香草醛-磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲甙
作者：杜鸣 刘养清 刘明杰 徐秉玖
单位：杜鸣 刘明杰 徐秉玖(北京大学药学院分析化学与药物分析研究室, 北京 100083)；刘养清(山西师范大学化学系)
关键词：黄芪甙；分析；黄芪口服液；化学；补阳还五汤；化学；荧光光度测定法
北京医科大学学报000315 [摘 要] 目的：建立香草醛-磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲甙的方法。方法：利用在磷酸条件下香草醛与黄芪甲甙的荧光反应测定黄芪甲甙。结果：黄芪甲甙与香草醛的反应产物的最大激发波长Ex=365 nm,最大发射波长Em= 430 nm。黄芪甲甙在0.0～20.0 mg.L-1范围呈良好的线性关系，最低检测限为0.106 mg.L-1，测定样品的回收率为95.97%～102.1 %。结论：本方法具有灵敏度高、检测限低、直接测定无干扰等优点。测定黄芪口服液、中药复方补阳还五汤及含药猪血清等多种类型样品中的黄芪甲甙含量，结果满意。
, 百拇医药
[中图分类号] R932.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0248-03
Study on the determination of astragaloside in vanillin-phosphoric acid system
by spectrophotofluorimetry
DU Ming，LIU Ming-Jie，XU Bing-Jiu
(1. Analytical Division, School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
LIU Yang-Qing
(Department of Chemistry, Shanxi Normal University)
ABSTRACT Objective: To develop the determination method of astrogaloside in vanillin-phosphoric acid system by spectrophotofluorimetry. Methods: Vanillin was used as colour developing reagent in the presence of phosphoric acid. Results: The complex of astrogaloside and vanillin had excitation and emission maxima at 365 and 430 nm , respectively. The linear range of determination was from 0.0 to 20.0 mg.L-1. The detection limit was 0.106 mg.L-1. The recoveries of samples were between 95.97% and 102.1 %. Conclusion: The proposed method has advantages of low detection limit without interference. It has been used to determine several kinds of samples successfully.
, 百拇医药
KEY WORDS Astragalin/anal; Astragalus membranaceus/chem; Buyang Huanwu decoction/chem; Fluorophotometry▲
目前黄芪甲甙(astragaloside Ⅳ)测定的方法有：(1)比色法[1，2]；(2)薄层层析-紫外分光光度法[3，4]；(3)薄层扫描法[5，6]；(4)高效液相色谱(High performance liquid chromatography， HPLC)法[7]。由于黄芪甲甙仅在205 nm处有末端吸收，灵敏度低，不利于HPLC法分析；比色法常用香草醛等显色剂显色，但空白值较高，而且测定中药时干扰较多；薄层扫描法操作繁琐，准确度较差。荧光分析法具有灵敏度高，选择性好的特点。本文利用在浓磷酸条件下黄芪甲甙与香草醛反应的产物具有荧光的特性，建立了香草醛荧光分光光度法测定黄芪甲甙的方法。该方法操作简便，反应专属性和重现性好，样品不必进行薄层分离，空白值低。直接测定成分复杂的中药复方、黄芪制剂以及猪血清等多种类型样品时无干扰。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器
RF-540荧光分光光度计(日本岛津公司)。
1.2 试剂
香草醛(北京芳草医药化工研制公司)使用时临时配制成80 g.L-1的无水乙醇溶液；浓磷酸(85%，体积分数)等所用试剂均为分析纯。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所提供) 配制成1.0 g.L-1的甲醇溶液。
1.3 样品
黄芪口服液(上海福达制药有限公司生产，批号980502)，取口服液1.00 ml，加入2.00 ml无水乙醇，离心分离沉淀，上清液待用。补阳还五汤方剂：黄芪120 g，归尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g。按此方配伍，水煎煮3次，合并水煎液，然后依次用石油醚(去脂溶性成分)、 氯仿(去除部分干扰成分)、正丁醇萃取，因黄芪甲甙易溶于正丁醇，所以以正丁醇相作为黄芪甲甙测定样品。含药猪血清样品：实验猪(7头)，100 kg左右。(1)实验组(6头)，将补阳还五汤复方剂制成浸膏连续灌喂3 d，同时喂普通饲料。(2)对照组(1头)，只喂普通饲料。3 d后两组分别取血，含药血合并。分别分离血清，各取25 ml，正丁醇萃取4次，每次萃取剂用量为血清体积的1/2。萃取液合并，浓缩至50 ml，取4 ml，蒸干，2 ml甲醇溶解，备用。
, 百拇医药
1.4 分析方法
取适量样品(或标准)溶液，置于5 ml容量瓶中，加入0.03 ml香草醛溶液，再加入1.00 ml磷酸，摇匀，80℃水浴中反应10 min，冷却，然后无水乙醇稀释至刻度，摇匀，在荧光分光光度计激发波长(Ex)365 nm，发射波长(Em)430 nm下测定荧光强度值(If)。
2 结果
2.1 黄芪甲甙反应产物的激发、发射光谱
在实验条件下，所测定的黄芪甲甙与香草醛反应产物的激发光谱、发射光谱见图1 。黄芪甲甙反应物的最大激发、最大发射波长分别为Ex=365 nm，Em=430 nm。
2.2 磷酸用量的选择
按分析方法，改变磷酸加入量，测定荧光强度值(图2)。实验结果表明，选1.00 ml磷酸为最佳。
, http://www.100md.com
2.3 香草醛试剂用量的选择
在实验条件下，对香草醛试剂的用量进行选择(图3)，结果表明0.03 ml的香草醛试剂较为合适。
2.4 反应温度的选择
测定温度对反应的影响。结果表明反应温度选80℃较为合适(图4)。
2.5 加热时间及反应物稳定性实验
在80℃水浴下，经实验表明反应时间为10 min较为合适。对荧光产物的稳定性进行考察，结果表明：反应结束后荧光产物的荧光强度值在60 min 以内一直稳定不变。
a, reaction product； b, blank.
, 百拇医药
图1 黄芪甲甙反应产物的激发、发射光谱
Figure 1 Excitation and emission spectra
of astragaloside Ⅳ reaction product
图2 磷酸用量对荧光强度的影响
Figure 2 Effect of phosphoric acid on fluorescence intensity
图3 香草醛试剂用量对荧光强度的影响
Figure 3 Effect of vanillin reagent on fluorescence intensity
, 百拇医药
2.6 检测限实验
黄芪甲甙浓度选10 mg.L-1，对空白溶液测定11次荧光强度，由3σ法得出检测限为0.106 mg.L-1。
2.7 工作曲线
分别取不同量甲甙，在实验条件下，测定荧光值，绘制工作曲线，线性回归方程为Y=653.4X+2.175,r=0.999 3。黄芪甲甙在1.0～20.0 mg.L-1范围内荧光强度与浓度呈线性关系。
图4 温度对荧光强度的影响
Figure 4 Effect of temperature on fluorescence intensity
, http://www.100md.com
2.8 干扰考察
样品中的干扰物对测定无影响从两方面证实(1)利用标准加入法[8]消除基体效应。(2)将样品适当稀释。由于荧光法检出限低，样品稀释后干扰物对样品测定的影响小(利用薄层分析将黄芪甲甙与其他成分分离，测定样品中其他物质荧光强度与样品总荧光强度，两者的荧光强度比<0.14%)。
2.9 样品含量及回收率测定
按上述分析方法操作，用标准加入法测定样品中黄芪甲甙的含量及回收率(表1)。
3 讨论
香草醛-硫酸比色法常用于测定黄芪甲甙，但硫酸用于荧光测定时空白值较高。改用磷酸时，空白值较低。香草醛-磷酸荧光法灵敏度比香草醛-硫酸比色法高100 倍以上，而且操作简便，用于多种类型样品的测定时皆无明显干扰。
, 百拇医药
香草醛与黄芪甲甙的反应是在浓磷酸无水条件下进行的，所以反应体积可尽量小些，测定时可定量稀释反应液。■
表1 荧光法测定黄芪甲甙含量及回收率测定结果(n=3)
Table 1 Determination and recovery results of astragaloside Ⅳ
by spectrophotofluorimetry(n=3) Samples
Mean content
(unit)
Recovery(%)
RSD(%)
, http://www.100md.com Milkretch root oral
liquid (g.L-1)
1.64±0.07
96.89-101.8
3.5
Buyang Huanwu
Tang (g/per recipe)
0.27±0.07
95.97-102.1
3.6
Pig serum
, 百拇医药
(g.L-1)
0.58±0.08
97.01-101.9
3.4
RSD， relative standard deviation.基金项目：国家九五攀登计划预选课题参考文献
[1]俞家华，曹正中，张 勤.膜荚黄芪中黄芪甲甙的含量的测定[J].中药通报， 1986,11(9)：38-39
[2]陆一心.黄芪甲甙定量方法的研究[J].中成药， 1996，18(2)：38-39
[3]吴乃居，陈鸿英，董锡山，等.黄芪愈伤组织中增强免疫活性成分的含量研究[J].中成药， 1989，17 (2)：9-10
, http://www.100md.com
[4]王智华，陆履雯，王海英.补阳还五汤冲剂的质量标准研究[J].中成药， 1996，18(7)：12-14
[5]李连达，何夏秋.高效薄层扫描法测定中风脑脉通口服液中黄芪甲甙的含量[J].中国中药杂志，1991，16(2)：90-91
[6]杨炳友，于砚青，张秀云，等.薄层扫描法测定利肝隆糖衣片中黄芪甲甙的含量[J].中医药学报， 1995，(2)：44-45
[7]王静竹，阎汝南，关 莹，等.HPLC测定黄芪泡制品中黄芪甲甙含量[J].中国中药杂志， 1998，23(2)： 84-85
[8]奚治文，曾永昌，向利人,等.仪器分析[M].成都： 四川大学出版社， 1992.71-72
收稿日期：1999-12-09, 百拇医药
单位：杜鸣 刘明杰 徐秉玖(北京大学药学院分析化学与药物分析研究室, 北京 100083)；刘养清(山西师范大学化学系)
关键词：黄芪甙；分析；黄芪口服液；化学；补阳还五汤；化学；荧光光度测定法
北京医科大学学报000315 [摘 要] 目的：建立香草醛-磷酸体系荧光分光光度法测定黄芪甲甙的方法。方法：利用在磷酸条件下香草醛与黄芪甲甙的荧光反应测定黄芪甲甙。结果：黄芪甲甙与香草醛的反应产物的最大激发波长Ex=365 nm,最大发射波长Em= 430 nm。黄芪甲甙在0.0～20.0 mg.L-1范围呈良好的线性关系，最低检测限为0.106 mg.L-1，测定样品的回收率为95.97%～102.1 %。结论：本方法具有灵敏度高、检测限低、直接测定无干扰等优点。测定黄芪口服液、中药复方补阳还五汤及含药猪血清等多种类型样品中的黄芪甲甙含量，结果满意。
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[中图分类号] R932.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0248-03
Study on the determination of astragaloside in vanillin-phosphoric acid system
by spectrophotofluorimetry
DU Ming，LIU Ming-Jie，XU Bing-Jiu
(1. Analytical Division, School of Pharmaceutical Sciences,Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
LIU Yang-Qing
(Department of Chemistry, Shanxi Normal University)
ABSTRACT Objective: To develop the determination method of astrogaloside in vanillin-phosphoric acid system by spectrophotofluorimetry. Methods: Vanillin was used as colour developing reagent in the presence of phosphoric acid. Results: The complex of astrogaloside and vanillin had excitation and emission maxima at 365 and 430 nm , respectively. The linear range of determination was from 0.0 to 20.0 mg.L-1. The detection limit was 0.106 mg.L-1. The recoveries of samples were between 95.97% and 102.1 %. Conclusion: The proposed method has advantages of low detection limit without interference. It has been used to determine several kinds of samples successfully.
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KEY WORDS Astragalin/anal; Astragalus membranaceus/chem; Buyang Huanwu decoction/chem; Fluorophotometry▲
目前黄芪甲甙(astragaloside Ⅳ)测定的方法有：(1)比色法[1，2]；(2)薄层层析-紫外分光光度法[3，4]；(3)薄层扫描法[5，6]；(4)高效液相色谱(High performance liquid chromatography， HPLC)法[7]。由于黄芪甲甙仅在205 nm处有末端吸收，灵敏度低，不利于HPLC法分析；比色法常用香草醛等显色剂显色，但空白值较高，而且测定中药时干扰较多；薄层扫描法操作繁琐，准确度较差。荧光分析法具有灵敏度高，选择性好的特点。本文利用在浓磷酸条件下黄芪甲甙与香草醛反应的产物具有荧光的特性，建立了香草醛荧光分光光度法测定黄芪甲甙的方法。该方法操作简便，反应专属性和重现性好，样品不必进行薄层分离，空白值低。直接测定成分复杂的中药复方、黄芪制剂以及猪血清等多种类型样品时无干扰。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器
RF-540荧光分光光度计(日本岛津公司)。
1.2 试剂
香草醛(北京芳草医药化工研制公司)使用时临时配制成80 g.L-1的无水乙醇溶液；浓磷酸(85%，体积分数)等所用试剂均为分析纯。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所提供) 配制成1.0 g.L-1的甲醇溶液。
1.3 样品
黄芪口服液(上海福达制药有限公司生产，批号980502)，取口服液1.00 ml，加入2.00 ml无水乙醇，离心分离沉淀，上清液待用。补阳还五汤方剂：黄芪120 g，归尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g。按此方配伍，水煎煮3次，合并水煎液，然后依次用石油醚(去脂溶性成分)、 氯仿(去除部分干扰成分)、正丁醇萃取，因黄芪甲甙易溶于正丁醇，所以以正丁醇相作为黄芪甲甙测定样品。含药猪血清样品：实验猪(7头)，100 kg左右。(1)实验组(6头)，将补阳还五汤复方剂制成浸膏连续灌喂3 d，同时喂普通饲料。(2)对照组(1头)，只喂普通饲料。3 d后两组分别取血，含药血合并。分别分离血清，各取25 ml，正丁醇萃取4次，每次萃取剂用量为血清体积的1/2。萃取液合并，浓缩至50 ml，取4 ml，蒸干，2 ml甲醇溶解，备用。
, 百拇医药
1.4 分析方法
取适量样品(或标准)溶液，置于5 ml容量瓶中，加入0.03 ml香草醛溶液，再加入1.00 ml磷酸，摇匀，80℃水浴中反应10 min，冷却，然后无水乙醇稀释至刻度，摇匀，在荧光分光光度计激发波长(Ex)365 nm，发射波长(Em)430 nm下测定荧光强度值(If)。
2 结果
2.1 黄芪甲甙反应产物的激发、发射光谱
在实验条件下，所测定的黄芪甲甙与香草醛反应产物的激发光谱、发射光谱见图1 。黄芪甲甙反应物的最大激发、最大发射波长分别为Ex=365 nm，Em=430 nm。
2.2 磷酸用量的选择
按分析方法，改变磷酸加入量，测定荧光强度值(图2)。实验结果表明，选1.00 ml磷酸为最佳。
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2.3 香草醛试剂用量的选择
在实验条件下，对香草醛试剂的用量进行选择(图3)，结果表明0.03 ml的香草醛试剂较为合适。
2.4 反应温度的选择
测定温度对反应的影响。结果表明反应温度选80℃较为合适(图4)。
2.5 加热时间及反应物稳定性实验
在80℃水浴下，经实验表明反应时间为10 min较为合适。对荧光产物的稳定性进行考察，结果表明：反应结束后荧光产物的荧光强度值在60 min 以内一直稳定不变。
a, reaction product； b, blank.
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图1 黄芪甲甙反应产物的激发、发射光谱
Figure 1 Excitation and emission spectra
of astragaloside Ⅳ reaction product
图2 磷酸用量对荧光强度的影响
Figure 2 Effect of phosphoric acid on fluorescence intensity
图3 香草醛试剂用量对荧光强度的影响
Figure 3 Effect of vanillin reagent on fluorescence intensity
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2.6 检测限实验
黄芪甲甙浓度选10 mg.L-1，对空白溶液测定11次荧光强度，由3σ法得出检测限为0.106 mg.L-1。
2.7 工作曲线
分别取不同量甲甙，在实验条件下，测定荧光值，绘制工作曲线，线性回归方程为Y=653.4X+2.175,r=0.999 3。黄芪甲甙在1.0～20.0 mg.L-1范围内荧光强度与浓度呈线性关系。
图4 温度对荧光强度的影响
Figure 4 Effect of temperature on fluorescence intensity
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2.8 干扰考察
样品中的干扰物对测定无影响从两方面证实(1)利用标准加入法[8]消除基体效应。(2)将样品适当稀释。由于荧光法检出限低，样品稀释后干扰物对样品测定的影响小(利用薄层分析将黄芪甲甙与其他成分分离，测定样品中其他物质荧光强度与样品总荧光强度，两者的荧光强度比<0.14%)。
2.9 样品含量及回收率测定
按上述分析方法操作，用标准加入法测定样品中黄芪甲甙的含量及回收率(表1)。
3 讨论
香草醛-硫酸比色法常用于测定黄芪甲甙，但硫酸用于荧光测定时空白值较高。改用磷酸时，空白值较低。香草醛-磷酸荧光法灵敏度比香草醛-硫酸比色法高100 倍以上，而且操作简便，用于多种类型样品的测定时皆无明显干扰。
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香草醛与黄芪甲甙的反应是在浓磷酸无水条件下进行的，所以反应体积可尽量小些，测定时可定量稀释反应液。■
表1 荧光法测定黄芪甲甙含量及回收率测定结果(n=3)
Table 1 Determination and recovery results of astragaloside Ⅳ
by spectrophotofluorimetry(n=3) Samples
Mean content
(unit)
Recovery(%)
RSD(%)
, http://www.100md.com Milkretch root oral
liquid (g.L-1)
1.64±0.07
96.89-101.8
3.5
Buyang Huanwu
Tang (g/per recipe)
0.27±0.07
95.97-102.1
3.6
Pig serum
, 百拇医药
(g.L-1)
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97.01-101.9
3.4
RSD， relative standard deviation.基金项目：国家九五攀登计划预选课题参考文献
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[6]杨炳友，于砚青，张秀云，等.薄层扫描法测定利肝隆糖衣片中黄芪甲甙的含量[J].中医药学报， 1995，(2)：44-45
[7]王静竹，阎汝南，关 莹，等.HPLC测定黄芪泡制品中黄芪甲甙含量[J].中国中药杂志， 1998，23(2)： 84-85
[8]奚治文，曾永昌，向利人,等.仪器分析[M].成都： 四川大学出版社， 1992.71-72
收稿日期：1999-12-09, 百拇医药