结扎冠状动脉对大鼠心肌凋亡相关基因表达的影响*
作者：曹立珍 谭焕然
单位：北京医科大学药理学系，北京 100083
关键词：心肌缺血；病理生理学；普萘洛尔；药理学；脱噬作用；药物作用；细胞凋亡因子☆
北京医科大学学报990606 摘 要 目的：研究大鼠冠状动脉结扎时心肌组织中凋亡相关基因的表达状况与急性心肌缺血的关系。方法：结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型。描记Ⅱ导心电图；检测血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性、心肌组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性；RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas、CPP32、Bcl-2和Bax在心肌组织的相对表达量。观察伪结扎组、结扎组、苦豆碱(aloperine, Alo)给药组(20 mg.kg-1)、普萘洛尔(propranolol, Prop)给药组(2 mg.kg-1)对上述各指标的影响。采用单因素方差分析(One Way ANOVA)对结果进行统计处理。结果：结扎大鼠左冠状动脉前降支可导致心电图明显的缺血性改变及血清CK活性显著升高；心肌组织的MDA含量和SOD活性显著增加；缺血心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达显著增加(P<0.001)，Bax变化不明显(P<0.05)。Alo和Prop能明显缓解心电图的缺血性改变并降低血清CK活性；减少心肌组织的MDA含量和SOD活性；降低心肌组织Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达(P<0.001)，对Bax影响不明显(P<0.05)。结论：结扎大鼠左冠状动脉前降支所致的急性心肌缺血性损伤与Fas参与、CPP32介导的心肌细胞凋亡有关，也与Bcl-2家族参与的心肌细胞凋亡有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R542.2-332
Effects on apoptosis related genes expression
in myocardium following coronary artery occlusion in the rat
CAO Li-Zhen#, TAN Huan-Ran
(#Department of Pharmacology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Acute myocardial ischemia physiopathol Propranolol/pharmacol Apoptosis/drug off
, 百拇医药
Apoptosis related factor☆
ABSTRACT Objective: To study the expression of some apoptosis related genes in AMI and the influences of aloperine and propranolol. The relationship between apoptosis related genes and AMI were also investigated. Methods: AMI rat model was induced by ligation of the anterior branch of the left coronary artery. All animals were divided into four groups: sham-operation group, occlusion group, aloperine group (20 mg.kg-1) and propranolol group (2mg.kg-1). ECG lead Ⅱ was recorded. The level of serum creatine kinase (CK) activity, myocardial malondialdehyde (MDA) content and myocardial superoxide dismutase (SOD) activity were also determined. The myocardial expression of apoptosis related genes: Fas, CPP32, Bcl-2 and Bax were detected with RT-PCR. Statistical significance in multiple comparisons was determined by One Way ANOVA. Results: Coronary occlusion of the rats led to significent ischemic changes of ECG, and increased the level of serum CK activity, myocardial MDA content and SOD activity. The myocardial expression of Fas, CPP32 and Bcl-2 were increased by coronary occlusion. But had no significance was detected in Bax expression. Aloperine and propranolol attenuated the ischemic changes of ECG, reduced the level of serum CK activity, myocardial MDA content and SOD activity. Both drugs also reduced the myocardial expression of Fas, CPP32 and Bcl-2, but no significance with Bax expression. Conclusion: The acute myocardial ischemic injury induced by ligation of the anterior branch of the left coronary artery may have relationship with apoptosis related genes: Fas, CPP32 and Bcl-2 family.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:501-505)
直到目前，急性心肌缺血及心肌梗死等缺血性心脏病的发病机制仍没有完全研究清楚。近年来发现，急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有心肌细胞凋亡现象的存在[1]，对心肌缺血和心肌梗死的发病机制又提出了一个新的课题，特别是它与心肌细胞凋亡的关系使我们进入了一个新的研究领域。苦豆碱(aloperine, Alo)是由豆科槐属植物苦豆子(sophora alopecuroides L.)中提取的主要生物碱之一，研究表明它有对抗多种实验性心律失常及心肌损伤的作用。普萘洛尔(propranolol, Prop)是临床应用最早的一种β受体阻滞剂，主要用于治疗高血压、缺血性心脏病、室上性心动过速等。我们将上述两个药物作为本实验中的抗心肌缺血药，进一步研究在其作用下，心肌凋亡相关基因表达的状况及机制，探讨凋亡相关基因与急性心肌缺血的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 动物
健康Wistar大鼠(动物合格证号：01-3056)，雄性，体重350～400g，由北京医科大学动物部提供。
1.2 药品和试剂
Alo (原料药，宁夏盐池制药厂)，Prop (原料药，东北制药总厂)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，9701 RNA提取试剂盒购自北京牛牛基因技术有限公司，心肌肌动蛋白(C-actin)、Fas、CPP32、Bcl-2和Bax引物由上海生工生物工程有限公司合成，M-MLV反转录酶，随机引物，100 bp DNA分子质量标准，Taq DNA聚合酶，RNasin RNase inhibitor，考马斯亮蓝G-250，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP)等试剂均为进口或国产分子生物学试剂或分析纯。
, http://www.100md.com
1.3 主要仪器
多导生理记录仪(2G66, NEC San-ei)，微量高速离心机(Centrifuge 5415C, Eppendorf)，724型可见分光光度计(上海牌)，荧光分光光度计(F-3000, HITACHI)，分光光度计(DU650, Beckman)，高速电动匀浆机(Powergen 125, Fisher Scientific)，PCR仪(Single BlockTM System, Ericomp)，双光源紫外透射灯箱(Ultra-Lum)，一次成相照相机(DS-34, Polaroid)，凝胶成像分析仪(Gel Doc 2000, Bio-Rad)
1.4 模型制备和动物分组
结扎大鼠左冠状动脉前降支所致急性心肌缺血模型的制备参见文献[2]。结扎后4 h时取血，迅速摘取心脏，剪取相应缺血心肌，用冷NS冲净血液后，液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
大鼠随机分成伪结扎组(开胸，左冠状动脉前降支下穿线，不结扎)、结扎组、Alo给药组(20 mg.kg-1，结扎前10min舌静脉注射给药)、Prop给药组(2mg.kg-1，结扎前10min舌静脉注射给药)等4组；每组动物6只。
1.5 Ⅱ导心电图观测(标准电压0.1 mV对应1.5 mm，走纸速度50 mm.s-1)
记录结扎前5 min、结扎后1 min、5 min、30 min和4 h的心电图，每个时间点不少于6个波形。测量ST段偏移平均值(
) (1.5 mm对应0.1 mV)、T波抬高值和病理性Q波出现数的百分比(NQ%)。
1.6 血清肌酸激酶(creatine kinase， CK)活性测定
, 百拇医药
新鲜血液4℃放置1 h后，离心(2 000 r.min-1) 10min，取上清10μl，用肌酸显色法测定血清CK活性。按下述公式计算血清CK活性：
CK(μmol.s-1.L-1)=(A测定管-A对照管)/A标准管×100/6
1.7 心肌组织蛋白质含量测定
将缺血心肌组织制备为100g.L-1的组织匀浆。用考马斯亮蓝法以BSA为标准蛋白，绘制标准曲线。将100g.L-1心肌组织匀浆稀释为10g.L-1，取100μl比色测定，并根据标准曲线计算蛋白质含量。
, http://www.100md.com
1.8 心肌组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定
以TEP为MDA标准品，用硫代巴比妥酸法测定荧光强度，绘制标准曲线。取100g.L-1心肌组织匀浆液100μl，在与标准曲线相同条件下反应，以空白管调零，测定样品荧光强度，并根据标准曲线计算心肌组织MDA含量。
1.9 心肌组织SOD活性测定
取10 g.L-1心肌组织匀浆液10μl，按试剂盒说明书操作，在550nm处比色。按下述公式计算SOD活性：
SOD活性(NU.ml-1)＝(A对照管-A测定管)/A对照管/0.5×稀释倍数
, 百拇医药
1.10 RT-PCR法检测Fas、CPP32、Bcl-2和Bax基因在心肌组织的表达量[3，4]
心肌组织总RNA提取按RNA提取试剂盒说明书操作。逆转录总RNA按M-MLV逆转录酶的说明书操作。70℃ 10 min灭活M-MLV逆转录酶后，用PCR水稀释至100 μl。取5 μl逆转录产物作为模板进行PCR扩增。扩增引物的序列见表1。PCR反应总体积为25μl：逆转录产物5μl，10 pmol的上游和下游引物各2μl，5mmol.L-1dNTP 1μl，10×反应缓冲液2.5μl，25mmol.L-1 MgCl21.5μl，Taq DNA聚合酶1U，PCR水10.75μl。PCR扩增程序：94℃ 1 min, 50℃ 1 min和72℃ 1 min，循环1次；94℃ 1 min, 55℃ 1 min和72℃ 1 min，循环35次；72℃延伸15 min。取PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳。
, 百拇医药
表1 RT-PCR寡核苷酸引物序列
Table 1 Sequence of oligonucleotide primers for RT-PCR Name of primer
Primer sequence
Product sizes(bp)
C-actin[5]
5′ TCA, TGA, AGT, GTG, ACA, TCG 3′
389
5′ AAA, CTG, CAC, GTG, TGT, AAA, C 3′
, 百拇医药 Fas[6]
5′ GAC, CCA, GAA, TAC, CAA, GTG, CA 3′
436
5′ TCT, GTT, CTG, CTG, TGT, CTT, GG 3′
CPP32[7]
5′ ACA,TGG, AAG, CGA, ATC, AAT, GGA,CTC 3′
687
5′ AAG,GAC, TCA, AAT, TCT, GTT, GCC,ACC 3′
Bcl-2[8]
, http://www.100md.com
5′ TCC, ATT, ATA, AGC, TGT, CAC, AG 3′
350
5′ GAA, GAG, TTC, CTC, CAC, CAC 3′
Bax[9]
5′ GCA, GAG, GAT, GAT, TGC, TGA, TG 3′
354
5′ CTC, AGC, CCA, TCT, TCT, TCC, AG 3′
按上述方法，对各实验组每只大鼠的缺血心肌组织进行实验。通过密度扫描及Quantity One软件分析各条带的强度，以C-actin的表达量为对照计算并比较各组Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量。
, 百拇医药
1.11 统计学方法
所有计量资料的均值及标准差表示为
±s，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。
2 结果
2.1 对Ⅱ导心电图的影响
结扎组大鼠左冠状动脉前降支结扎后，ST段立即抬高(P<0.001)，T波高耸(P<0.001)，持续时间长，5min后有缺血性心律失常的出现，4h可出现病理性Q波(P<0.001)。Alo给药组和Prop给药组大鼠的ST段抬高及T波高耸等变化幅度较结扎组大鼠显著降低(P<0.001)，且持续时间较短(除Alo给药组5min及Prop给药组1min时P<0.01外，其余P<0.001)，缺血性心律失常的出现减少，4h仅个别动物出现病理性Q波(P<0.001，心电图略)。
, http://www.100md.com
2.2 血清CK活性的变化
各组血清CK活性见表2。 结扎组的血清CK活性明显高于伪结扎组(P<0.05)；Alo给药组的血清CK活性明显降低，与结扎组相比差异有显著性(P<0.05)；Prop给药组的血清CK活性虽有下降，但与结扎组相比差异无显著性(P>0.05)。
2.3 缺血心肌组织中MDA含量和SOD活性的变化
各组缺血心肌组织的MDA含量和SOD活性见表2。结扎组缺血心肌组织的MDA含量和SOD活性明显高于伪结扎组(P<0.01)；Alo给药组和Prop给药组缺血心肌组织的MDA含量明显降低，与结扎组相比具有显著性差异(P<0.05)。两组的SOD活性也明显降低，与结扎组相比差异亦有显著性(P分别小于0.05和0.01)。
表2 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时血清CK活性、心肌组织MDA含量和SOD活性(±s)
, http://www.100md.com
Table 2 The serum CK activity, myocardial MDA content
and SOD activity in acute myocardial ischemia rats induced
by coronary occlusion (±s) Group
n
CK activity
(μmol.s-1.L-1)
υ(MDA content)
, http://www.100md.com
/nmol☆
SOD activity☆
(103 NU)
Sham
6
38.6±1.8
2.25±0.24
3.5±0.9
Ocl
6
41.1±1.3#
, http://www.100md.com
3.26±0.52##
5.0±0.7##
Alo
6
38.2±2.3*
2.54±0.42*
3.7±0.8*
Prop
6
39.1±2.7
2.58±0.60*
, 百拇医药
3.5±1.1**
Sham，sham-operation；Ocl，occlusion；Alo，aloperine；Alo，20 mg.kg-1, ip；Prop，2mg.kg-1, ip；# P<0.05, ## P<0.01, vs Sham；* P<0.05, ** P<0.01, vs Ocl; NU,nitrite unit；☆ per mg protein.2.4 缺血心肌组织中凋亡相关基因的表达变化
各组缺血心肌组织中C-actin、Fas、CPP32、Bcl-2及Bax RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1(各组其中1只大鼠的电泳结果，其余数据略)。
, 百拇医药
1,100 bp DNA Ladder; 2,C-actin; 3,Fas; 4,CPP32; 5,Bcl-2; 6,Bax; Sham:sham-operation; Ocl,occlusion; Alo:aloperine; Alo, 20 mg.kg-1, iv; Prop,propranolol; Prop,2 mg.kg-1, iv.
图1 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时RT-PCR产物的电泳分析
Figure 1 Electrophoresis analysis of RT-PCR products in acute myocardial ischemia rats induced by coronary occlusion
以C-actin为参照，用RT-PCR法检测各组凋亡相关基因Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量的变化。各组缺血心肌组织的Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量见表3。结扎组缺血心肌组织的Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达明显高于伪结扎组(P<0.001)，但两组之间的Bax的表达无显著性变化(P>0.05)；Alo给药组和Prop给药组缺血心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达明显低于结扎组(P<0.001)，但Bax的表达无显著性变化(P>0.05)。
, 百拇医药
表3 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时心肌组织Fas、CPP32、Bcl-2和Bax基因的表达(%,±s)
Table 3 The expression of Fas, CPP32, Bcl-2 and Bax genes in acute myocardial ischemia rats induced by coronary occlusion (%,±s) Group
n
Int. of Fas /
Int. of C-actin
Int. of CPP32 /
, http://www.100md.com
Int. of C-actin
Int. of Bcl-2 /
Int. of C-actin
Int. of Bax /
Int. of C-actin
Sham
6
4.1±3.6
2.9±1.8
2.6±1.8
62.3±18.6
, 百拇医药 Ocl
6
39.5±14.4###
22.5±4.2###
64.9±16.7###
66.3±23.6
Alo
6
8.2±3.4***
5.1±1.9***
8.4±1.3***
, 百拇医药
71.3±11.2
Prop
6
8.6±14.3***
2.5±1.1***
6.1±6.4***
67.1±16.1
Sham，sham-operation；Ocl，occlusion；Alo，aloperine； Alo, 20mg.kg-1，iv；Prop，propranolol; Prop，2mg.kg-1, iv；Int.，intensity；### P<0.001, vs Sham；*** P<0.001, vs Ocl.
, http://www.100md.com
3 讨论
通过对本实验中建立的急性心肌缺血和心肌梗死模型的检测，心电图出现的缺血性T波、损伤型ST段和病理性Q波，以及血清CK活性的升高均能正确地反映出本模型的建立是成功的，通过该模型获得的数据是可靠、客观的。本实验结果表明，结扎大鼠左冠状动脉前降支所致的急性心肌缺血可以导致Fas、CPP32和Bcl-2等凋亡相关基因mRNA表达量的增高，但Bax的表达量未见明显变化。Alo和Prop的作用不仅改善了急性心肌缺血的症状，同时对凋亡相关基因的表达亦有影响。结扎前预防性给予Alo或Prop，心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2等凋亡相关基因的mRNA表达量下降，而Bax的表达量也没有明显变化。
目前已知，Fas是细胞凋亡过程中的重要信号传递分子，CPP32在Fas介导的细胞凋亡中起着非常重要的作用[10]。在心肌细胞凋亡过程中，促细胞凋亡因子Fas、CPP32对缺血性刺激相当敏感；它们的过度表达有可能在心肌细胞凋亡途径的进一步发展中，充当了启动细胞凋亡的关键信号，加速急性心肌缺血产生的损伤。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族也是一类重要参与因子，如抑制细胞凋亡的Bcl-2，促进细胞凋亡的Bax[11]。一般情况下，在促细胞凋亡途径被激活时，相应的抑制细胞凋亡基因的表达量也会增加。从我们的实验结果来看，Bcl-2表达量的增加，也支持这一规律。Bax作为促细胞凋亡因子在本实验中的表达量变化并不明显，心肌组织中的Bax是否有其特殊作用，在心肌细胞凋亡过程中扮演何种角色，有待今后进一步实验。综上所述，凋亡相关基因表达量的变化提示大鼠的急性心肌缺血性损伤与Fas参与、CPP32介导的心肌细胞凋亡有关，也与Bcl-2家族参与的心肌细胞凋亡有关。
, 百拇医药
Alo和Prop通过改善心肌缺血，影响凋亡相关基因的表达，减轻了心肌细胞的损伤。其机制可能为减少氧自由基的产生和氧自由基对凋亡相关基因表达的诱导。详细机制及它们对凋亡相关基因的表达是否具有直接作用，有待进一步研究。
由于细胞凋亡动态发展的特征及多种细胞凋亡因子的影响，细胞凋亡的双刃剑作用在很大程度上取决于它发生及持续的时间。因此，从细胞凋亡及凋亡相关因子的角度，不仅为急性心肌缺血损伤机制的认识提供新的思路，而且研究心肌缺血后如何减轻心肌缺血所造成的伤害，恢复心脏功能，还可能成为预防、诊断和治疗急性心肌梗死的新策略。
*卫生部科研基金(98-1-248)资助课题；
参考文献
1 Olivetti G, Quaini F, Sala R, et al. Acute myocardial infarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart. J Mol Cell Cardiol, 1996, 28:2005-2016
, 百拇医药
2 徐叔云，亢如濂，陈 修主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.921-944
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory manual. 2nd ed, New york: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:7.3-7.25
4 Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al. PCR protocols: A guide to methods and applications. San Diego: Academic Press, 1990:70-75
5 Mayer Y, Czosnek H, Zeelon PE, et al. Expression of the genes coding for the skeletal muscle and cardiac actins in the heart. Nucleic Acids Research, 1984, 12:1087-1100
, http://www.100md.com
6 Tanaka M, Ito H, Adachi S, et al. Hypoxia induces apoptosis with enhanced expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Circ Res, 1994, 75:426-433
7 Flaws JA, Kugu K, Trbovich AM, et al. Interleukin-1β-converting enzyme-related proteases (IRPs) and Mammalian cell death: dissociation of IRP-induced oligonucleosomal endonuclease activity from morphological apoptosis in granulosa cells of the ovarian follicle. Endocrinology, 1995, 136: 5042-5053
, 百拇医药
8 Sato T, Irie S, Krajewski S, et al. Cloning and sequencing of a cDNA encoding the rat bcl-2 protein. Gene, 1994, 140:291-292
9 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death. Cell, 1993, 74:609-619
10 Los M, Craen MV, Penning LC, et al. Requirement of an ICE/CED-3 protease for Fas/APO-1-mediated apoptosis. Nature, 1995, 375:81-83
11 Kroemer G. The proto-oncognene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nature Medicine, 1997, 3:614-620
(1999-08-25收稿), http://www.100md.com
单位：北京医科大学药理学系，北京 100083
关键词：心肌缺血；病理生理学；普萘洛尔；药理学；脱噬作用；药物作用；细胞凋亡因子☆
北京医科大学学报990606 摘 要 目的：研究大鼠冠状动脉结扎时心肌组织中凋亡相关基因的表达状况与急性心肌缺血的关系。方法：结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型。描记Ⅱ导心电图；检测血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性、心肌组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性；RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas、CPP32、Bcl-2和Bax在心肌组织的相对表达量。观察伪结扎组、结扎组、苦豆碱(aloperine, Alo)给药组(20 mg.kg-1)、普萘洛尔(propranolol, Prop)给药组(2 mg.kg-1)对上述各指标的影响。采用单因素方差分析(One Way ANOVA)对结果进行统计处理。结果：结扎大鼠左冠状动脉前降支可导致心电图明显的缺血性改变及血清CK活性显著升高；心肌组织的MDA含量和SOD活性显著增加；缺血心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达显著增加(P<0.001)，Bax变化不明显(P<0.05)。Alo和Prop能明显缓解心电图的缺血性改变并降低血清CK活性；减少心肌组织的MDA含量和SOD活性；降低心肌组织Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达(P<0.001)，对Bax影响不明显(P<0.05)。结论：结扎大鼠左冠状动脉前降支所致的急性心肌缺血性损伤与Fas参与、CPP32介导的心肌细胞凋亡有关，也与Bcl-2家族参与的心肌细胞凋亡有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R542.2-332
Effects on apoptosis related genes expression
in myocardium following coronary artery occlusion in the rat
CAO Li-Zhen#, TAN Huan-Ran
(#Department of Pharmacology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Acute myocardial ischemia physiopathol Propranolol/pharmacol Apoptosis/drug off
, 百拇医药
Apoptosis related factor☆
ABSTRACT Objective: To study the expression of some apoptosis related genes in AMI and the influences of aloperine and propranolol. The relationship between apoptosis related genes and AMI were also investigated. Methods: AMI rat model was induced by ligation of the anterior branch of the left coronary artery. All animals were divided into four groups: sham-operation group, occlusion group, aloperine group (20 mg.kg-1) and propranolol group (2mg.kg-1). ECG lead Ⅱ was recorded. The level of serum creatine kinase (CK) activity, myocardial malondialdehyde (MDA) content and myocardial superoxide dismutase (SOD) activity were also determined. The myocardial expression of apoptosis related genes: Fas, CPP32, Bcl-2 and Bax were detected with RT-PCR. Statistical significance in multiple comparisons was determined by One Way ANOVA. Results: Coronary occlusion of the rats led to significent ischemic changes of ECG, and increased the level of serum CK activity, myocardial MDA content and SOD activity. The myocardial expression of Fas, CPP32 and Bcl-2 were increased by coronary occlusion. But had no significance was detected in Bax expression. Aloperine and propranolol attenuated the ischemic changes of ECG, reduced the level of serum CK activity, myocardial MDA content and SOD activity. Both drugs also reduced the myocardial expression of Fas, CPP32 and Bcl-2, but no significance with Bax expression. Conclusion: The acute myocardial ischemic injury induced by ligation of the anterior branch of the left coronary artery may have relationship with apoptosis related genes: Fas, CPP32 and Bcl-2 family.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:501-505)
直到目前，急性心肌缺血及心肌梗死等缺血性心脏病的发病机制仍没有完全研究清楚。近年来发现，急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有心肌细胞凋亡现象的存在[1]，对心肌缺血和心肌梗死的发病机制又提出了一个新的课题，特别是它与心肌细胞凋亡的关系使我们进入了一个新的研究领域。苦豆碱(aloperine, Alo)是由豆科槐属植物苦豆子(sophora alopecuroides L.)中提取的主要生物碱之一，研究表明它有对抗多种实验性心律失常及心肌损伤的作用。普萘洛尔(propranolol, Prop)是临床应用最早的一种β受体阻滞剂，主要用于治疗高血压、缺血性心脏病、室上性心动过速等。我们将上述两个药物作为本实验中的抗心肌缺血药，进一步研究在其作用下，心肌凋亡相关基因表达的状况及机制，探讨凋亡相关基因与急性心肌缺血的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 动物
健康Wistar大鼠(动物合格证号：01-3056)，雄性，体重350～400g，由北京医科大学动物部提供。
1.2 药品和试剂
Alo (原料药，宁夏盐池制药厂)，Prop (原料药，东北制药总厂)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，9701 RNA提取试剂盒购自北京牛牛基因技术有限公司，心肌肌动蛋白(C-actin)、Fas、CPP32、Bcl-2和Bax引物由上海生工生物工程有限公司合成，M-MLV反转录酶，随机引物，100 bp DNA分子质量标准，Taq DNA聚合酶，RNasin RNase inhibitor，考马斯亮蓝G-250，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP)等试剂均为进口或国产分子生物学试剂或分析纯。
, http://www.100md.com
1.3 主要仪器
多导生理记录仪(2G66, NEC San-ei)，微量高速离心机(Centrifuge 5415C, Eppendorf)，724型可见分光光度计(上海牌)，荧光分光光度计(F-3000, HITACHI)，分光光度计(DU650, Beckman)，高速电动匀浆机(Powergen 125, Fisher Scientific)，PCR仪(Single BlockTM System, Ericomp)，双光源紫外透射灯箱(Ultra-Lum)，一次成相照相机(DS-34, Polaroid)，凝胶成像分析仪(Gel Doc 2000, Bio-Rad)
1.4 模型制备和动物分组
结扎大鼠左冠状动脉前降支所致急性心肌缺血模型的制备参见文献[2]。结扎后4 h时取血，迅速摘取心脏，剪取相应缺血心肌，用冷NS冲净血液后，液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
大鼠随机分成伪结扎组(开胸，左冠状动脉前降支下穿线，不结扎)、结扎组、Alo给药组(20 mg.kg-1，结扎前10min舌静脉注射给药)、Prop给药组(2mg.kg-1，结扎前10min舌静脉注射给药)等4组；每组动物6只。
1.5 Ⅱ导心电图观测(标准电压0.1 mV对应1.5 mm，走纸速度50 mm.s-1)
记录结扎前5 min、结扎后1 min、5 min、30 min和4 h的心电图，每个时间点不少于6个波形。测量ST段偏移平均值(
) (1.5 mm对应0.1 mV)、T波抬高值和病理性Q波出现数的百分比(NQ%)。1.6 血清肌酸激酶(creatine kinase， CK)活性测定
, 百拇医药
新鲜血液4℃放置1 h后，离心(2 000 r.min-1) 10min，取上清10μl，用肌酸显色法测定血清CK活性。按下述公式计算血清CK活性：
CK(μmol.s-1.L-1)=(A测定管-A对照管)/A标准管×100/6
1.7 心肌组织蛋白质含量测定
将缺血心肌组织制备为100g.L-1的组织匀浆。用考马斯亮蓝法以BSA为标准蛋白，绘制标准曲线。将100g.L-1心肌组织匀浆稀释为10g.L-1，取100μl比色测定，并根据标准曲线计算蛋白质含量。
, http://www.100md.com
1.8 心肌组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定
以TEP为MDA标准品，用硫代巴比妥酸法测定荧光强度，绘制标准曲线。取100g.L-1心肌组织匀浆液100μl，在与标准曲线相同条件下反应，以空白管调零，测定样品荧光强度，并根据标准曲线计算心肌组织MDA含量。
1.9 心肌组织SOD活性测定
取10 g.L-1心肌组织匀浆液10μl，按试剂盒说明书操作，在550nm处比色。按下述公式计算SOD活性：
SOD活性(NU.ml-1)＝(A对照管-A测定管)/A对照管/0.5×稀释倍数
, 百拇医药
1.10 RT-PCR法检测Fas、CPP32、Bcl-2和Bax基因在心肌组织的表达量[3，4]
心肌组织总RNA提取按RNA提取试剂盒说明书操作。逆转录总RNA按M-MLV逆转录酶的说明书操作。70℃ 10 min灭活M-MLV逆转录酶后，用PCR水稀释至100 μl。取5 μl逆转录产物作为模板进行PCR扩增。扩增引物的序列见表1。PCR反应总体积为25μl：逆转录产物5μl，10 pmol的上游和下游引物各2μl，5mmol.L-1dNTP 1μl，10×反应缓冲液2.5μl，25mmol.L-1 MgCl21.5μl，Taq DNA聚合酶1U，PCR水10.75μl。PCR扩增程序：94℃ 1 min, 50℃ 1 min和72℃ 1 min，循环1次；94℃ 1 min, 55℃ 1 min和72℃ 1 min，循环35次；72℃延伸15 min。取PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳。
, 百拇医药
表1 RT-PCR寡核苷酸引物序列
Table 1 Sequence of oligonucleotide primers for RT-PCR Name of primer
Primer sequence
Product sizes(bp)
C-actin[5]
5′ TCA, TGA, AGT, GTG, ACA, TCG 3′
389
5′ AAA, CTG, CAC, GTG, TGT, AAA, C 3′
, 百拇医药 Fas[6]
5′ GAC, CCA, GAA, TAC, CAA, GTG, CA 3′
436
5′ TCT, GTT, CTG, CTG, TGT, CTT, GG 3′
CPP32[7]
5′ ACA,TGG, AAG, CGA, ATC, AAT, GGA,CTC 3′
687
5′ AAG,GAC, TCA, AAT, TCT, GTT, GCC,ACC 3′
Bcl-2[8]
, http://www.100md.com
5′ TCC, ATT, ATA, AGC, TGT, CAC, AG 3′
350
5′ GAA, GAG, TTC, CTC, CAC, CAC 3′
Bax[9]
5′ GCA, GAG, GAT, GAT, TGC, TGA, TG 3′
354
5′ CTC, AGC, CCA, TCT, TCT, TCC, AG 3′
按上述方法，对各实验组每只大鼠的缺血心肌组织进行实验。通过密度扫描及Quantity One软件分析各条带的强度，以C-actin的表达量为对照计算并比较各组Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量。
, 百拇医药
1.11 统计学方法
所有计量资料的均值及标准差表示为
±s，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。2 结果
2.1 对Ⅱ导心电图的影响
结扎组大鼠左冠状动脉前降支结扎后，ST段立即抬高(P<0.001)，T波高耸(P<0.001)，持续时间长，5min后有缺血性心律失常的出现，4h可出现病理性Q波(P<0.001)。Alo给药组和Prop给药组大鼠的ST段抬高及T波高耸等变化幅度较结扎组大鼠显著降低(P<0.001)，且持续时间较短(除Alo给药组5min及Prop给药组1min时P<0.01外，其余P<0.001)，缺血性心律失常的出现减少，4h仅个别动物出现病理性Q波(P<0.001，心电图略)。
, http://www.100md.com
2.2 血清CK活性的变化
各组血清CK活性见表2。 结扎组的血清CK活性明显高于伪结扎组(P<0.05)；Alo给药组的血清CK活性明显降低，与结扎组相比差异有显著性(P<0.05)；Prop给药组的血清CK活性虽有下降，但与结扎组相比差异无显著性(P>0.05)。
2.3 缺血心肌组织中MDA含量和SOD活性的变化
各组缺血心肌组织的MDA含量和SOD活性见表2。结扎组缺血心肌组织的MDA含量和SOD活性明显高于伪结扎组(P<0.01)；Alo给药组和Prop给药组缺血心肌组织的MDA含量明显降低，与结扎组相比具有显著性差异(P<0.05)。两组的SOD活性也明显降低，与结扎组相比差异亦有显著性(P分别小于0.05和0.01)。
表2 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时血清CK活性、心肌组织MDA含量和SOD活性(
±s), http://www.100md.com
Table 2 The serum CK activity, myocardial MDA content
and SOD activity in acute myocardial ischemia rats induced
by coronary occlusion (
±s) Groupn
CK activity
(μmol.s-1.L-1)
υ(MDA content)
, http://www.100md.com
/nmol☆
SOD activity☆
(103 NU)
Sham
6
38.6±1.8
2.25±0.24
3.5±0.9
Ocl
6
41.1±1.3#
, http://www.100md.com
3.26±0.52##
5.0±0.7##
Alo
6
38.2±2.3*
2.54±0.42*
3.7±0.8*
Prop
6
39.1±2.7
2.58±0.60*
, 百拇医药
3.5±1.1**
Sham，sham-operation；Ocl，occlusion；Alo，aloperine；Alo，20 mg.kg-1, ip；Prop，2mg.kg-1, ip；# P<0.05, ## P<0.01, vs Sham；* P<0.05, ** P<0.01, vs Ocl; NU,nitrite unit；☆ per mg protein.2.4 缺血心肌组织中凋亡相关基因的表达变化
各组缺血心肌组织中C-actin、Fas、CPP32、Bcl-2及Bax RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1(各组其中1只大鼠的电泳结果，其余数据略)。
, 百拇医药
1,100 bp DNA Ladder; 2,C-actin; 3,Fas; 4,CPP32; 5,Bcl-2; 6,Bax; Sham:sham-operation; Ocl,occlusion; Alo:aloperine; Alo, 20 mg.kg-1, iv; Prop,propranolol; Prop,2 mg.kg-1, iv.
图1 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时RT-PCR产物的电泳分析
Figure 1 Electrophoresis analysis of RT-PCR products in acute myocardial ischemia rats induced by coronary occlusion
以C-actin为参照，用RT-PCR法检测各组凋亡相关基因Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量的变化。各组缺血心肌组织的Fas、CPP32、Bcl-2及Bax的相对表达量见表3。结扎组缺血心肌组织的Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达明显高于伪结扎组(P<0.001)，但两组之间的Bax的表达无显著性变化(P>0.05)；Alo给药组和Prop给药组缺血心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2基因的表达明显低于结扎组(P<0.001)，但Bax的表达无显著性变化(P>0.05)。
, 百拇医药
表3 结扎大鼠冠状动脉所致急性心肌缺血时心肌组织Fas、CPP32、Bcl-2和Bax基因的表达(%,
±s)Table 3 The expression of Fas, CPP32, Bcl-2 and Bax genes in acute myocardial ischemia rats induced by coronary occlusion (%,
±s) Groupn
Int. of Fas /
Int. of C-actin
Int. of CPP32 /
, http://www.100md.com
Int. of C-actin
Int. of Bcl-2 /
Int. of C-actin
Int. of Bax /
Int. of C-actin
Sham
6
4.1±3.6
2.9±1.8
2.6±1.8
62.3±18.6
, 百拇医药 Ocl
6
39.5±14.4###
22.5±4.2###
64.9±16.7###
66.3±23.6
Alo
6
8.2±3.4***
5.1±1.9***
8.4±1.3***
, 百拇医药
71.3±11.2
Prop
6
8.6±14.3***
2.5±1.1***
6.1±6.4***
67.1±16.1
Sham，sham-operation；Ocl，occlusion；Alo，aloperine； Alo, 20mg.kg-1，iv；Prop，propranolol; Prop，2mg.kg-1, iv；Int.，intensity；### P<0.001, vs Sham；*** P<0.001, vs Ocl.
, http://www.100md.com
3 讨论
通过对本实验中建立的急性心肌缺血和心肌梗死模型的检测，心电图出现的缺血性T波、损伤型ST段和病理性Q波，以及血清CK活性的升高均能正确地反映出本模型的建立是成功的，通过该模型获得的数据是可靠、客观的。本实验结果表明，结扎大鼠左冠状动脉前降支所致的急性心肌缺血可以导致Fas、CPP32和Bcl-2等凋亡相关基因mRNA表达量的增高，但Bax的表达量未见明显变化。Alo和Prop的作用不仅改善了急性心肌缺血的症状，同时对凋亡相关基因的表达亦有影响。结扎前预防性给予Alo或Prop，心肌组织中Fas、CPP32和Bcl-2等凋亡相关基因的mRNA表达量下降，而Bax的表达量也没有明显变化。
目前已知，Fas是细胞凋亡过程中的重要信号传递分子，CPP32在Fas介导的细胞凋亡中起着非常重要的作用[10]。在心肌细胞凋亡过程中，促细胞凋亡因子Fas、CPP32对缺血性刺激相当敏感；它们的过度表达有可能在心肌细胞凋亡途径的进一步发展中，充当了启动细胞凋亡的关键信号，加速急性心肌缺血产生的损伤。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族也是一类重要参与因子，如抑制细胞凋亡的Bcl-2，促进细胞凋亡的Bax[11]。一般情况下，在促细胞凋亡途径被激活时，相应的抑制细胞凋亡基因的表达量也会增加。从我们的实验结果来看，Bcl-2表达量的增加，也支持这一规律。Bax作为促细胞凋亡因子在本实验中的表达量变化并不明显，心肌组织中的Bax是否有其特殊作用，在心肌细胞凋亡过程中扮演何种角色，有待今后进一步实验。综上所述，凋亡相关基因表达量的变化提示大鼠的急性心肌缺血性损伤与Fas参与、CPP32介导的心肌细胞凋亡有关，也与Bcl-2家族参与的心肌细胞凋亡有关。
, 百拇医药
Alo和Prop通过改善心肌缺血，影响凋亡相关基因的表达，减轻了心肌细胞的损伤。其机制可能为减少氧自由基的产生和氧自由基对凋亡相关基因表达的诱导。详细机制及它们对凋亡相关基因的表达是否具有直接作用，有待进一步研究。
由于细胞凋亡动态发展的特征及多种细胞凋亡因子的影响，细胞凋亡的双刃剑作用在很大程度上取决于它发生及持续的时间。因此，从细胞凋亡及凋亡相关因子的角度，不仅为急性心肌缺血损伤机制的认识提供新的思路，而且研究心肌缺血后如何减轻心肌缺血所造成的伤害，恢复心脏功能，还可能成为预防、诊断和治疗急性心肌梗死的新策略。
*卫生部科研基金(98-1-248)资助课题；
参考文献
1 Olivetti G, Quaini F, Sala R, et al. Acute myocardial infarction in humans is associated with activation of programmed myocyte cell death in the surviving portion of the heart. J Mol Cell Cardiol, 1996, 28:2005-2016
, 百拇医药
2 徐叔云，亢如濂，陈 修主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994.921-944
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory manual. 2nd ed, New york: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:7.3-7.25
4 Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al. PCR protocols: A guide to methods and applications. San Diego: Academic Press, 1990:70-75
5 Mayer Y, Czosnek H, Zeelon PE, et al. Expression of the genes coding for the skeletal muscle and cardiac actins in the heart. Nucleic Acids Research, 1984, 12:1087-1100
, http://www.100md.com
6 Tanaka M, Ito H, Adachi S, et al. Hypoxia induces apoptosis with enhanced expression of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Circ Res, 1994, 75:426-433
7 Flaws JA, Kugu K, Trbovich AM, et al. Interleukin-1β-converting enzyme-related proteases (IRPs) and Mammalian cell death: dissociation of IRP-induced oligonucleosomal endonuclease activity from morphological apoptosis in granulosa cells of the ovarian follicle. Endocrinology, 1995, 136: 5042-5053
, 百拇医药
8 Sato T, Irie S, Krajewski S, et al. Cloning and sequencing of a cDNA encoding the rat bcl-2 protein. Gene, 1994, 140:291-292
9 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death. Cell, 1993, 74:609-619
10 Los M, Craen MV, Penning LC, et al. Requirement of an ICE/CED-3 protease for Fas/APO-1-mediated apoptosis. Nature, 1995, 375:81-83
11 Kroemer G. The proto-oncognene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nature Medicine, 1997, 3:614-620
(1999-08-25收稿), http://www.100md.com