心血管分子生物学的研究——北京医科大学心血管基础研究所工作进展
作者：汤健 陈光慧 周爱儒 马大龙
单位：汤健 陈光慧 周爱儒 北京医科大学心血管基础研究所；马大龙 免疫学系，北京 100083
关键词：基因转移；基因疗法；基因；克隆；分子；心血管疾病；治疗
北京医科大学学报990601 摘 要 5年来北京医科大学心血管基础研究所在国家生物高技术计划的支持下克隆了HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR等6种新基因，并对其功能进行较系统的研究，发展基因缝线，病毒脂质体，电脉冲等几种新的体内转基因的方法，进行肌肉和体内基因转移，治疗实验性高血压、高胆固醇血症和梗塞性血管病等疾病，发展了多种基因药物的研究。
中国图书资料分类法分类号 Q343.1
The studies of cardiovascular molecular biology
, http://www.100md.com
TANG Jian＃, CHEN Guang-Hui(CHEN Kuang-Hueih), ZHOU Ai-Ru, MA Da-Long
(＃The Institute of Cardiovascular Basic Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Gene transfer Gene therapy Genes Clonal, molecular Cardiovascular diseases/ther
ABSTRACT For the past 5 years, we have cloned six novel genes such as HRG-1, HCY-2, hhLIM, and TFAR-19 etc. and also studied the functions of these genes systemically. All this was done under the support of National Bio High Tech Project. For gene transfer, we have developed several novel gene delivery modalities for transfering genes into skeletal muscles and certain tissues, such as gene suture, gene balloon, viral-liposome complex (adenosome), electro-accupuncture, and electric pulse etc. and used them to treat experimental hypertension, hypercholesterolemia, and occlusive vascular diseases. Besides, we have started the studies of several gene medicines and got some promising results.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:481-484)
近5年来，我们所主持和承担了国家重大基础发展规划(973)，国家基础发展计划(攀登计划)和国家生物高技术发展计划(863)等多项心血管分子生物学的任务。主要开展了以下几方面的研究，并取得了初步成果。
1 新基因的克隆
5年来，我们建立心肌、血管平滑肌细胞、内皮细胞、胚胎心和脑的cDNA文库，应用差异显示，递减杂交、DNA Chips技术和方法，克隆出HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR-19、UCK等一系列新基因[1～5]。
1.1 HRG-1基因
HRG-1基因是应用自发性高血压大鼠和正常(WKY)大鼠培养的平滑肌细胞，通过差异筛选，克隆出的一个与细胞增殖相关的基因，其全长为4.16 kb，可编码出661个氨基酸。以大鼠HRG-1 为探针，从人的肾脏cDNA 文库中，亦克隆出人的HRG-1 全长cDNA ，它与大鼠有91.8%的同源性，定位1号染色体上(1p36.3)。应用Northern blot 和免疫组织化学的方法证明，人和大鼠HRG-1广泛分布在心、脑、肾、肺、肝等不同组织中。应用荧光融合蛋白的方法发现，它可能是一种膜蛋白，主要存在于细胞膜和胞浆中。这种蛋白质可为蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)磷酸化，抑制raf和丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的活性，因此它可以抑制一些细胞的增殖，是一种与细胞增殖相关的新的细胞内信息传递分子。
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HRG-1在一些心血管病和肿瘤的发病中可能具有重要意义。在自发性高血压大鼠平滑肌细胞、内皮损伤再狭窄和去ApoE基因的动脉粥样硬化小鼠的动脉壁内低表达；转HRG-1基因或蛋白质可以抑制血管平滑肌细胞的增殖。在一些肿瘤细胞(如鳞状上皮癌，髓性白血病，卵巢癌等)细胞株，HRG-1基因低表达。应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)证明，在一些肿瘤细胞株HRG-1基因丢失和移位，其丢失率可以达30%以上。给U937和食管癌细胞株转移HRG-1基因可以抑制癌细胞的生长和集落形成[1，3]。
1.2 hhLIM基因
hhLIM基因是应用胚胎心脏和去胎心的胚胎经三元递减所克隆的一个与心脏生长相关的新基因，其人cDNA全长为1006 bp，可编码194个氨基酸。它与LIM家属基因(RP-1,SmLIM等)有高度同源性，都是一类富含Cysteine的锌指结构的蛋白。但是与其它LIM不同，它主要分布在心肌细胞，很少在其它细胞、组织和器官中表达，因此它可能是一种特异性的心肌表达的基因。
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hhLIM可能与心肌生长和心肌肥厚有密切的关系。在自发性高血压大鼠、异丙肾上腺素和主动脉夹闭所致的心肌肥厚的标本中，hhLIM高表达；应用内皮素或血管紧张素2可促进hhLIM的表达，并可诱导心肌生长；给培养的心肌细胞导入hhLIM，可以促进心肌3H-亮氨酸参入和蛋白质的合成，促进心肌细胞的生长。
1.3 HCY-2基因
HCY-2是通过半胱氨酸/同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞，应用差异筛选所获得的一种新的基因，其cDNA全长为2 014 bp ，可编码 142个氨基酸。应用Northern blot和免疫组织化学证明，HCY-2广泛分布在脑、肾、心、肺、肝等不同的组织器官中。氨基酸序列分析，它可能具有两个活性基团(3～30和60～90氨基酸)，与体内许多与细胞凋亡相关的丝/苏氨酸，蛋白激酶(如细胞凋亡蛋白，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)诱导蛋白等)有高度同源性。给培养的平滑肌细胞导入HCY-2基因可以引起细胞凋亡。给鸡胚导入HCY-2基因可以引起神经管和心脏发育畸形[2，6]。
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此外，我们尚与卫生部分子免疫重点实验室合作克隆了两个与细胞凋亡相关的基因——TFAR-15和TFAR-19，和一个新的细胞趋化因子——UCK。其中UCK具有多种变异体，它可以趋化单核细胞、淋巴细胞和多形核粒细胞，促进造血干细胞和成肌母细胞的增殖[5，7]。
2 新的基因转移体系
基因转移是研究基因功能，实现基因治疗的关键。目前国际上多采用病毒介导和非病毒介导的两类基因转移方法，前者基因转移效率高，但毒副作用大；后者毒副作用小，但基因转移效率低。近年来我们发展了以下几种新的基因转移体系[6，8～15]。
2.1 受体介导的基因转移
我们与上海市肿瘤所合作，分别应用内皮素A型受体阻断剂(BQ123)和B型受体阻断剂(BQ3020)，通过多聚赖氨酸与基因偶联，形成受体阻断剂与DNA的复合体。应用这种受体介导的复合体，直接转染血管内皮细胞和平滑肌细胞，可以明显提高基因转移效率60%～80%，并具有明显的靶向性。BQ123-DNA复合体可以通过A型受体，特异性转移至血管平滑肌细胞；BQ3020-DNA复合体可以通过B型受体，特异性转染内皮细胞[16，17]。
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2.2 病毒脂质体
由于腺病毒载体虽具有高度的转染性，但副作用大；而脂质体虽然转染效率低，却比较安全。我们应用腺病毒包被蛋白的单克隆抗体，分析了腺病毒不同包被蛋白在转染中的作用，发现腺病毒的fiber蛋白在转染中起着关键作用。因此应用蛋白质工程的方法，重组和纯化fiber蛋白质，并镶嵌在双层脂质体膜上，形成fiber蛋白脂质体，应用这种病毒脂质体(adenosome)转染平滑肌细胞，其转染效率可以从2%提高到30%～40%以上[14]。
2.3 基因缝线
1990年美国Wolff发现给肌肉直接注射裸DNA，可以进入肌细胞，表达出相应蛋白质，但转移效率低，难以达到实际应用效果。我们将手术缝线浸泡于富含阳离子的多聚赖氨酸-或明胶溶液中，吹干后带负电荷的DNA可粘附在缝线上，进行肌肉缝合。这样既可以促进肌肉的再生，提高肌肉内转基因的效率，又可以保持基因在肌肉局部，防止基因的流失，延长基因转移的时间，达到体内转基因治疗疾病的目的[15]。
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2.4 电针介导的基因转移
电针介导的基因转移是在电渗透和电打孔转移技术的基础上发展起来的一种新的体内基因转移的方法。这种方法是将重组的裸DNA，粘附在针灸针上，插入肌肉内，通过脉冲方波电刺激，从而实现基因转移。亦可在肌肉内先注入重组DNA，再应用表面电极或插入肌肉局部的电极，予以电刺激。其电压强度为80～200V/cm，波宽为20～40ms，频率为1～4次。其基因转移效率比直接肌肉注射法提高了几倍至几百倍，是一种较为理想的基因转移方法。它不仅简便，易行，经济实用，而且安全、有效，可以反复应用。此外，可以实行多点、多次电脉冲基因转移，不仅可以根据个体需要，调整基因导入的用量，还可以同时携带几种不同的基因，实现多种基因的综合转移[13]。
最近，我们还研制了一种高通量多基因的基因转移体系，应用电脉冲可以同时进行几百个基因的转移，进行大规模基因功能的筛选。
此外，我们实验室还创建了基因支架(stent)基因球束导管等血管内基因转移的方法。
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3 基因药物[18]
基因药物亦称DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，直接转移至人体的细胞，表达出具有治疗意义的多肽和蛋白质，而达到治疗目的的一种新的方法。它与传统的蛋白质工程和合成类药物不同，它不需要大规模工厂和设备，不必进行蛋白质合成、分离和纯化；而且一次给药，可以长期有效。基因药物被誉为医药工业的第四次革命，它是对传统药物的一个巨大的挑战，是国际生物高技术和医药产业的一个方向。近5年来我们实验室进行了以下几个方面的研究和探索。
3.1 分子搭桥技术
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种高效特异性血管生长因子，它可以促进血管的生长。我们重组了VEGF真核表达载体(pcD2/VEGF)，通过基因缝线或电脉冲基因转移，导入梗塞血管周围的肌肉内，证明它可以在局部表达出VEGF，促进梗塞部位血管的生长，形成大量侧支循环，治疗外周梗塞性血管病，并已申报临床试验。通过局部注射，亦可以治疗实验性心肌梗死和脑梗死[19]。
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3.2 抗高血压的基因药物
心钠素、降钙素基因相关肽，肾上腺髓质降压素和激肽释放酶在高血压的发生中起着十分重要的作用。但是这些生物活性多肽在体内极易降解，必须持续大量给药才能有效，因此限制了临床的应用。我们构建了心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素基因的真核表达载体，通过基因缝线或电脉冲介导的基因转移方法，导入高血压大鼠的股四头肌内，证明可以长期持续表达出相应的多肽，降低自发性高血压大鼠、肾性高血压大鼠和L-NNA高血压大鼠的血压，并产生明显的利钠、利尿效果。一次注射，其疗效可以持续1～3个月以上[15，20，21]。
3.3 抗动脉硬化的基因药物
低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDL-R)基因的缺陷是动脉粥样硬化的一个重要因素，我们构建了LDL-R的重组腺病毒辅助病毒的载体，通过腺病毒脂质体导入肝脏，可以明显降低血浆LDL的水平，增加HDL/LDL的比例，降低血浆甘油三脂的水平。这种方法不必切除肝脏，分离肝细胞，较应用逆转录病毒载体携带LDL-R治疗实验性高胆固醇血症经济、实用、简便、易行[14，22]。
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近年来提出动脉粥样硬化是一种慢性炎症。我们构建了IL-10和IL-1ra真核表达载体，通过局部基因转移，导入实验性动脉硬化的小鼠(缺ApoE基因小鼠)，初步证明它们具有抗炎作用，可以延缓动脉粥样硬化的进展。导入一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的基因亦有同样的效果。
3.4 治疗肾功能衰竭的基因药物
促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是治疗肾功能衰竭贫血的一种有效蛋白质，但必须每周注射才有效。我们重组了EPO基因的真核表达载体，通过电脉冲转移至肌肉内，可以长期表达出EPO，升高血红素和红细胞。应用这种方法，可以有效治疗肾功能衰竭大鼠的贫血，明显改善肾功能，延长肾功能衰竭的生存率。给猴体注射亦有效。一次基因转移，可以长期有效，其疗效可以持续2～3个月以上。
3.5 治疗糖尿病的基因药物
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胰岛素是治疗糖尿病的有效药物，但必须每天注射才有效。我们研究所和北京大学合作，构建了胰岛素基因的真核表达载体，应用电脉冲方法导入实验性糖尿病的大鼠，初步证明了它亦可以明显降低血糖，治疗糖尿病，一次基因转移可以长期有效。
此外，我们还构建了肥胖基因(leptin)的真核表达载体，导入食饵性肥胖的大鼠的肌肉内，初步发现它可以明显减轻体重，增加代谢。
3.6 抗肿瘤的基因药物
纤维细胞因子和血管生长抑制因子具有抗肿瘤的作用。我们构建了α干扰素(interferon-α， IFN-α)、白细胞介素-2和血管内皮生长抑制因子(endostatin)基因的真核表达载体，通过电脉冲，给罹患有肝癌、肉瘤和腹水瘤的小鼠进行肌肉内基因转移，证明可以明显抑制肿瘤的生长，延长肿瘤和肉瘤小鼠的生存时间。转IFN-α的肝癌和肉瘤小鼠，其抑瘤率可以达到60%～70%。目前正计划申报临床试验。
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近5年来，我们还在国家“九五”攻关和国家自然科学基金的资助下，开展了再狭窄发病的机制、血管再塑、高血压平滑肌细胞增殖、动脉粥样硬化、核内受体转录等心血管分子生物学的研究，提出了基因-蛋白质功能多样性新概念，发现了核外非序列依赖性DNA结合蛋白。
*国家“973”计划项目，国家攀登计划项目，国家自然科学基金重点项目(39825507)，国家“863”计划项目。
参考文献
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4 Chen KH, Tang J, Ma DL, et al. Cloning and exoression of 5,10-MTHTR gene. Sci China B, 1998, 41: 636-639
5 Liu HT, Chen KH, Ma DL. TFAR19: a novel apoptosis related gene. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 254: 203-205
6 孟昭亨.陈光慧，汤 健，等.应用肌肉介导基因转移制备MTHFR抗体. 中国生物化学和分子生物学学报， 1998， 14: 531-534
7 刘江涛，陈光慧，马大龙，等.凋亡相关基因-TFAR19 cDNA克隆、表达和功能. 高技术通讯， 1998， 8: 6-9
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9 Chou H, Chen KH, Tang J, et al. Enhanced AAV Vector expression by adenovius protein cationic liposome complex. Chin Med J, 1995, 108: 332-338
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11 Tang J， Chen KH. Application of hio-techniques on treatment of cardiovascular disease. Chin Med J， 1996， 109: 99-103
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14 Chen KH, Zhang SH, Tang J, et al. Effect of AAV mediated transfer of LDL-receptor gene on hypercholestrolemia. Sci China B, 1998, 41: 435
15 Qin YJ, Chen KH, Tang J, et al. Gene suture: a novel method for intramuscular gene transfer. Life Sci, 1999,65:2193-2202
16 赵民清，李岱宗，张吉辉，等.BQ123-多聚赖氨酸携载β-半乳糖苷酶基因向血管平滑肌细胞的靶向导入.北京医科大学学报，1994，26(增)：135-138
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17 赵民青，刘乃奎，周爱儒，等.16肽-多聚赖氨酸携载β-LacZ基因向在体血管的导入与表达.北京医科大学学报，1994，26(增)：139
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19 Chen KH， Tang J, Ma DL, et al. “Molecular Bypass": The application of VEGF to gene tharapy. Cardiovasc Pathol， 1997， 2: 107-111
20 丁金风，陈光慧，汤 健，等.心钠素基因对自发性高血压大鼠的治疗作用. 中国循环杂志， 1998， 12: 215-218
21 秦阳君,陈光慧，汤 健，等. 肌肉介导心钠素基因对L-NNA高血压大鼠的作用. 高技术通讯， 1998， 8: 45-49
22 朱甫祥、陈光慧，汤 健，等.缺陷型腺病毒载体介导Prouk基因对再狭窄的治疗作用. 高技术通讯, 1998， 8: 43-47
(1999-09-09收稿), http://www.100md.com
单位：汤健 陈光慧 周爱儒 北京医科大学心血管基础研究所；马大龙 免疫学系，北京 100083
关键词：基因转移；基因疗法；基因；克隆；分子；心血管疾病；治疗
北京医科大学学报990601 摘 要 5年来北京医科大学心血管基础研究所在国家生物高技术计划的支持下克隆了HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR等6种新基因，并对其功能进行较系统的研究，发展基因缝线，病毒脂质体，电脉冲等几种新的体内转基因的方法，进行肌肉和体内基因转移，治疗实验性高血压、高胆固醇血症和梗塞性血管病等疾病，发展了多种基因药物的研究。
中国图书资料分类法分类号 Q343.1
The studies of cardiovascular molecular biology
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TANG Jian＃, CHEN Guang-Hui(CHEN Kuang-Hueih), ZHOU Ai-Ru, MA Da-Long
(＃The Institute of Cardiovascular Basic Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Gene transfer Gene therapy Genes Clonal, molecular Cardiovascular diseases/ther
ABSTRACT For the past 5 years, we have cloned six novel genes such as HRG-1, HCY-2, hhLIM, and TFAR-19 etc. and also studied the functions of these genes systemically. All this was done under the support of National Bio High Tech Project. For gene transfer, we have developed several novel gene delivery modalities for transfering genes into skeletal muscles and certain tissues, such as gene suture, gene balloon, viral-liposome complex (adenosome), electro-accupuncture, and electric pulse etc. and used them to treat experimental hypertension, hypercholesterolemia, and occlusive vascular diseases. Besides, we have started the studies of several gene medicines and got some promising results.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:481-484)
近5年来，我们所主持和承担了国家重大基础发展规划(973)，国家基础发展计划(攀登计划)和国家生物高技术发展计划(863)等多项心血管分子生物学的任务。主要开展了以下几方面的研究，并取得了初步成果。
1 新基因的克隆
5年来，我们建立心肌、血管平滑肌细胞、内皮细胞、胚胎心和脑的cDNA文库，应用差异显示，递减杂交、DNA Chips技术和方法，克隆出HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR-19、UCK等一系列新基因[1～5]。
1.1 HRG-1基因
HRG-1基因是应用自发性高血压大鼠和正常(WKY)大鼠培养的平滑肌细胞，通过差异筛选，克隆出的一个与细胞增殖相关的基因，其全长为4.16 kb，可编码出661个氨基酸。以大鼠HRG-1 为探针，从人的肾脏cDNA 文库中，亦克隆出人的HRG-1 全长cDNA ，它与大鼠有91.8%的同源性，定位1号染色体上(1p36.3)。应用Northern blot 和免疫组织化学的方法证明，人和大鼠HRG-1广泛分布在心、脑、肾、肺、肝等不同组织中。应用荧光融合蛋白的方法发现，它可能是一种膜蛋白，主要存在于细胞膜和胞浆中。这种蛋白质可为蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)磷酸化，抑制raf和丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的活性，因此它可以抑制一些细胞的增殖，是一种与细胞增殖相关的新的细胞内信息传递分子。
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HRG-1在一些心血管病和肿瘤的发病中可能具有重要意义。在自发性高血压大鼠平滑肌细胞、内皮损伤再狭窄和去ApoE基因的动脉粥样硬化小鼠的动脉壁内低表达；转HRG-1基因或蛋白质可以抑制血管平滑肌细胞的增殖。在一些肿瘤细胞(如鳞状上皮癌，髓性白血病，卵巢癌等)细胞株，HRG-1基因低表达。应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)证明，在一些肿瘤细胞株HRG-1基因丢失和移位，其丢失率可以达30%以上。给U937和食管癌细胞株转移HRG-1基因可以抑制癌细胞的生长和集落形成[1，3]。
1.2 hhLIM基因
hhLIM基因是应用胚胎心脏和去胎心的胚胎经三元递减所克隆的一个与心脏生长相关的新基因，其人cDNA全长为1006 bp，可编码194个氨基酸。它与LIM家属基因(RP-1,SmLIM等)有高度同源性，都是一类富含Cysteine的锌指结构的蛋白。但是与其它LIM不同，它主要分布在心肌细胞，很少在其它细胞、组织和器官中表达，因此它可能是一种特异性的心肌表达的基因。
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hhLIM可能与心肌生长和心肌肥厚有密切的关系。在自发性高血压大鼠、异丙肾上腺素和主动脉夹闭所致的心肌肥厚的标本中，hhLIM高表达；应用内皮素或血管紧张素2可促进hhLIM的表达，并可诱导心肌生长；给培养的心肌细胞导入hhLIM，可以促进心肌3H-亮氨酸参入和蛋白质的合成，促进心肌细胞的生长。
1.3 HCY-2基因
HCY-2是通过半胱氨酸/同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞，应用差异筛选所获得的一种新的基因，其cDNA全长为2 014 bp ，可编码 142个氨基酸。应用Northern blot和免疫组织化学证明，HCY-2广泛分布在脑、肾、心、肺、肝等不同的组织器官中。氨基酸序列分析，它可能具有两个活性基团(3～30和60～90氨基酸)，与体内许多与细胞凋亡相关的丝/苏氨酸，蛋白激酶(如细胞凋亡蛋白，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)诱导蛋白等)有高度同源性。给培养的平滑肌细胞导入HCY-2基因可以引起细胞凋亡。给鸡胚导入HCY-2基因可以引起神经管和心脏发育畸形[2，6]。
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此外，我们尚与卫生部分子免疫重点实验室合作克隆了两个与细胞凋亡相关的基因——TFAR-15和TFAR-19，和一个新的细胞趋化因子——UCK。其中UCK具有多种变异体，它可以趋化单核细胞、淋巴细胞和多形核粒细胞，促进造血干细胞和成肌母细胞的增殖[5，7]。
2 新的基因转移体系
基因转移是研究基因功能，实现基因治疗的关键。目前国际上多采用病毒介导和非病毒介导的两类基因转移方法，前者基因转移效率高，但毒副作用大；后者毒副作用小，但基因转移效率低。近年来我们发展了以下几种新的基因转移体系[6，8～15]。
2.1 受体介导的基因转移
我们与上海市肿瘤所合作，分别应用内皮素A型受体阻断剂(BQ123)和B型受体阻断剂(BQ3020)，通过多聚赖氨酸与基因偶联，形成受体阻断剂与DNA的复合体。应用这种受体介导的复合体，直接转染血管内皮细胞和平滑肌细胞，可以明显提高基因转移效率60%～80%，并具有明显的靶向性。BQ123-DNA复合体可以通过A型受体，特异性转移至血管平滑肌细胞；BQ3020-DNA复合体可以通过B型受体，特异性转染内皮细胞[16，17]。
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2.2 病毒脂质体
由于腺病毒载体虽具有高度的转染性，但副作用大；而脂质体虽然转染效率低，却比较安全。我们应用腺病毒包被蛋白的单克隆抗体，分析了腺病毒不同包被蛋白在转染中的作用，发现腺病毒的fiber蛋白在转染中起着关键作用。因此应用蛋白质工程的方法，重组和纯化fiber蛋白质，并镶嵌在双层脂质体膜上，形成fiber蛋白脂质体，应用这种病毒脂质体(adenosome)转染平滑肌细胞，其转染效率可以从2%提高到30%～40%以上[14]。
2.3 基因缝线
1990年美国Wolff发现给肌肉直接注射裸DNA，可以进入肌细胞，表达出相应蛋白质，但转移效率低，难以达到实际应用效果。我们将手术缝线浸泡于富含阳离子的多聚赖氨酸-或明胶溶液中，吹干后带负电荷的DNA可粘附在缝线上，进行肌肉缝合。这样既可以促进肌肉的再生，提高肌肉内转基因的效率，又可以保持基因在肌肉局部，防止基因的流失，延长基因转移的时间，达到体内转基因治疗疾病的目的[15]。
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2.4 电针介导的基因转移
电针介导的基因转移是在电渗透和电打孔转移技术的基础上发展起来的一种新的体内基因转移的方法。这种方法是将重组的裸DNA，粘附在针灸针上，插入肌肉内，通过脉冲方波电刺激，从而实现基因转移。亦可在肌肉内先注入重组DNA，再应用表面电极或插入肌肉局部的电极，予以电刺激。其电压强度为80～200V/cm，波宽为20～40ms，频率为1～4次。其基因转移效率比直接肌肉注射法提高了几倍至几百倍，是一种较为理想的基因转移方法。它不仅简便，易行，经济实用，而且安全、有效，可以反复应用。此外，可以实行多点、多次电脉冲基因转移，不仅可以根据个体需要，调整基因导入的用量，还可以同时携带几种不同的基因，实现多种基因的综合转移[13]。
最近，我们还研制了一种高通量多基因的基因转移体系，应用电脉冲可以同时进行几百个基因的转移，进行大规模基因功能的筛选。
此外，我们实验室还创建了基因支架(stent)基因球束导管等血管内基因转移的方法。
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3 基因药物[18]
基因药物亦称DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，直接转移至人体的细胞，表达出具有治疗意义的多肽和蛋白质，而达到治疗目的的一种新的方法。它与传统的蛋白质工程和合成类药物不同，它不需要大规模工厂和设备，不必进行蛋白质合成、分离和纯化；而且一次给药，可以长期有效。基因药物被誉为医药工业的第四次革命，它是对传统药物的一个巨大的挑战，是国际生物高技术和医药产业的一个方向。近5年来我们实验室进行了以下几个方面的研究和探索。
3.1 分子搭桥技术
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种高效特异性血管生长因子，它可以促进血管的生长。我们重组了VEGF真核表达载体(pcD2/VEGF)，通过基因缝线或电脉冲基因转移，导入梗塞血管周围的肌肉内，证明它可以在局部表达出VEGF，促进梗塞部位血管的生长，形成大量侧支循环，治疗外周梗塞性血管病，并已申报临床试验。通过局部注射，亦可以治疗实验性心肌梗死和脑梗死[19]。
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3.2 抗高血压的基因药物
心钠素、降钙素基因相关肽，肾上腺髓质降压素和激肽释放酶在高血压的发生中起着十分重要的作用。但是这些生物活性多肽在体内极易降解，必须持续大量给药才能有效，因此限制了临床的应用。我们构建了心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素基因的真核表达载体，通过基因缝线或电脉冲介导的基因转移方法，导入高血压大鼠的股四头肌内，证明可以长期持续表达出相应的多肽，降低自发性高血压大鼠、肾性高血压大鼠和L-NNA高血压大鼠的血压，并产生明显的利钠、利尿效果。一次注射，其疗效可以持续1～3个月以上[15，20，21]。
3.3 抗动脉硬化的基因药物
低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDL-R)基因的缺陷是动脉粥样硬化的一个重要因素，我们构建了LDL-R的重组腺病毒辅助病毒的载体，通过腺病毒脂质体导入肝脏，可以明显降低血浆LDL的水平，增加HDL/LDL的比例，降低血浆甘油三脂的水平。这种方法不必切除肝脏，分离肝细胞，较应用逆转录病毒载体携带LDL-R治疗实验性高胆固醇血症经济、实用、简便、易行[14，22]。
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近年来提出动脉粥样硬化是一种慢性炎症。我们构建了IL-10和IL-1ra真核表达载体，通过局部基因转移，导入实验性动脉硬化的小鼠(缺ApoE基因小鼠)，初步证明它们具有抗炎作用，可以延缓动脉粥样硬化的进展。导入一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的基因亦有同样的效果。
3.4 治疗肾功能衰竭的基因药物
促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是治疗肾功能衰竭贫血的一种有效蛋白质，但必须每周注射才有效。我们重组了EPO基因的真核表达载体，通过电脉冲转移至肌肉内，可以长期表达出EPO，升高血红素和红细胞。应用这种方法，可以有效治疗肾功能衰竭大鼠的贫血，明显改善肾功能，延长肾功能衰竭的生存率。给猴体注射亦有效。一次基因转移，可以长期有效，其疗效可以持续2～3个月以上。
3.5 治疗糖尿病的基因药物
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胰岛素是治疗糖尿病的有效药物，但必须每天注射才有效。我们研究所和北京大学合作，构建了胰岛素基因的真核表达载体，应用电脉冲方法导入实验性糖尿病的大鼠，初步证明了它亦可以明显降低血糖，治疗糖尿病，一次基因转移可以长期有效。
此外，我们还构建了肥胖基因(leptin)的真核表达载体，导入食饵性肥胖的大鼠的肌肉内，初步发现它可以明显减轻体重，增加代谢。
3.6 抗肿瘤的基因药物
纤维细胞因子和血管生长抑制因子具有抗肿瘤的作用。我们构建了α干扰素(interferon-α， IFN-α)、白细胞介素-2和血管内皮生长抑制因子(endostatin)基因的真核表达载体，通过电脉冲，给罹患有肝癌、肉瘤和腹水瘤的小鼠进行肌肉内基因转移，证明可以明显抑制肿瘤的生长，延长肿瘤和肉瘤小鼠的生存时间。转IFN-α的肝癌和肉瘤小鼠，其抑瘤率可以达到60%～70%。目前正计划申报临床试验。
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近5年来，我们还在国家“九五”攻关和国家自然科学基金的资助下，开展了再狭窄发病的机制、血管再塑、高血压平滑肌细胞增殖、动脉粥样硬化、核内受体转录等心血管分子生物学的研究，提出了基因-蛋白质功能多样性新概念，发现了核外非序列依赖性DNA结合蛋白。
*国家“973”计划项目，国家攀登计划项目，国家自然科学基金重点项目(39825507)，国家“863”计划项目。
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(1999-09-09收稿), http://www.100md.com