulin-like growth factor I synthesis in vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res, 1997, 33: 216-222
, http://www.100md.com
4 Tatla S,Woodhead V, Foreman, et al. The role of reactive oxygen species in triggering proliferation and IL-2 secretion in T cells. Free Rad Biol Med, 1999, 26:14-24
5 Cathapermal S, Lavigne MC, Leong SM, et al. Stereoisomer-specific inhibition of superoxide anion-induced rat aortic smooth-muscle cell proliferation by 17beta-estradiol is estrogen receptor dependent. J Cardiovasc Pharmacol,1998,31:499-505
6 Gamberini M, Leite LC. Proliferation of mouse fibroblasts induced by 1,2-dimethylhydrazine auto-oxidation: role of iron and free radicals.Biochem Biophs Res Commun, 1997,234:44-47
, http://www.100md.com
7 周杰昊,程 时. 金属硫蛋白与医学. 生理科学进展, 1995，26：29-34
8 葛淑君,程 时. 锌7-与镉7-金属硫蛋白对羟自由基损伤大鼠红细胞膜保护作用的比较. 生物化学杂志，1997,13 ：97-100
9 葛淑君,仲崇霞,程 时,等. 锌7-与镉7-金属硫蛋白抗羟自由基保护线粒体效应. 生物化学与生物物理学报，1998,30：266-271
10 Cheng S, Ge SJ, Zhong CX, et al. Speccific binding sites of metallothionein on endothelium of small vessels in myocardium, In Klaassen CD eds. Metallothionein Ⅳ. Basel：Birkhauser Verlag， 1999.561-566
(1999-08-31收稿), 百拇医药
单位：葛淑君 凤志慧 仲崇霞 程时 北京医科大学生物物理系；陶家平 医药卫生分析中心，北京 100083
关键词：金属硫蛋白；药理学；肌；平滑；血管；生长和发育；活性氧组分；副作用；肌；平滑；血管；药物作用
北京医科大学学报990609 摘 要 目的：研究金属硫蛋白对活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：用过氧化氢和甲萘醌分别作为内源性和外源性活性氧刺激平滑肌细胞增殖，应用细胞总蛋白定量，3H-TdR参入，细胞周期时相测定等方法测定细胞增殖。结果：过氧化氢(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可诱导培养的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖, 使其蛋白总量增加，S期细胞比例增高，DNA合成率增加。金属硫蛋白可以抑制过氧化氢和甲萘醌诱导的血管平滑肌细胞增殖。结论：金属硫蛋白对预防由活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖所引起的疾病可能具有重要作用。
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中国图书资料分类法分类号 R332.11-332
The inhibitory effect of metallothionein on the proliferation
of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species
GE Shu-Jun#, FENG Zhi-Hui, ZHONG Chong-Xia, TAO Jia-Ping, CHENG Shi
(#Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Metallothionein/pharmacol Muscle, smooth, vascular/growth Reactive oxygen species/adv eff Muscle, smooth, vascular/drug eff
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ABSTRACT Objective: To investigate the effect of metallothionein on the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species. Methods: Menadione and H2O2 were added to the medium of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells as internal and extraneous reactive oxygen species respectively. Protein quantitative assay,3H-TdR incorporation and cell cycle phase analysis were used to detect proliferation of vascular smooth muscle cells. Results: The results showed that menadione(0.5 μmol.L-1) and H2O2 (25 μmol.L-1) enhanced the proliferation of vascular smooth muscle cells with protein concentration increased, and the ratio of S phase became higher and 3H-TdR incorporation increased. Metallothionein could inhibit the effects of menadione and H2O2 on the proliferation of vascular smooth muscle cells. Conclusion: Metallothionein may have certain effect in preventing disease caused by reactive oxygen species induced vascular smooth muscle cells proliferation.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:512-515)
血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)形成及经皮腔内冠状动脉成形术( percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA ) 后再狭窄的重要原因[1]。对VSMC增殖机制以及抑制其增殖的研究近年来一直是心血管领域的热点。有证据表明，动脉血管在损伤、炎症等情况下局部产生的过量活性氧( reactive oxygen species, ROS)对刺激VSMC增生起了重要作用[2～6]。因此，有效地阻断活性氧对VSMC的增殖作用是控制动脉粥样硬化和预防血管成形术后再狭窄的重要途径之一。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是含多量巯基和金属的非酶类应激蛋白，对自由基有很强的清除作用，是体内目前已知最强的·OH清除剂[7]。本实验室制备的锌7-金属硫蛋白(Zn7-MT )不但去除了有毒金属镉，而且有更强清除自由基作用[8，9]。据此，本实验以培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为对象，观察Zn7-MT对活性氧促VSMC增殖的影响，为MT在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病上的应用提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
主要试剂：DMEM、小牛血清、胰蛋白酶和RNA酶购自Gibco公司，甲萘醌(menadione，2-methyl-1,4-naphthaquinone)、碘化丙啶购自Sigma公司, 氚标胸腺嘧啶核苷([3H]thymidine,[3H]TdR)购自中科院上海原子能所，锌7-金属硫蛋白(Zn7-MT)由本室制备。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
主要仪器：CO2孵箱(美国Napco), Wallac 1410液闪计数仪(Pharmacia)，FACS流式细胞仪(德国Becton Dickison)
1.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养
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Wistar大鼠(由北京医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g，200g.L-1乌拉 坦麻醉(每千克体重5 ml)，无菌条件下，取出胸主动脉，去除血管内膜及外膜，将中膜组织以贴块法进行SMC原代培养。培养液为含20%(体积分数)小牛血清(NCS)的DMEM培养液，细胞融合后，用 1.25 g.L-1 胰蛋白酶消化传代。光镜下观察细胞呈典型的峰-谷状表现，经肌动蛋白抗体免疫组化鉴定后，证实为VSMC。实验用4～10 代细胞。
1.3 蛋白含量测定
将VSMC按1×105ml-1密度接种于24孔培养板，每孔0.5 ml。用含10%(体积分数)NCS的DMEM培养24 h后，更换不含NCS的DMEM培养24 h，使细胞同步化于G0期。然后换成含5%(体积分数)NCS的DMEM培养液，实验组同时加入药物处理，继续培养24 h，1.25 g.L-1的胰蛋白酶消化细胞，2 mol.L-1 NaOH 溶解细胞，最后用考马斯亮蓝法测定每孔细胞总蛋白量。以此反映每孔细胞总数。
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1.4 流式细胞仪测定细胞周期时相
将VSMC按1×105 ml-1 接种于100 ml细胞培养瓶。每瓶4 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，1.25 g.L-1的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞约1×106，制成单细胞悬液，将其固定于80%(体积分数)乙醇24 h以上，离心弃去固定液，PBS洗3次，加RNA酶(10 g.L-1)20μl，37℃ 消化30min。最后加入50g.L-1碘化丙啶250μl,上机测试。
1.5 细胞合成DNA测定
将VSMC按每孔1×105密度接种于96孔培养板，每孔0.1 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，在实验结束前4～6h加入3H-TdR(3.7×105 Bq.ml-1)每孔7.4×103 Bq，实验结束后，PBS冲洗细胞3次，1.25g.L-1胰蛋白酶消化细胞，2mol.L-1 NaOH 溶解细胞，用多头细胞收集器将其抽滤到玻璃纤维滤膜上，晾干后将其放入液闪瓶中，加入闪烁液，避光放置过夜，用Wallac1410液体闪烁计数仪测定滤膜的放射活性(Bq)。
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1.6 统计学方法
实验结果以
±s表示。统计学分析采用方差分析组间q检验。P<0.01为差异具有显著性。2 实验结果
2.1 过氧化氢(H2O2)和甲萘醌对VSMC蛋白定量的影响
分别用12.5、25、50、100、200和300 μmol.L-1浓度的H2O2作用于VSMC，结果显示12.5，25 和50μmol.L-1的H2O2使VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且25μmol.L-1 H2O2刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。
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分别用0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol.L-1甲萘醌作用于VSMC，结果显示在0.1和0.5 μmol.L-1甲萘醌作用下，VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且0.5μmol.L-1甲萘醌刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。
2.2 MT对H2O2和甲萘醌促VSMC细胞增殖的影响
由表1可看出，H2O2 (25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可明显增加VSMC蛋白总量(P<0.01)。Zn7-MT(5×10-6mol.L-1) 可明显抑制上述浓度H2O2和甲萘醌引起的VSMC蛋白总量的增加(P<0.01)。而单纯Zn7-MT(5×10-6mol.L-1)本身对VSMC蛋白总量无影响。
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3H-TdR参入实验显示，H2O2(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)可明显增加VSMC细胞3H-TdR参入量，由表1可以看出，与空白对照组比较，3H-TdR参入分别增加了68.8%(P<0.01)和55.0%(P<0.01)。说明H2O2和甲萘醌可明显促进VSMC细胞DNA合成，刺激VSMC增殖。Zn7-MT(5×10-6mol.L-1)可对抗H2O2和甲萘醌对VSMC细胞DNA合成的刺激作用。而单纯Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)本身对VSMC细胞DNA合成无影响。
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表1 Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1) 对甲萘醌(0.5μmol.L-1)和过氧化氢(H2O2，25μmol.L-1)诱导的VSMC增殖的影响(%，
±s)Table 1 The effects of Zn7-MT(5×10-6mol.L-1) on proliferation of induced by 0.5 μ mol.L-1 menadione
and 25 μmol.L-1 hydrogen peroxide (%，
±s), http://www.100md.com
Blank
MT control
H2O2
Menadione
H2O2+MT
Menadione+MT
m(protein)/mg
0.244±0.032
0.258±0.028
0.321±0.029＃＃
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0.309±0.017＃＃
0.256±0.024**
0.261±0.041△△
A(3H-TdR incorporation)/Bq
5.100±0.491
5.505±0.510
8.610±0.902＃＃
7.905±0.806＃＃
5.920±0.562**
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5.490±0.611△△
n=6, ##P<0.01, compared with blank control; **P<0.01, compared with H2O2 group, △△P<0.01, compared with menadione group.
2.3 MT、H2O2和甲萘醌对VSMC细胞周期的影响
对照及处理后的VSMC经流式细胞计测定，所得数据经过专用DNA拟合软件处理后即可得到不同时相细胞的数目和百分比。图1中左边第1峰为样品中的碎片峰，第2峰为二倍体细胞峰，代表G0/G1期细胞，第3峰为四倍体细胞峰，代表G2/M期细胞，第2，3峰中间部分代表S期细胞。从表1中可以看出，与空白对照比较，加入H2O2(25μmol.L-1)或甲萘醌(0.5μmol.L-1)后，S期细胞百分比分别升高了66.0 %(P<0.01)和57.0%(P<0.01)，而G0/G1期细胞百分比则下降。说明H2O2和甲萘醌能够促进细胞由G0期向S期的转化。Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)可消除H2O2和甲萘醌对细胞周期的这一影响。而单纯Zn7-MT(5×10-6 mol.L-1)本身对VSMC细胞周期无影响。
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图1 细胞周期分析图
Figure 1 Cell-cycle analysis graph
表2 Zn7-MT (5×10-6 mol.L-1) ，甲萘醌(0.5μmol.L-1)和过氧化氢 (H2O2，25 μmol.L-1)对VSMC细胞周期的影响(%，
±s)Table 2 The effects of Zn7-MT (5×10-6mol.L-1), menadione (0.5μmol.L-1)
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and hydrogen peroxide (H2O2 25μmol.L-1) on the cell cycle of VSMC (%，
±s)Blank
MT control
H2O2
Menadione
H2O2+MT
Menadione+MT
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G0/G1
67.5±6.0
65.8±6.2
54.7±5.2＃＃
57.1±3.0＃＃
68.7±6.7**
65.2±6.2△△
S
15.6±0.8
16.8±1.5
, http://www.100md.com 25.9±2.7＃＃
24.5±2.2＃＃
15.0±1.4**
16.3±1.8△△
G2/M
16.9±0.4
17.3±1.1
19.4±0.8
18.6±1.4
16.3±0.5
14.5±0.5
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n=5, ##P<0.01, compared with blank control; ** P<0.01, compared with H2O2 group； △△P<0.01; compared with menadione group.
3 讨论
VSMC增殖是AS和血管成形术后再狭窄的主要病理特征。在VSMC增殖中，ROS起了重要作用。正常情况下，VSMC位于动脉中膜，处于生长静止状态。在血管内皮损伤时，VSMC增殖并迁移到血管内膜。本实验选用H2O2和甲萘醌( 也称维生素K3，进入细胞后，经代谢可产生活性氧，如H2O2，.O2-，.OH等)分别作为外源性和内源性ROS。实验结果表明，H2O2(25μmol.L-1)和甲萘醌(0.5μmol.L-1)均可增加VSMC蛋白量和促进3H-TdR参入。增加S期细胞比例，表明外源性和内源性活性氧都可诱导培养的VSMC的增殖。此与文献[2～6]报道一致。
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细胞增殖是受许多因素严格调控的。90年代以来，有关ROS调节细胞增殖的研究已引起人们广泛关注。研究提示，ROS促进细胞增殖可能通过信号转导途径激活细胞内生长相关基因如，c-fos,c-myc,jun等，引起DNA合成增加[2～4]。
MT是一个内源性小分子应激蛋白。多年来，我们在多层次生命体系中研究表明，MT有很强的清除自由基功能。并且，MT可以通过细胞膜上的特异结合位点进入细胞内[10]。因此提示，MT抑制ROS诱导的细胞增殖主要是由于MT的清除自由基作用。
本研究显示，MT能够抑制活性氧诱导的VSMC增殖。MT是机体内源性物质，易于代谢，外源给予MT对机体无明显毒性作用。而锌本身又是机体所必需的微量元素，具有损伤修复功能。MT能有效抑制活性氧促进的VSMC增殖，对于预防和控制VSMC增殖有关疾病具有重要的潜在应用价值。
参考文献
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10 Cheng S, Ge SJ, Zhong CX, et al. Speccific binding sites of metallothionein on endothelium of small vessels in myocardium, In Klaassen CD eds. Metallothionein Ⅳ. Basel：Birkhauser Verlag， 1999.561-566
(1999-08-31收稿), 百拇医药