骨骼肌高表达质粒VR/TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验
作者：魏旭东 伏爽 韩安平 程康 武莎莎 王申五 王德炳
单位：北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044
关键词：血小板生成素；基因表达；基因转移；质粒；CHO细胞
北京医科大学学报000321 [摘 要] 目的：构建肌肉高表达质粒VR/TPO，将其在体外定量表达，并初步了解其体内表达活性。方法：以重组TPO cDNA为目的基因，构建人VR/TPO高效表达质粒，用脂质体法将其转染CHO 细胞，RT-PCR法检测mRNA表达，ELISA法检测TPO的表达量，并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果：VR/TPO可在CHO中高效表达，其表达量超过pcDNA3TPO,并初步发现有促进血小板增加作用。结论：VR/TPO为一高效表达TPO质粒，在体内外都有一定表达活性。
[中图分类号] R979.5 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0269-03
Transfection and expression of VR/TPO gene in vitro and in vivo
WEI Xu-Dong, FU Shuang, HAN An-Ping, WU Sha-Sha,CHENG Kang, WANG Shen-Wu, WANG De-Bing
(Institute of Hematology, People's Hospital, Peking University, Beijing 100044)
ABSTRACT Objective: To obtain the construct of cDNA TPO, in order to transfer and express it in CHO cell and Balb/c mouse. Methods: The eukaryotic muscular expression vector VR1012/TPO was constructed with human recombinant TPO cDNA as the therapy gene to transfect the CHO cell and directly inject it to BALB/C mouse. Results: CHO cells could be transferred with VR/TPO and highly express TPO protein. VR/TPO was found to promote megakaryocytics in BALB/C mouse. Conclusion: VR/TPO is a good vector to express TPO protein and also can be given directly by muscular injection.
, 百拇医药
KEY WORDS Thrombopoietin； Gene transfer； Gene expression； Plasmids; CHO cells▲
基因治疗常用的载体有病毒载体和非病毒载体[1]，肌注质粒DNA是一种简单有效的非病毒载体基因治疗方法，在临床上已成功地用于流感疫苗和乙肝疫苗等基因疫苗的预防接种，得到理想效果，而用于造血因子促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)的导入却未见报道，现将骨骼肌高表达质粒VR/TPO的体外和动物体内表达的初步结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 VR/TPO的构建
从PUC118TPO上切下TPO cDNA片段[2],此片段为全长TPO基因序列，1 060 bp,经PEGM-7Zf载体亚克隆后，导入VR1012质粒,VR1012质粒4.9 kb,为骨骼肌高表达质粒，由美国Vical公司Manthorpe教授惠赠[3],构建成所需的VR/TPO质粒。
, http://www.100md.com
1.2 VR/TPO质粒的大量提取
用醋酸铵法提取VR/TPO质粒[4]，因筛选标志为卡那霉素抗性基因，因此Luria-Bertani培养基中加入50 mg.L-1的卡那霉素。
1.3 VR/TPO转染CHO细胞
CHO细胞为本室冻存复苏而来。转染试剂脂质体DOTAP为宝灵曼公司产品，货号NO181177 。转染方法：CHO细胞用DMEM完全培养基培养，转染前一天传代，次日细胞达70%融合，分别转染VR1012，VR/TPO，pcDNA3TPO质粒各5 μg，每个样品与DOTAP 30 μl混匀，37℃，5%(体积分数)CO2转染9 h，后吸弃原培养基，继续培养72 h。
1.4 转染产物的鉴定
, 百拇医药
1.4.1 RT-PCR检测转染细胞的mRNA的表达 总RNA提取用Trizol试剂盒，详见说明书。逆转录反应体系：RNA 2 μl，MMLV 1 μl， DTT 2 μl,Rnasin 0.5 μl， dNTP 2 μl，随机引物1 μl,缓冲液4 μl,5倍稀释，混匀，37℃，1 h。PCR: 引物借助NBI之 Oligo primer analysis software, version 5.0 for windows 设计，委托Cybersyn公司合成，其互补DNA序列在TPO cDNA 中结合位置在161～657 bp。TPO上游及下游引物为5′-ACCCCTTTGCCC-
TACACCTGTC-3′,及5′CAGAAGCCCAGAGCCC-
AGTA-3′扩增产物片段为497 bp(β-actin作为内参照，扩增产物为300 bp片段。体系：Taq酶0.3 u,上下游引物各2.0 μl，缓冲液2 μl，10倍稀释，反转录产物2 μl,dNTP 2.5 μl。PCR反应：94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃后延伸5 min。
, http://www.100md.com
1.4.2 酶标双抗体夹心法定量检测TPO表达 应用Quantikine Human TPO Immunoassay 试剂盒 (R&D公司试剂盒编号DTPOO)。每孔加入检测稀释液RD1-20 50 μl,待测标本200 μl,充分混匀，4℃孵育3 h。漂洗缓冲液充分漂洗4次。每孔中加入TPO结合物200 μl,4℃孵育1 h,漂洗缓冲液充分漂洗4次,每孔中加入底物液200 μl，室温孵育30 min，每孔中加入中止液50 μl，混匀。30 min内450 nm测定OD值。
1.4.3 MTT法检测表达TPO的活性 用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养HEL细胞(HEL细胞为本室保存)，用培养物表达产物上清刺激HEL细胞系增殖。
1.5 动物实验
BALB/C小鼠购自本校实验动物中心，6～8周龄。实验分组：(1)对照组，6只，肌注VR1012质粒100 μg；(2)实验组1， 6只，每次注射VR/TPO 100 μg；(3)实验组2， 6只， 分3次肌注300 μg VR/TPO。注射方法：胫前肌肉多位点(>4个)，注射方向与肌纤维垂直，肌注前按摩局部肌肉。
, http://www.100md.com
2 结果
VR/TPO质粒的酶切鉴定结果经过EcoRⅠ,XbaⅠ酶切，证明为VR/TPO质粒(图1)。
RT-PCR检测mRNA表达结果见图2。VR1012 ，PcDNA3TPO 及VR/TPO转染细胞均可见318 bp的β-actin扩增产物，但仅pcDNA3TPO和VR/TPO转染细胞可见约500 bp扩增条带,提示转染导入细胞在 mRNA水平表达。
1， λDNA/HindⅢ markers； 2， VR/TPO/XbaⅠ； 3， VR/TPO/XbaⅠ+EcoRⅠ; 4, TPO cDNA; 5, VR/TPO plasmid.
图1 VR/TPO酶切鉴定结果
, 百拇医药
Figure 1 Restriction analysis of VR/TPO
TPO的表达定量检测，亲本CHO细胞和转染VR1012的细胞为0，VR/TPO为2 400 ng.L-1,pcDNA3TPO为1 100 ng.L-1。
Lane 1, PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ markers； Lane2， transfected CHO with VR1012; Lane 3, transfected CHO cells with VR/TPO; Lane 4, transfected CHO cells with PcDNA3TPO.
图2 RT-PCR检测VR/TPO在CHO细胞瞬时表达
, 百拇医药
Figure 2 RT-PCR examination of the transient expression
of VR/TPO in CHO cells
MTT检测定性表达结果发现VR/TPO,pcDNA3TPO光密度明显高于VR1012组，表明有活性TPO生成。其光密度值分别为0.23,0.15,0.005。
肌注小鼠引起的血小板升高反应，对照组肌注前血小板计数为(24.2±3.5)×109 L-1,肌注后为(28.3±5.8)×109 L-1 (P>0.05)。实验组1:肌注前为(29.2±4.4)×109 L-1肌注后(32.6±6.3)×109 L-1 (P>0.05)。 实验组2:肌注前为(28.7±4.5)×109 L-1肌注后为(48.2±6.3)×109 L-1(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
临床上肿瘤和白血病化疗均可引起严重的血小板减少，从而引起机体严重的出血并发症，血小板输注可取得疗效，但血小板不易保存，且来源有限，长期输注会引起机体产生抗体，因此应用TPO治疗有望成为最有效的治疗手段之一。TPO制作工艺复杂，价格昂贵，应用受到限制，TPO基因的克隆成功，使人们想到TPO的基因治疗。目前关于TPO的基因治疗报道较少。这是由于TPO可以使机体产生中和抗体，甚至有报道TPO能引起白血病细胞增殖。如果表达过量还会导致骨髓纤维化，骨硬化等副作用。基因治疗的载体有病毒载体和非病毒载体，非病毒载体中直接肌注质粒DNA为基因治疗的简便有效的方法，不会像病毒那样激活诱发机体对载体发生免疫反应，不易合到基因组DNA中，而且制备过程较病毒载体简便[5]，但也有需要质粒量多、表达不稳定等缺点。VR/TPO是由VR1012载体与TPO cDNA 片段构建而成，而VR1012来源于V1J, V1J是真核细胞表达载体，其带有CMVIE1启动子/增强子。BGH多聚腺苷信号，能在骨骼肌细胞中高产量表达。VR1012是将V1J的氨苄青霉素抗性改为卡那霉素抗性基因。
, 百拇医药
本文用VR/TPO瞬时转染CHO细胞对其进行mRNA水平的鉴定和蛋白质水平的定量和定性鉴定，结果发现TPO表达达2 400 ng.L-1，比真核高效表达质粒pcDNA3TPO高一倍多(pcDNA3表达量为1 100 ng.L-1)，说明VR/TPO为高效表达载体。直接将VR/TPO给小鼠肌注，结果发现100 μg一次注射不能引起小鼠血小板明显升高，而高剂量(300 μg)多位点分次垂直于肌纤维注射可引起小鼠血小板增高。但由于肌注质粒量较多，并需多次注射，故仍应改进此技术，例如并用电穿孔法、脂质体法、高渗葡萄糖和肌肉变性剂注射以提高TPO的表达效率。总之，本文的研究揭示了基因治疗的非病毒载体质粒可以在体内体外高效表达，从而使有生物活性的TPO蛋白表达，随着转染技术和载体的改进，应取得更好的疗效。■
参考文献
[1]Mongomcry DL, Shiver JW, Leander ER, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination optionization of DNA vector[J]. DNA Cell Biol， 1993,1:777-783
, 百拇医药
[2]侯纬敏，陆爱丽，岱美如.分子克隆人血小板生成素基因[J].北京医科大学学报，1996，28，1-3
[3]Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, et al. An improved plasmid DNA vector for direct injection into skeletal muscle[J]. Hum Gene Ther, 1996,7:1205-1219
[4]Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high quality plasmid[J]. DNA Biotechniques， 1990,9:676-679
[5]Davis HL, Whalen RG, Demeneix BA， et al. Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo factors affecting efficiency of transfer and stability of expression[J]. Human Gene Ther， 1993,4:151-159
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药
单位：北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044
关键词：血小板生成素；基因表达；基因转移；质粒；CHO细胞
北京医科大学学报000321 [摘 要] 目的：构建肌肉高表达质粒VR/TPO，将其在体外定量表达，并初步了解其体内表达活性。方法：以重组TPO cDNA为目的基因，构建人VR/TPO高效表达质粒，用脂质体法将其转染CHO 细胞，RT-PCR法检测mRNA表达，ELISA法检测TPO的表达量，并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果：VR/TPO可在CHO中高效表达，其表达量超过pcDNA3TPO,并初步发现有促进血小板增加作用。结论：VR/TPO为一高效表达TPO质粒，在体内外都有一定表达活性。
[中图分类号] R979.5 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0269-03
Transfection and expression of VR/TPO gene in vitro and in vivo
WEI Xu-Dong, FU Shuang, HAN An-Ping, WU Sha-Sha,CHENG Kang, WANG Shen-Wu, WANG De-Bing
(Institute of Hematology, People's Hospital, Peking University, Beijing 100044)
ABSTRACT Objective: To obtain the construct of cDNA TPO, in order to transfer and express it in CHO cell and Balb/c mouse. Methods: The eukaryotic muscular expression vector VR1012/TPO was constructed with human recombinant TPO cDNA as the therapy gene to transfect the CHO cell and directly inject it to BALB/C mouse. Results: CHO cells could be transferred with VR/TPO and highly express TPO protein. VR/TPO was found to promote megakaryocytics in BALB/C mouse. Conclusion: VR/TPO is a good vector to express TPO protein and also can be given directly by muscular injection.
, 百拇医药
KEY WORDS Thrombopoietin； Gene transfer； Gene expression； Plasmids; CHO cells▲
基因治疗常用的载体有病毒载体和非病毒载体[1]，肌注质粒DNA是一种简单有效的非病毒载体基因治疗方法，在临床上已成功地用于流感疫苗和乙肝疫苗等基因疫苗的预防接种，得到理想效果，而用于造血因子促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)的导入却未见报道，现将骨骼肌高表达质粒VR/TPO的体外和动物体内表达的初步结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 VR/TPO的构建
从PUC118TPO上切下TPO cDNA片段[2],此片段为全长TPO基因序列，1 060 bp,经PEGM-7Zf载体亚克隆后，导入VR1012质粒,VR1012质粒4.9 kb,为骨骼肌高表达质粒，由美国Vical公司Manthorpe教授惠赠[3],构建成所需的VR/TPO质粒。
, http://www.100md.com
1.2 VR/TPO质粒的大量提取
用醋酸铵法提取VR/TPO质粒[4]，因筛选标志为卡那霉素抗性基因，因此Luria-Bertani培养基中加入50 mg.L-1的卡那霉素。
1.3 VR/TPO转染CHO细胞
CHO细胞为本室冻存复苏而来。转染试剂脂质体DOTAP为宝灵曼公司产品，货号NO181177 。转染方法：CHO细胞用DMEM完全培养基培养，转染前一天传代，次日细胞达70%融合，分别转染VR1012，VR/TPO，pcDNA3TPO质粒各5 μg，每个样品与DOTAP 30 μl混匀，37℃，5%(体积分数)CO2转染9 h，后吸弃原培养基，继续培养72 h。
1.4 转染产物的鉴定
, 百拇医药
1.4.1 RT-PCR检测转染细胞的mRNA的表达 总RNA提取用Trizol试剂盒，详见说明书。逆转录反应体系：RNA 2 μl，MMLV 1 μl， DTT 2 μl,Rnasin 0.5 μl， dNTP 2 μl，随机引物1 μl,缓冲液4 μl,5倍稀释，混匀，37℃，1 h。PCR: 引物借助NBI之 Oligo primer analysis software, version 5.0 for windows 设计，委托Cybersyn公司合成，其互补DNA序列在TPO cDNA 中结合位置在161～657 bp。TPO上游及下游引物为5′-ACCCCTTTGCCC-
TACACCTGTC-3′,及5′CAGAAGCCCAGAGCCC-
AGTA-3′扩增产物片段为497 bp(β-actin作为内参照，扩增产物为300 bp片段。体系：Taq酶0.3 u,上下游引物各2.0 μl，缓冲液2 μl，10倍稀释，反转录产物2 μl,dNTP 2.5 μl。PCR反应：94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃后延伸5 min。
, http://www.100md.com
1.4.2 酶标双抗体夹心法定量检测TPO表达 应用Quantikine Human TPO Immunoassay 试剂盒 (R&D公司试剂盒编号DTPOO)。每孔加入检测稀释液RD1-20 50 μl,待测标本200 μl,充分混匀，4℃孵育3 h。漂洗缓冲液充分漂洗4次。每孔中加入TPO结合物200 μl,4℃孵育1 h,漂洗缓冲液充分漂洗4次,每孔中加入底物液200 μl，室温孵育30 min，每孔中加入中止液50 μl，混匀。30 min内450 nm测定OD值。
1.4.3 MTT法检测表达TPO的活性 用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养HEL细胞(HEL细胞为本室保存)，用培养物表达产物上清刺激HEL细胞系增殖。
1.5 动物实验
BALB/C小鼠购自本校实验动物中心，6～8周龄。实验分组：(1)对照组，6只，肌注VR1012质粒100 μg；(2)实验组1， 6只，每次注射VR/TPO 100 μg；(3)实验组2， 6只， 分3次肌注300 μg VR/TPO。注射方法：胫前肌肉多位点(>4个)，注射方向与肌纤维垂直，肌注前按摩局部肌肉。
, http://www.100md.com
2 结果
VR/TPO质粒的酶切鉴定结果经过EcoRⅠ,XbaⅠ酶切，证明为VR/TPO质粒(图1)。
RT-PCR检测mRNA表达结果见图2。VR1012 ，PcDNA3TPO 及VR/TPO转染细胞均可见318 bp的β-actin扩增产物，但仅pcDNA3TPO和VR/TPO转染细胞可见约500 bp扩增条带,提示转染导入细胞在 mRNA水平表达。
1， λDNA/HindⅢ markers； 2， VR/TPO/XbaⅠ； 3， VR/TPO/XbaⅠ+EcoRⅠ; 4, TPO cDNA; 5, VR/TPO plasmid.
图1 VR/TPO酶切鉴定结果
, 百拇医药
Figure 1 Restriction analysis of VR/TPO
TPO的表达定量检测，亲本CHO细胞和转染VR1012的细胞为0，VR/TPO为2 400 ng.L-1,pcDNA3TPO为1 100 ng.L-1。
Lane 1, PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ markers； Lane2， transfected CHO with VR1012; Lane 3, transfected CHO cells with VR/TPO; Lane 4, transfected CHO cells with PcDNA3TPO.
图2 RT-PCR检测VR/TPO在CHO细胞瞬时表达
, 百拇医药
Figure 2 RT-PCR examination of the transient expression
of VR/TPO in CHO cells
MTT检测定性表达结果发现VR/TPO,pcDNA3TPO光密度明显高于VR1012组，表明有活性TPO生成。其光密度值分别为0.23,0.15,0.005。
肌注小鼠引起的血小板升高反应，对照组肌注前血小板计数为(24.2±3.5)×109 L-1,肌注后为(28.3±5.8)×109 L-1 (P>0.05)。实验组1:肌注前为(29.2±4.4)×109 L-1肌注后(32.6±6.3)×109 L-1 (P>0.05)。 实验组2:肌注前为(28.7±4.5)×109 L-1肌注后为(48.2±6.3)×109 L-1(P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
临床上肿瘤和白血病化疗均可引起严重的血小板减少，从而引起机体严重的出血并发症，血小板输注可取得疗效，但血小板不易保存，且来源有限，长期输注会引起机体产生抗体，因此应用TPO治疗有望成为最有效的治疗手段之一。TPO制作工艺复杂，价格昂贵，应用受到限制，TPO基因的克隆成功，使人们想到TPO的基因治疗。目前关于TPO的基因治疗报道较少。这是由于TPO可以使机体产生中和抗体，甚至有报道TPO能引起白血病细胞增殖。如果表达过量还会导致骨髓纤维化，骨硬化等副作用。基因治疗的载体有病毒载体和非病毒载体，非病毒载体中直接肌注质粒DNA为基因治疗的简便有效的方法，不会像病毒那样激活诱发机体对载体发生免疫反应，不易合到基因组DNA中，而且制备过程较病毒载体简便[5]，但也有需要质粒量多、表达不稳定等缺点。VR/TPO是由VR1012载体与TPO cDNA 片段构建而成，而VR1012来源于V1J, V1J是真核细胞表达载体，其带有CMVIE1启动子/增强子。BGH多聚腺苷信号，能在骨骼肌细胞中高产量表达。VR1012是将V1J的氨苄青霉素抗性改为卡那霉素抗性基因。
, 百拇医药
本文用VR/TPO瞬时转染CHO细胞对其进行mRNA水平的鉴定和蛋白质水平的定量和定性鉴定，结果发现TPO表达达2 400 ng.L-1，比真核高效表达质粒pcDNA3TPO高一倍多(pcDNA3表达量为1 100 ng.L-1)，说明VR/TPO为高效表达载体。直接将VR/TPO给小鼠肌注，结果发现100 μg一次注射不能引起小鼠血小板明显升高，而高剂量(300 μg)多位点分次垂直于肌纤维注射可引起小鼠血小板增高。但由于肌注质粒量较多，并需多次注射，故仍应改进此技术，例如并用电穿孔法、脂质体法、高渗葡萄糖和肌肉变性剂注射以提高TPO的表达效率。总之，本文的研究揭示了基因治疗的非病毒载体质粒可以在体内体外高效表达，从而使有生物活性的TPO蛋白表达，随着转染技术和载体的改进，应取得更好的疗效。■
参考文献
[1]Mongomcry DL, Shiver JW, Leander ER, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination optionization of DNA vector[J]. DNA Cell Biol， 1993,1:777-783
, 百拇医药
[2]侯纬敏，陆爱丽，岱美如.分子克隆人血小板生成素基因[J].北京医科大学学报，1996，28，1-3
[3]Hartikka J, Sawdey M, Cornefert-Jensen F, et al. An improved plasmid DNA vector for direct injection into skeletal muscle[J]. Hum Gene Ther, 1996,7:1205-1219
[4]Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high quality plasmid[J]. DNA Biotechniques， 1990,9:676-679
[5]Davis HL, Whalen RG, Demeneix BA， et al. Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo factors affecting efficiency of transfer and stability of expression[J]. Human Gene Ther， 1993,4:151-159
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药