四种抗真菌天然产物对威克海姆原藻超微结构的影响
作者：王理达 果德安 胡迎庆 屠鹏飞 宫毓静 郑俊华
单位：北京大学药学院，北京 100083
关键词：威克海姆原藻；真菌；超微结构；抗真菌药(中药)；药理学；真菌；药物作用
北京医科大学学报000307 [摘 要] 目的：研究抗真菌天然产物澳洲茄胺、白鲜碱、紫檀
、7-羟基-4′-甲氧基黄烷对威克海姆原藻超微结构的影响，以期阐明药物对真菌细胞的作用机制。方法：采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察正常细胞及用药组细胞的超微结构。结果：观察到用药组细胞与正常细胞超微结构的差异。结论：为阐明药物对细胞的作用机制提供了部分依据。
[中图分类号] R798.5 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0219-04
Effect of four antifungal natural products
on ultrastructure of Prototheca wickerhamii
WANG Li-Da，GUO De-An，HU Ying-Qing，TU Peng-Fei，GONG Yu-Jing，ZHENG Jun-Hua
(School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To study the effect of antifungal natural products on ultrastructure of Prototheca wickerhamii and clarify the antifungal mechanism of these antifungal natural products. Methods: The ultrastructures of normal and treated P. wickerhamii cells by scanning and transmission electronic microscope were observed. Results: It was found that the morphology of the treated cells with antifungal natural products changed greatly, e.g. the damage of the inner layer of the cell wall, the degradation of the membranous organelles. Conclusion: The observation results provided some scientific data for the identification of antifungal mechanism of four natural products.
, 百拇医药
KEY WORDS Prototheca wickerhamii; Fungi/ultrastruct; Antifungal agents(TCD)/pharmacol; Fungi/drug eff▲
威克海姆原藻(Prototheca wickerhamii)是一种分类地位一直存有争议的微生物，一说其属于真菌类，有酵母样菌落，但无出芽生殖方式，而以内生孢子进行繁殖，另外从其细胞膜的成分上也是合成甾醇类化合物作为细胞膜的框架结构，其甾醇的生物合成途径与真菌极其相近。一说其属于藻类，但又是缺乏叶绿体和淀粉核的异养生物。更有学者认为其居于二者之间[1～4]。现在大多数学者把它归为绿藻门，称为无绿藻，是绿藻的变种，失去了原有藻类的叶绿素，寄生或腐生于木材、蔬菜和粪便中，引起人皮肤、皮下组织、口腔、鼻、浆膜等处病变，统称无绿藻病(protothecosis)，偶尔可引起系统性感染[5]。临床上仍把无绿藻病归为真菌病， 用抗真菌药物治疗。自Davies等[6]1964年报道首例无绿藻病至今，全球已发现近百例且有上升趋势，对该病尚无特别有效的治疗药物，往往需要手术治疗。抗真菌天然产物对威克海姆原藻的作用迄今未见报道。
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澳洲茄胺(Solasodine)属甾体生物碱，甾体生物碱及其糖苷存在于茄科茄属(Solanum)的大多数植物中，具有包括抗真菌在内的多种生物活性。白鲜皮系Dictamnus dasycarpus (Rutaceae)的根皮，其水提物在体外对许多人类致病真菌有抑制作用，其中白鲜碱(Dictamnine)是活性最高的有效成分。经体外抗真菌试验证明，紫檀(4′-hydroxy-3,5-dimethoxystilbene)和7-羟基-4′-甲氧基黄烷(7-hydroxy-4′-methoxyflavan)对近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须癣毛癣菌(Trichophyton gypseum)及烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)都有较好活性。
, 百拇医药
我们对正常细胞及分别加入上述4种抗真菌天然产物的用药组细胞的超微结构进行了对比观察，以期阐明药物对细胞的作用机制，并为开发新的抗真菌药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
威克海姆原藻菌种由W. David Nes博士( Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University, Lubbock, Texas, USA) 赠送。
1.2 仪器、药品与试剂
1.2.1 仪器 HZQ-Q全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发公司)；超净工作台(北京半导体一厂)；扫描电子显微镜(日立HITACHI S450型)；透射电子显微镜(日立HITACHI H500型)。
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1.2.2 药品 蛋白胨(Peptone，购自DIFCO公司)；酵母提取物(Yeast Extract，购自OXOID公司)；葡萄糖(汕头市光华化学厂)；澳洲茄胺(Solasodine, 由W. David Nes博士赠送)；白鲜碱(Dictamnine, 作者从白鲜皮中提取分离得到)，紫檀和7-羟基-4′-甲氧基黄烷由北大药学院胡迎庆硕士从剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen中提取、分离并鉴定其结构。
1.2.3 试剂 均为分析纯(AR)。
1.3 方法
1.3.1 P. wickerhamii的培养 培养基为蛋白胨20 g.L-1，葡萄糖20 g.L-1，酵母提取物10 g.L-1。每100 ml培养基加1.5 ml吐温-80。每瓶接种适量细胞，终浓度为104 CFU.ml-1。置于30℃，100 r.min-1摇床培养。
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1.3.2 药物浓度的确定及收获细胞时间的确定 精确称取一定量的药品，用二甲基亚砜(DMSO)或无水乙醇溶解配成一定浓度的药液，再稀释成不同浓度。将处于对数生长期的细胞接种到含药的培养基中，以不加药物的空白培养基为阴性对照。培养细胞分别于0，2，4，6，8，10，12，24，36，48 h用UV-754分光光度计在600 nm下读取光密度值，以时间为横坐标，A600为纵坐标作生长曲线；以时间为横坐标，以抑制真菌生长的百分率为纵坐标作时间抑菌曲线。从而得到细胞进入稳定期的时间(24 h)及各药物抑制80%细胞生长的浓度(MIC80)。因此分别以各药物的MIC80作为观察药物对细胞超微结构影响的浓度，即澳洲茄胺2.5 mg.L-1，白鲜碱50 mg.L-1紫檀32.5 mg.L-1和7-羟基-4′-甲氧基黄烷50 mg*L-1。
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1.3.3 扫描电子显微镜观察 液体培养基中生长24 h的空白对照组及加药组的细胞离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，喷碳、喷金后用扫描电子显微镜观察。
1.3.4 透射电子显微镜观察 培养细胞(培养方法同上)离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，包埋、切片、铅铀染色后用透射电子显微镜观察。
2 结果
2.1 P. wickerhamii正常细胞的超微结构
P. wickerhamii的营养孢子和休眠孢子的超微结构不同，休眠孢子内层细胞壁较厚，淀粉粒、脂粒体累积，而膜细胞器少见。营养孢子则相反，主要为膜细胞器，如线粒体、内质网等，观察结果与Joshi报道相同[8](图1，2)。正常细胞的生长繁殖周期为营养孢子长大后分裂成多个子细胞，由母细胞壁所包围，之后母细胞壁破裂，子细胞散发出来，开始新的生活周期。
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2.2 澳洲茄胺处理组细胞的超微结构
扫描电镜下可见细胞表面有疣状突起，细胞周围有许多散落的小泡，各个细胞上的突起数目、大小不等(图3)。透射电镜可见内层细胞壁及细胞膜轮廓不清，双层膜的似原质体结构高度积累，细胞器降解(图4)。
2.3 白鲜碱处理组细胞的超微结构
扫描电镜下可见细胞表面皱缩(图5)，透射电镜下见细胞因生长代谢受到影响，大都停留在含多个子细胞的大的母细胞阶段，而且由母细胞所包围的子细胞的细胞壁皱缩变形，膜细胞器降解(图6)。
2.4 紫檀
处理组细胞的超微结构
扫描电镜观察可见细胞表面严重皱缩，透射电镜下发现内层细胞壁变薄，子细胞壁消失，膜细胞器降解(图7)。
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2.5 7-羟基-4′-甲氧基黄烷处理组细胞的超微结构
扫描电镜和透射电镜均可见细胞壁皱折，双层膜似原质体结构累积在内层细胞壁处，类似于E. Segal等研究两性霉素B对P. wickerhamii作用的观察结果[7]，两性霉素B引起细胞膜通透性增大[2，3]。同时可见细胞膜破损，膜细胞器降解，线粒体膨大(图8)。
图1 扫描电镜下P. wickerhamii的正常细胞(左) SEM×1 090
Figure 1 Normal P. wickerhamii cells under scanning electronic microscope(left) SEM×1 090
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图2 透射电镜下P. wickerhamii的正常细胞(中) TEM×10 000
Figure 2 Normal P. wickerhamii cells under transmission electronic microscope(middle) TEM×10 000
图3 扫描电镜下澳洲茄胺处理组P. wickerhamii细胞(右) SEM×1 860
Figure 3 P. wickerhamii cells treated with solasodine under scanning electronic microscope(right) SEM×1 860
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图4 透射电镜下澳洲茄胺处理组
P. wickerhamii细胞 TEM×20 000
Figure 4 P. wickerhamii cells treated with solasodine
under transmission electronic microscope TEM×20 000
3 讨论
3.1 关于P. wickerhamii细胞表面突起的产生与发展
Joshi等[8]于1975年首次报道了P. wickerhamii的超微结构。文中较详尽地描述了当P. wickerhamii接种到新鲜培养基上1 h以后，一些休眠孢子表面形成疣状突起，突起中含有细胞质。在这些孢子旁边可见相同大小的独立的微小体，接着这些孢子发育成含有多个子细胞的母细胞。Joshi等认为这些突起具有完整的细胞壁、细胞膜和细胞质，可能是配子。但未能证实其中是否有核物质，所以只是推测其为微小体或配子。而且只有这种现象发生以后，这些孢子才能发育成母细胞，接着放出营养孢子(子细胞)，完成生活周期。Puel等[9]在研究存在于P. wickerhamii外壁中的具抗性的生物高聚物PRP一文中也附有P. wickerhamii表面有疣状突起的电镜照片，但未作解释。Arif S. El-Ani报道[10]P. wickerhamii的生活周期为核分裂的同时伴随细胞增大，随之胞质分裂，最后被细胞壁包住形成似亲孢子。其后的关于P. wickerhamii的生长周期的报道也认为P. wickerhamii不具有有性繁殖方式，那么认为突起是配子之说看来是行不通的。
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图5 扫描电镜下白鲜碱处理组
P. wickerhamii细胞 SEM×1 090
Figure 5 P. wickerhamii cells treated with dictamnine
under scanning electronic microscope SEM×1 090
笔者所用的实验材料为培养了几代的旺盛生长的孢子及休眠孢子，在正常细胞中未见上述的细胞表面突起现象，只在澳洲茄胺处理组出现了类似现象。如果认为突起的形成是生活周期中的一个必经阶段，那是否能认为澳洲茄胺能使孢子被抑制在这一阶段？这种可能性不大，如Joshi曾推测表面突起的形成是由单个孢子发育成含多个内生孢子的母细胞的必经阶段，由于细胞生长是不同步的，则在镜下应可见有突起的孢子，但Joshi等所述是在休眠孢子转到新鲜培养基不久所观察到的现象，而不是孢子正常生活周期中的普遍现象，表面突起很可能只是休眠孢子对变化的培养条件的生理反应。那就说明澳洲茄胺也导致了旺盛生长的孢子产生同样的生理反应。透射电镜下未找到突起状结构，只是在内层细胞壁的位置累积大量小泡。扫描电镜下的突起与透射电镜下的小泡的产生与发展及二者的关系等问题尚需进一步实验阐明。
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图6 透射电镜下白鲜碱处理组P. wickerhamii细胞(左) TEM×6 000
Figure 6 P. wickerhamii cells treated with dictamnine under transmission electronic microscope(left) TEM×6 000
图7 透射电镜下紫檀处理组P. wickerhamii细胞(中) TEM×8 000
Figure 7 P. wickerhamii cells treated with 4′-hydroxy-3,5-dimethoxystilbene under scanning electronic microscope(middle) TEM×8 000
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图8 透射电镜下7-羟基-4′-甲氧基黄烷处理组P. wickerhamii细胞(右) TEM×20 000
Figure 8 P. wickerhamii cells treated with 7-hydroxy-4′-methoxyflavan under transmission electronic microscope(right) TEM×20 000
3.2 关于PRP
Puel等[9]报道了存在于P. wickerhamii外壁中的具抗性的生物高聚物(PRP)。PRP占藻体生物量的0.3%，PRP可能来自萜单位的聚合作用，P. wickerhamii外壁存在的PRP可能与其对药物和溶酶体有抗性相关。
笔者所用的澳洲茄胺、白鲜碱、紫檀和7-羟基-4′-甲氧基黄烷4种抗真菌天然产物通过透射电镜观察都未影响外层细胞壁的完整性，只是内层细胞壁(主要成分为多糖)被降解破坏，如紫檀处理组子细胞壁消失。这与上述的P. wickerhamii中存在PRP相符。说明这种抗真菌天然产物都对PRP不起作用。
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通过对威克海姆原藻正常和用药组细胞超微结构的观察，发现用药组细胞常表现皱缩变形，有异样结构如疣状突起等的产生，内层细胞壁易受到损伤，常产生异常细胞器，似原质体结构，严重时膜细胞器降解，是细胞走向死亡的最终反应。超微结构的观察结果所提供的形态结构变化的信息将为进一步揭示抗真菌天然产物的作用机制奠定基础。■
基金项目：中华医学基金专项人才基金和跨世纪优秀人才基金资助项目；
参考文献
[1]Ahearn DG. Medically important yeast[J]. Ann Rev Microbial, 1978, 32: 59-68
[2]Arnold P, Ahearn DG. The systematics of the genus Prototheca with a description of a new species of P. filamenta[J]. Mycologia, 1972, 64: 265-275
, 百拇医药
[3]Emmons CW, Binford CH, Utz IP, et al. Medical Mycology [M]. Philadelphia： Lea & Febiger, 1977. 511-517
[4]Sudman SM. Protothecosis. A critical review[J]. Am J Clin Pathol， 1974, 61: 10-19
[5]吴绍熙.现代医学真菌检验手册[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998. 264-266
[6]Davies RR, Spencer H, Wakelin PO. A case of human protothecosis [J]. Roy Soc Trop Hyg， 1964, 58: 448-451
, http://www.100md.com [7]Segal E, Socher R. The effect of amphotericin B on the ultrastructure of Prototheca species[J]. Mycopathelogia, 1981,76:73-77
[8]Joshi KR, Gavin JB, Wheeler EE. The ultrastructure of Prototheca wickerhamii[J]. Mycopathologia, 1975, 56: 9-13
[9]Puel F, Largeau C, Giraud G. Occurrence of a resistant biopolymer in the outer walls of the parasitic alga Prototheca wickerhamii (Chlorococcules) ultrastructural and chemical studies[J]. J Phycol, 1987, 33: 649-656
[10]Arif S El-Ami. Life cycle and variation of Prototheca wickerhamii[J]. Science, 1967, 156: 1501-1503
收稿日期：2000-01-25, 百拇医药
单位：北京大学药学院，北京 100083
关键词：威克海姆原藻；真菌；超微结构；抗真菌药(中药)；药理学；真菌；药物作用
北京医科大学学报000307 [摘 要] 目的：研究抗真菌天然产物澳洲茄胺、白鲜碱、紫檀
、7-羟基-4′-甲氧基黄烷对威克海姆原藻超微结构的影响，以期阐明药物对真菌细胞的作用机制。方法：采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察正常细胞及用药组细胞的超微结构。结果：观察到用药组细胞与正常细胞超微结构的差异。结论：为阐明药物对细胞的作用机制提供了部分依据。[中图分类号] R798.5 [文献标识码] A
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[文章编号] 1000-1530(2000)03-0219-04
Effect of four antifungal natural products
on ultrastructure of Prototheca wickerhamii
WANG Li-Da，GUO De-An，HU Ying-Qing，TU Peng-Fei，GONG Yu-Jing，ZHENG Jun-Hua
(School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To study the effect of antifungal natural products on ultrastructure of Prototheca wickerhamii and clarify the antifungal mechanism of these antifungal natural products. Methods: The ultrastructures of normal and treated P. wickerhamii cells by scanning and transmission electronic microscope were observed. Results: It was found that the morphology of the treated cells with antifungal natural products changed greatly, e.g. the damage of the inner layer of the cell wall, the degradation of the membranous organelles. Conclusion: The observation results provided some scientific data for the identification of antifungal mechanism of four natural products.
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KEY WORDS Prototheca wickerhamii; Fungi/ultrastruct; Antifungal agents(TCD)/pharmacol; Fungi/drug eff▲
威克海姆原藻(Prototheca wickerhamii)是一种分类地位一直存有争议的微生物，一说其属于真菌类，有酵母样菌落，但无出芽生殖方式，而以内生孢子进行繁殖，另外从其细胞膜的成分上也是合成甾醇类化合物作为细胞膜的框架结构，其甾醇的生物合成途径与真菌极其相近。一说其属于藻类，但又是缺乏叶绿体和淀粉核的异养生物。更有学者认为其居于二者之间[1～4]。现在大多数学者把它归为绿藻门，称为无绿藻，是绿藻的变种，失去了原有藻类的叶绿素，寄生或腐生于木材、蔬菜和粪便中，引起人皮肤、皮下组织、口腔、鼻、浆膜等处病变，统称无绿藻病(protothecosis)，偶尔可引起系统性感染[5]。临床上仍把无绿藻病归为真菌病， 用抗真菌药物治疗。自Davies等[6]1964年报道首例无绿藻病至今，全球已发现近百例且有上升趋势，对该病尚无特别有效的治疗药物，往往需要手术治疗。抗真菌天然产物对威克海姆原藻的作用迄今未见报道。
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澳洲茄胺(Solasodine)属甾体生物碱，甾体生物碱及其糖苷存在于茄科茄属(Solanum)的大多数植物中，具有包括抗真菌在内的多种生物活性。白鲜皮系Dictamnus dasycarpus (Rutaceae)的根皮，其水提物在体外对许多人类致病真菌有抑制作用，其中白鲜碱(Dictamnine)是活性最高的有效成分。经体外抗真菌试验证明，紫檀
(4′-hydroxy-3,5-dimethoxystilbene)和7-羟基-4′-甲氧基黄烷(7-hydroxy-4′-methoxyflavan)对近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须癣毛癣菌(Trichophyton gypseum)及烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)都有较好活性。, 百拇医药
我们对正常细胞及分别加入上述4种抗真菌天然产物的用药组细胞的超微结构进行了对比观察，以期阐明药物对细胞的作用机制，并为开发新的抗真菌药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
威克海姆原藻菌种由W. David Nes博士( Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University, Lubbock, Texas, USA) 赠送。
1.2 仪器、药品与试剂
1.2.1 仪器 HZQ-Q全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发公司)；超净工作台(北京半导体一厂)；扫描电子显微镜(日立HITACHI S450型)；透射电子显微镜(日立HITACHI H500型)。
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1.2.2 药品 蛋白胨(Peptone，购自DIFCO公司)；酵母提取物(Yeast Extract，购自OXOID公司)；葡萄糖(汕头市光华化学厂)；澳洲茄胺(Solasodine, 由W. David Nes博士赠送)；白鲜碱(Dictamnine, 作者从白鲜皮中提取分离得到)，紫檀
和7-羟基-4′-甲氧基黄烷由北大药学院胡迎庆硕士从剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen中提取、分离并鉴定其结构。1.2.3 试剂 均为分析纯(AR)。
1.3 方法
1.3.1 P. wickerhamii的培养 培养基为蛋白胨20 g.L-1，葡萄糖20 g.L-1，酵母提取物10 g.L-1。每100 ml培养基加1.5 ml吐温-80。每瓶接种适量细胞，终浓度为104 CFU.ml-1。置于30℃，100 r.min-1摇床培养。
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1.3.2 药物浓度的确定及收获细胞时间的确定 精确称取一定量的药品，用二甲基亚砜(DMSO)或无水乙醇溶解配成一定浓度的药液，再稀释成不同浓度。将处于对数生长期的细胞接种到含药的培养基中，以不加药物的空白培养基为阴性对照。培养细胞分别于0，2，4，6，8，10，12，24，36，48 h用UV-754分光光度计在600 nm下读取光密度值，以时间为横坐标，A600为纵坐标作生长曲线；以时间为横坐标，以抑制真菌生长的百分率为纵坐标作时间抑菌曲线。从而得到细胞进入稳定期的时间(24 h)及各药物抑制80%细胞生长的浓度(MIC80)。因此分别以各药物的MIC80作为观察药物对细胞超微结构影响的浓度，即澳洲茄胺2.5 mg.L-1，白鲜碱50 mg.L-1紫檀
32.5 mg.L-1和7-羟基-4′-甲氧基黄烷50 mg*L-1。, http://www.100md.com
1.3.3 扫描电子显微镜观察 液体培养基中生长24 h的空白对照组及加药组的细胞离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，喷碳、喷金后用扫描电子显微镜观察。
1.3.4 透射电子显微镜观察 培养细胞(培养方法同上)离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，包埋、切片、铅铀染色后用透射电子显微镜观察。
2 结果
2.1 P. wickerhamii正常细胞的超微结构
P. wickerhamii的营养孢子和休眠孢子的超微结构不同，休眠孢子内层细胞壁较厚，淀粉粒、脂粒体累积，而膜细胞器少见。营养孢子则相反，主要为膜细胞器，如线粒体、内质网等，观察结果与Joshi报道相同[8](图1，2)。正常细胞的生长繁殖周期为营养孢子长大后分裂成多个子细胞，由母细胞壁所包围，之后母细胞壁破裂，子细胞散发出来，开始新的生活周期。
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2.2 澳洲茄胺处理组细胞的超微结构
扫描电镜下可见细胞表面有疣状突起，细胞周围有许多散落的小泡，各个细胞上的突起数目、大小不等(图3)。透射电镜可见内层细胞壁及细胞膜轮廓不清，双层膜的似原质体结构高度积累，细胞器降解(图4)。
2.3 白鲜碱处理组细胞的超微结构
扫描电镜下可见细胞表面皱缩(图5)，透射电镜下见细胞因生长代谢受到影响，大都停留在含多个子细胞的大的母细胞阶段，而且由母细胞所包围的子细胞的细胞壁皱缩变形，膜细胞器降解(图6)。
2.4 紫檀
处理组细胞的超微结构扫描电镜观察可见细胞表面严重皱缩，透射电镜下发现内层细胞壁变薄，子细胞壁消失，膜细胞器降解(图7)。
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2.5 7-羟基-4′-甲氧基黄烷处理组细胞的超微结构
扫描电镜和透射电镜均可见细胞壁皱折，双层膜似原质体结构累积在内层细胞壁处，类似于E. Segal等研究两性霉素B对P. wickerhamii作用的观察结果[7]，两性霉素B引起细胞膜通透性增大[2，3]。同时可见细胞膜破损，膜细胞器降解，线粒体膨大(图8)。
图1 扫描电镜下P. wickerhamii的正常细胞(左) SEM×1 090
Figure 1 Normal P. wickerhamii cells under scanning electronic microscope(left) SEM×1 090
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图2 透射电镜下P. wickerhamii的正常细胞(中) TEM×10 000
Figure 2 Normal P. wickerhamii cells under transmission electronic microscope(middle) TEM×10 000
图3 扫描电镜下澳洲茄胺处理组P. wickerhamii细胞(右) SEM×1 860
Figure 3 P. wickerhamii cells treated with solasodine under scanning electronic microscope(right) SEM×1 860
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图4 透射电镜下澳洲茄胺处理组
P. wickerhamii细胞 TEM×20 000
Figure 4 P. wickerhamii cells treated with solasodine
under transmission electronic microscope TEM×20 000
3 讨论
3.1 关于P. wickerhamii细胞表面突起的产生与发展
Joshi等[8]于1975年首次报道了P. wickerhamii的超微结构。文中较详尽地描述了当P. wickerhamii接种到新鲜培养基上1 h以后，一些休眠孢子表面形成疣状突起，突起中含有细胞质。在这些孢子旁边可见相同大小的独立的微小体，接着这些孢子发育成含有多个子细胞的母细胞。Joshi等认为这些突起具有完整的细胞壁、细胞膜和细胞质，可能是配子。但未能证实其中是否有核物质，所以只是推测其为微小体或配子。而且只有这种现象发生以后，这些孢子才能发育成母细胞，接着放出营养孢子(子细胞)，完成生活周期。Puel等[9]在研究存在于P. wickerhamii外壁中的具抗性的生物高聚物PRP一文中也附有P. wickerhamii表面有疣状突起的电镜照片，但未作解释。Arif S. El-Ani报道[10]P. wickerhamii的生活周期为核分裂的同时伴随细胞增大，随之胞质分裂，最后被细胞壁包住形成似亲孢子。其后的关于P. wickerhamii的生长周期的报道也认为P. wickerhamii不具有有性繁殖方式，那么认为突起是配子之说看来是行不通的。
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图5 扫描电镜下白鲜碱处理组
P. wickerhamii细胞 SEM×1 090
Figure 5 P. wickerhamii cells treated with dictamnine
under scanning electronic microscope SEM×1 090
笔者所用的实验材料为培养了几代的旺盛生长的孢子及休眠孢子，在正常细胞中未见上述的细胞表面突起现象，只在澳洲茄胺处理组出现了类似现象。如果认为突起的形成是生活周期中的一个必经阶段，那是否能认为澳洲茄胺能使孢子被抑制在这一阶段？这种可能性不大，如Joshi曾推测表面突起的形成是由单个孢子发育成含多个内生孢子的母细胞的必经阶段，由于细胞生长是不同步的，则在镜下应可见有突起的孢子，但Joshi等所述是在休眠孢子转到新鲜培养基不久所观察到的现象，而不是孢子正常生活周期中的普遍现象，表面突起很可能只是休眠孢子对变化的培养条件的生理反应。那就说明澳洲茄胺也导致了旺盛生长的孢子产生同样的生理反应。透射电镜下未找到突起状结构，只是在内层细胞壁的位置累积大量小泡。扫描电镜下的突起与透射电镜下的小泡的产生与发展及二者的关系等问题尚需进一步实验阐明。
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图6 透射电镜下白鲜碱处理组P. wickerhamii细胞(左) TEM×6 000
Figure 6 P. wickerhamii cells treated with dictamnine under transmission electronic microscope(left) TEM×6 000
图7 透射电镜下紫檀
处理组P. wickerhamii细胞(中) TEM×8 000Figure 7 P. wickerhamii cells treated with 4′-hydroxy-3,5-dimethoxystilbene under scanning electronic microscope(middle) TEM×8 000
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图8 透射电镜下7-羟基-4′-甲氧基黄烷处理组P. wickerhamii细胞(右) TEM×20 000
Figure 8 P. wickerhamii cells treated with 7-hydroxy-4′-methoxyflavan under transmission electronic microscope(right) TEM×20 000
3.2 关于PRP
Puel等[9]报道了存在于P. wickerhamii外壁中的具抗性的生物高聚物(PRP)。PRP占藻体生物量的0.3%，PRP可能来自萜单位的聚合作用，P. wickerhamii外壁存在的PRP可能与其对药物和溶酶体有抗性相关。
笔者所用的澳洲茄胺、白鲜碱、紫檀
和7-羟基-4′-甲氧基黄烷4种抗真菌天然产物通过透射电镜观察都未影响外层细胞壁的完整性，只是内层细胞壁(主要成分为多糖)被降解破坏，如紫檀处理组子细胞壁消失。这与上述的P. wickerhamii中存在PRP相符。说明这种抗真菌天然产物都对PRP不起作用。, 百拇医药
通过对威克海姆原藻正常和用药组细胞超微结构的观察，发现用药组细胞常表现皱缩变形，有异样结构如疣状突起等的产生，内层细胞壁易受到损伤，常产生异常细胞器，似原质体结构，严重时膜细胞器降解，是细胞走向死亡的最终反应。超微结构的观察结果所提供的形态结构变化的信息将为进一步揭示抗真菌天然产物的作用机制奠定基础。■
基金项目：中华医学基金专项人才基金和跨世纪优秀人才基金资助项目；
参考文献
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收稿日期：2000-01-25, 百拇医药