钆离子对巨噬细胞和癌细胞生长过程的影响——微量量热法研究
作者：红枫 卢景芬 董晓敏 古力努尔 谭安民 苏雅娴 王夔
单位：红枫 卢景芬 古力努尔 谭安民 王夔(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)；董晓敏 苏雅娴(细胞生物学系)
关键词：钆；药理学；巨噬细胞；药物作用；肿瘤细胞；培养的；药物作用；量热法；癌；肝细胞
北京医科大学学报000304 [摘 要] 目的:探讨Gd3+对大鼠和小鼠腹水巨噬细胞、小鼠腹水肝癌H22细胞和人肝癌细胞BEL-7402 的生长过程的影响。方法：用LKB-2277量热活性检测仪测定37℃时细胞在加和不加Gd3+的介质中的产热过程的差异。结果：1.0×10-4 mol.L-1 Gd3+对4种细胞的代谢开始都有明显促进,70 min时达到产热高峰。虽然总热效应都有增加,但是癌细胞增加的比值明显小于巨噬细胞的。结论：本实验中,在初始时Gd3+可以促进4种细胞的产热,从热效应曲线变化推测Gd3+离子可能在后期使癌细胞损伤,活性降低。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R977.5 [文献标识码]A [文章编号] 1000-1530(2000)03-0207-03
Effects of Gadolinium on the growth of macrophages
and cancer cells observed by microcalorimetry
HONG Feng，LU Jing-Fen，Gulinuer，TAN An-Min，WANG Kui
(National Research Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,Peking University,Beijing 100083, China)
DONG Xiao-Min，SU Ya-Xian
, 百拇医药
(Department of Cell Biology)
ABSTRACT Objective: To study the effects of gadolinium on the growth of macrophages and cancer cells. Methods: LKB-2277 microcalorimeter was used to measure the different processes of heat production during cell metabolism which administrated with or without Gd3+ at 37℃. Results: 1.0×10-4 mol.L-1 of Gd3+ promoted the metabolism of all experimental cells at the beginning, and it reached the highest value in about 70 min. However, the increasing ratio of heat production of cancer cells was smaller than that of macrophages. Conclusion:Under our experimental conditions, Gd3+ can increase the heat production of all four kinds of cells at the beginning. From thermogenesis curves we speculate that Gd3+ may damage cancer cells and decrease their activities in the later stage.
, 百拇医药
KEY WORDS Gadolinium/pharmacol; Macrophages/drug eff; Tumor cells, cultured/drug eff; Calorimetry; Carcinoma, hepatocellular▲
最近Mizgerd等[1]报告稀土离子能够促进巨噬细胞凋亡。王玺等[2]发现氯化铈和氯化钆能诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡。 稀土离子诱导细胞凋亡的机制虽然还不清楚, 但是已经发现LaCl3或CeCl3与PAMC82胃癌细胞温育能够促进p53, p16(MTS1)和p21(WAF1)的表达[3]。有意义的是人们在研究中发现，稀土离子在能促进正常细胞生长的浓度下,促进癌细胞凋亡[4]。基于以上结果,稀土能否有选择性地促使癌细胞凋亡, 以及稀土能否促进正常细胞生长而不对或少对癌细胞的生长表现促进作用, 便成为一个重要问题。我们用量热法测定细胞生长过程中代谢产生的热效应,以揭示Gd3+对正常巨噬细胞和癌细胞生长和死亡的影响。结果表明Gd3+对这些细胞株的热代谢在初期都有促进。相对地促进癌细胞热产生的作用较小, 但后期有促进癌细胞损伤和死亡的可能。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂和材料
氯化钆储备液的配制,加热溶解氧化钆(99.99%，北京化工厂)于5 mol.L-1盐酸， 然后加热赶去多余HCl，用EDTA二钠盐溶液滴定钆的浓度。在所用的温育溶液中钆的终浓度为1.0×10-4 mol.L-1。
细胞培养介质：RPMI 1640 (Gibco), 含100 IU.ml-1青霉素,100 IU.ml-1链霉素和10%(体积分数)小牛血清。量热实验温育介质：Hepes缓冲溶液, 含140 mmol.L-1 NaCl, 5 mmol.L-1 KCl, 1 mmol.L-1 MgCl2, 5.5 mmol.L-1葡萄糖,10 mmol.L-1 Hepes, pH7.4。所有试剂均为分析纯。
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1.2 细胞的分离
昆明小鼠(30 g)和Wistar大鼠(250 g)购自北京大学医学部实验动物科学部(No.1999-005)。巨噬细胞是从腹腔注射1%(质量百分比)蛋白胨生理盐水溶液12 h后的小鼠和大鼠腹水中分离的(分别表示为Mφ1和Mφ2)，在4℃下用生理盐水离心洗细胞3次后进行实验。肝癌细胞是从接种H22细胞株3 d后的小鼠腹水中分离的，同样洗涤3次。人肝癌细胞株BEL-7402来自北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室药理室。进行量热测定的细胞悬液的细胞浓度约为每毫升106个细胞。
1.3 实验方法
微量量热法测定细胞的放热过程。用LKB-2277 (Thermometric,Jarfalla, Sweden)量热活性检测仪测定在37℃,细胞在加和不加1.0×10-4 mol.L-1Gd3+的介质中的产热过程。按照文献[5，6]方法进行测定和数据处理。900 μl细胞悬液加100 μl 1.0×10-3 mol.L-1 Gd3+(对照组加等体积的生理盐水)移入3 ml玻璃安瓿中混匀，密封，然后将安瓿放入量热计。开始记录以前的滞后期大约50 min。单个细胞产热量C0用产热曲线的峰值h除以细胞总数，单位是pW/cell (10-12 W/cell)。在测量过程中总热效应C(nJ，即10-9焦耳)由产热曲线积分面积求得，每组实验重复3次。
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2 结果与讨论
图1，2给出两种细胞Mφ1和H22在有Gd3+(1.0×10-4 mol.L-1)和无Gd3+的介质中温育过程中的产热曲线。其余Mφ2和BEL细胞的产热曲线分别与Mφ1和H22有相似的变化趋势。从产热曲线计算出的C和C0列入表1中。
图1 小鼠巨噬细胞Mφ1在有Gd3+(b)
和无Gd3+(a) 的情况下的产热曲线
Figure 1 Thermogenesis curves of mouse macrophage
, 百拇医药
activated with (b) or without (a) Gd3+
图2 小鼠腹水肝癌细胞H22在有Gd3+ (b)
和无Gd3+(a)的情况下的产热曲线
Figure 2 Thermogenesis curves of H22 cells activated
with (b) or without (a) Gd3+
由产热曲线可见加入Gd3+在起始时对几种细胞热代谢都有明显的增强作用。与对照相比Gd3+使巨噬细胞代谢加速, 产热迅速增长。小鼠巨噬细胞比大鼠巨噬细胞的总热效应略大。这一差别可能与Singer等[7]所证明的哺乳动物体重越大, 血的基础代谢率越低有关，但是Gd3+激活这两种巨噬细胞所造成的产热增长比值基本相同 (分别为8.4和8.5)。相比之下,两种癌细胞在无Gd3+时产热都较高，反映生长代谢速度比巨噬细胞快，而且BEL细胞比H22细胞基础产热量略高。不过癌细胞中加入Gd3+后总热效应增加比值比巨噬细胞的小, 但是两种癌细胞总热效应的增长比值基本相同 (分别为2.25及2.31)。
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从Mizgerd[1]的结果可见, 巨噬细胞对于稀土离子的应答起始于吞噬作用, 然后导致细胞凋亡。另外有报告指出稀土离子在低浓度下促进吞噬作用[8]。图1产热曲线表明这一过程中的热效应, 即开始吞噬作用的增强, 达到高峰后曲线迅速下降回到基础代谢水平。 两种癌细胞的热代谢同样也被Gd3+所促进, 在起始阶段以高速度增长, 只是达到高峰后迅速下降甚至低于对照，这可以解释为Gd3+对癌细胞生长的抑制作用。
表1 在有1.0×10-4 mol.L-1 Gd3+
和无Gd3+的介质中细胞的热效应参数(n=3)
Table 1 The calorimetric parameters of cells activated
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with or without gadolinium ions(n=3) C0 and C
Heat production rate
(pW/cell)
Total heat effect
(nJ/cell)
Mφ1
1.67±0.38
5.0±0.9
Mφ1+Gd3+
9.37±1.36
, 百拇医药
42.0±2.9
Mφ2
1.00±0.23
3.6±0.7
Mφ2+Gd3+
10.20±1.42
30.7±2.9
H22
9.10±1.10
19.2±2.1
H22+Gd3+
, 百拇医药
17.21±1.52
43.0±3.5
BEL
19.13±2.53
40.1±3.1
BEL+Gd3+
38.75±3.32
93.0±5.5
Mouse macrophages Mφ1 ( 2.2×106 cells/ml ), H22 (1.3×106 cells/ml), rat macrophages Mφ2 (2.2×106 cells / ml ) and BEL-7402 cell ( 8.9×105 cells / ml ) activated with or without gadolinium ions ( 1.0×10-4 mol.L-1).
, 百拇医药
由以上结果和讨论我们可以得到这样的结论, 在本文实验条件下Gd3+对小鼠和大鼠的巨噬细胞，大鼠肝癌H22细胞和人BEL肝癌细胞在一定时间内都有促进细胞热代谢的作用, 表现为放热过程在开始时迅速增加。 但是热效应因细胞而异, Gd3+对于巨噬细胞的促进作用远大于癌细胞的, 这可能与稀土离子增强吞噬作用有关。对于巨噬细胞, 产热达到高峰后迅速下降到与对照相同; 但是对于两种癌细胞, 则下降到低于对照水平, 这可能是由于作用后期Gd3+对癌细胞生长的抑制作用。■
基金项目：国家自然科学基金重大课题(29890280)资助；
红枫(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
古力努尔(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
, http://www.100md.com
谭安民(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
(细胞生物学系)
王夔(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
参考文献
[1]Mizgerd JP, Molina RM, Stearns RC, et al. Gadolinium induces macrophage apoptosis[J]. Leukocyte Biol,1996, 59:189-195
[2]王 玺，安丽芝，章净霞. 铈和钆对体外培养正常二倍体细胞的作用[J].中国稀土学报，1998,16(3)：252-256
[3]萧 白，纪云晶，崔明珍,等. 镧铈对癌细胞恶性增殖及其相关基因表达的影响[J]. 中国预防医学杂志，1997，31(4)：228-230
, http://www.100md.com
[4]申治国，雷衡毅，杜柳涛，等.铈对培养肝细胞的影响[J].中山大学学报，1999，38(3)：109-112
[5]Suurkuusk J, Wadso I. A multichannel microcalorimetric system[J]. Chem Scr, 1982，20:155-163
[6]Tan AM, Xu B, Huang SQ, et al. Thermochemical study on the growth metabolism of human promyelocytic leukemia HL-60 cells inhibited by water-soluble metalloporphyrins[J]. Thermochim Acta, 1999， 333:99-102
[7]Singer D, Schunck U, Bach F, et al. Body size allometry of mammalian blood heat output as assessed by microcalorimetry[J]. Thermochim Acta, 1993，229:133-145
[8]陈兴安，贺秋晨，关 腾，等.小剂量柠檬酸稀土对小鼠中性多形核白细胞吞噬功能的影响[J].中国稀土学报，1995,13(1):70-73
收稿日期：2000-01-31, http://www.100md.com
单位：红枫 卢景芬 古力努尔 谭安民 王夔(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)；董晓敏 苏雅娴(细胞生物学系)
关键词：钆；药理学；巨噬细胞；药物作用；肿瘤细胞；培养的；药物作用；量热法；癌；肝细胞
北京医科大学学报000304 [摘 要] 目的:探讨Gd3+对大鼠和小鼠腹水巨噬细胞、小鼠腹水肝癌H22细胞和人肝癌细胞BEL-7402 的生长过程的影响。方法：用LKB-2277量热活性检测仪测定37℃时细胞在加和不加Gd3+的介质中的产热过程的差异。结果：1.0×10-4 mol.L-1 Gd3+对4种细胞的代谢开始都有明显促进,70 min时达到产热高峰。虽然总热效应都有增加,但是癌细胞增加的比值明显小于巨噬细胞的。结论：本实验中,在初始时Gd3+可以促进4种细胞的产热,从热效应曲线变化推测Gd3+离子可能在后期使癌细胞损伤,活性降低。
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[中图分类号] R977.5 [文献标识码]A [文章编号] 1000-1530(2000)03-0207-03
Effects of Gadolinium on the growth of macrophages
and cancer cells observed by microcalorimetry
HONG Feng，LU Jing-Fen，Gulinuer，TAN An-Min，WANG Kui
(National Research Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,Peking University,Beijing 100083, China)
DONG Xiao-Min，SU Ya-Xian
, 百拇医药
(Department of Cell Biology)
ABSTRACT Objective: To study the effects of gadolinium on the growth of macrophages and cancer cells. Methods: LKB-2277 microcalorimeter was used to measure the different processes of heat production during cell metabolism which administrated with or without Gd3+ at 37℃. Results: 1.0×10-4 mol.L-1 of Gd3+ promoted the metabolism of all experimental cells at the beginning, and it reached the highest value in about 70 min. However, the increasing ratio of heat production of cancer cells was smaller than that of macrophages. Conclusion:Under our experimental conditions, Gd3+ can increase the heat production of all four kinds of cells at the beginning. From thermogenesis curves we speculate that Gd3+ may damage cancer cells and decrease their activities in the later stage.
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KEY WORDS Gadolinium/pharmacol; Macrophages/drug eff; Tumor cells, cultured/drug eff; Calorimetry; Carcinoma, hepatocellular▲
最近Mizgerd等[1]报告稀土离子能够促进巨噬细胞凋亡。王玺等[2]发现氯化铈和氯化钆能诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡。 稀土离子诱导细胞凋亡的机制虽然还不清楚, 但是已经发现LaCl3或CeCl3与PAMC82胃癌细胞温育能够促进p53, p16(MTS1)和p21(WAF1)的表达[3]。有意义的是人们在研究中发现，稀土离子在能促进正常细胞生长的浓度下,促进癌细胞凋亡[4]。基于以上结果,稀土能否有选择性地促使癌细胞凋亡, 以及稀土能否促进正常细胞生长而不对或少对癌细胞的生长表现促进作用, 便成为一个重要问题。我们用量热法测定细胞生长过程中代谢产生的热效应,以揭示Gd3+对正常巨噬细胞和癌细胞生长和死亡的影响。结果表明Gd3+对这些细胞株的热代谢在初期都有促进。相对地促进癌细胞热产生的作用较小, 但后期有促进癌细胞损伤和死亡的可能。
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1 材料与方法
1.1 试剂和材料
氯化钆储备液的配制,加热溶解氧化钆(99.99%，北京化工厂)于5 mol.L-1盐酸， 然后加热赶去多余HCl，用EDTA二钠盐溶液滴定钆的浓度。在所用的温育溶液中钆的终浓度为1.0×10-4 mol.L-1。
细胞培养介质：RPMI 1640 (Gibco), 含100 IU.ml-1青霉素,100 IU.ml-1链霉素和10%(体积分数)小牛血清。量热实验温育介质：Hepes缓冲溶液, 含140 mmol.L-1 NaCl, 5 mmol.L-1 KCl, 1 mmol.L-1 MgCl2, 5.5 mmol.L-1葡萄糖,10 mmol.L-1 Hepes, pH7.4。所有试剂均为分析纯。
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1.2 细胞的分离
昆明小鼠(30 g)和Wistar大鼠(250 g)购自北京大学医学部实验动物科学部(No.1999-005)。巨噬细胞是从腹腔注射1%(质量百分比)蛋白胨生理盐水溶液12 h后的小鼠和大鼠腹水中分离的(分别表示为Mφ1和Mφ2)，在4℃下用生理盐水离心洗细胞3次后进行实验。肝癌细胞是从接种H22细胞株3 d后的小鼠腹水中分离的，同样洗涤3次。人肝癌细胞株BEL-7402来自北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室药理室。进行量热测定的细胞悬液的细胞浓度约为每毫升106个细胞。
1.3 实验方法
微量量热法测定细胞的放热过程。用LKB-2277 (Thermometric,Jarfalla, Sweden)量热活性检测仪测定在37℃,细胞在加和不加1.0×10-4 mol.L-1Gd3+的介质中的产热过程。按照文献[5，6]方法进行测定和数据处理。900 μl细胞悬液加100 μl 1.0×10-3 mol.L-1 Gd3+(对照组加等体积的生理盐水)移入3 ml玻璃安瓿中混匀，密封，然后将安瓿放入量热计。开始记录以前的滞后期大约50 min。单个细胞产热量C0用产热曲线的峰值h除以细胞总数，单位是pW/cell (10-12 W/cell)。在测量过程中总热效应C(nJ，即10-9焦耳)由产热曲线积分面积求得，每组实验重复3次。
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2 结果与讨论
图1，2给出两种细胞Mφ1和H22在有Gd3+(1.0×10-4 mol.L-1)和无Gd3+的介质中温育过程中的产热曲线。其余Mφ2和BEL细胞的产热曲线分别与Mφ1和H22有相似的变化趋势。从产热曲线计算出的C和C0列入表1中。
图1 小鼠巨噬细胞Mφ1在有Gd3+(b)
和无Gd3+(a) 的情况下的产热曲线
Figure 1 Thermogenesis curves of mouse macrophage
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activated with (b) or without (a) Gd3+
图2 小鼠腹水肝癌细胞H22在有Gd3+ (b)
和无Gd3+(a)的情况下的产热曲线
Figure 2 Thermogenesis curves of H22 cells activated
with (b) or without (a) Gd3+
由产热曲线可见加入Gd3+在起始时对几种细胞热代谢都有明显的增强作用。与对照相比Gd3+使巨噬细胞代谢加速, 产热迅速增长。小鼠巨噬细胞比大鼠巨噬细胞的总热效应略大。这一差别可能与Singer等[7]所证明的哺乳动物体重越大, 血的基础代谢率越低有关，但是Gd3+激活这两种巨噬细胞所造成的产热增长比值基本相同 (分别为8.4和8.5)。相比之下,两种癌细胞在无Gd3+时产热都较高，反映生长代谢速度比巨噬细胞快，而且BEL细胞比H22细胞基础产热量略高。不过癌细胞中加入Gd3+后总热效应增加比值比巨噬细胞的小, 但是两种癌细胞总热效应的增长比值基本相同 (分别为2.25及2.31)。
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从Mizgerd[1]的结果可见, 巨噬细胞对于稀土离子的应答起始于吞噬作用, 然后导致细胞凋亡。另外有报告指出稀土离子在低浓度下促进吞噬作用[8]。图1产热曲线表明这一过程中的热效应, 即开始吞噬作用的增强, 达到高峰后曲线迅速下降回到基础代谢水平。 两种癌细胞的热代谢同样也被Gd3+所促进, 在起始阶段以高速度增长, 只是达到高峰后迅速下降甚至低于对照，这可以解释为Gd3+对癌细胞生长的抑制作用。
表1 在有1.0×10-4 mol.L-1 Gd3+
和无Gd3+的介质中细胞的热效应参数(n=3)
Table 1 The calorimetric parameters of cells activated
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with or without gadolinium ions(n=3) C0 and C
Heat production rate
(pW/cell)
Total heat effect
(nJ/cell)
Mφ1
1.67±0.38
5.0±0.9
Mφ1+Gd3+
9.37±1.36
, 百拇医药
42.0±2.9
Mφ2
1.00±0.23
3.6±0.7
Mφ2+Gd3+
10.20±1.42
30.7±2.9
H22
9.10±1.10
19.2±2.1
H22+Gd3+
, 百拇医药
17.21±1.52
43.0±3.5
BEL
19.13±2.53
40.1±3.1
BEL+Gd3+
38.75±3.32
93.0±5.5
Mouse macrophages Mφ1 ( 2.2×106 cells/ml ), H22 (1.3×106 cells/ml), rat macrophages Mφ2 (2.2×106 cells / ml ) and BEL-7402 cell ( 8.9×105 cells / ml ) activated with or without gadolinium ions ( 1.0×10-4 mol.L-1).
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由以上结果和讨论我们可以得到这样的结论, 在本文实验条件下Gd3+对小鼠和大鼠的巨噬细胞，大鼠肝癌H22细胞和人BEL肝癌细胞在一定时间内都有促进细胞热代谢的作用, 表现为放热过程在开始时迅速增加。 但是热效应因细胞而异, Gd3+对于巨噬细胞的促进作用远大于癌细胞的, 这可能与稀土离子增强吞噬作用有关。对于巨噬细胞, 产热达到高峰后迅速下降到与对照相同; 但是对于两种癌细胞, 则下降到低于对照水平, 这可能是由于作用后期Gd3+对癌细胞生长的抑制作用。■
基金项目：国家自然科学基金重大课题(29890280)资助；
红枫(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
古力努尔(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京 100083)
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参考文献
[1]Mizgerd JP, Molina RM, Stearns RC, et al. Gadolinium induces macrophage apoptosis[J]. Leukocyte Biol,1996, 59:189-195
[2]王 玺，安丽芝，章净霞. 铈和钆对体外培养正常二倍体细胞的作用[J].中国稀土学报，1998,16(3)：252-256
[3]萧 白，纪云晶，崔明珍,等. 镧铈对癌细胞恶性增殖及其相关基因表达的影响[J]. 中国预防医学杂志，1997，31(4)：228-230
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[4]申治国，雷衡毅，杜柳涛，等.铈对培养肝细胞的影响[J].中山大学学报，1999，38(3)：109-112
[5]Suurkuusk J, Wadso I. A multichannel microcalorimetric system[J]. Chem Scr, 1982，20:155-163
[6]Tan AM, Xu B, Huang SQ, et al. Thermochemical study on the growth metabolism of human promyelocytic leukemia HL-60 cells inhibited by water-soluble metalloporphyrins[J]. Thermochim Acta, 1999， 333:99-102
[7]Singer D, Schunck U, Bach F, et al. Body size allometry of mammalian blood heat output as assessed by microcalorimetry[J]. Thermochim Acta, 1993，229:133-145
[8]陈兴安，贺秋晨，关 腾，等.小剂量柠檬酸稀土对小鼠中性多形核白细胞吞噬功能的影响[J].中国稀土学报，1995,13(1):70-73
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