mthfr基因第1298位核苷酸多态性与酶活性的关系
作者：朱慧萍 刘明珠 刀京晶 李竹
单位：北京大学生育健康研究所，北京 100083
关键词：N5,N10-亚甲基四氢叶酸；脱氢酶；代谢；基因；多态现象(遗传学)
北京医科大学学报000319 [摘 要] 目的：探讨mthfr基因第1298位核苷酸的多态性对酶活性及热稳定性的影响。方法：用PCR-RFLP方法检测64例中国女性mthfr基因第1298位核苷酸，并检测外周血淋巴细胞MTHFR酶活性和46℃灭活5 min后的残余酶活性，比较不同基因型其酶活性和热稳定性的差别。结果：第677位核苷酸基因型为677CC时，正常型1298AA平均酶活性最高，为每毫克蛋白每小时12.263 nmol CH2O，杂合型1298AC平均酶活性为每毫克蛋白每小时9.524 nmol CH2O，纯合突变型1298CC酶活性最低，仅为每毫克蛋白每小时7.830 nmol CH2O；第1298位核苷酸不同基因型的残余酶活性无明显差别。结论：mthfr基因第1298位核苷酸由A→C的变异可引起酶活性降低，但与热稳定性无关。
, 百拇医药
[中图分类号]Q343.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0262-03
Relationship between enzyme activity and polymorphism
of the 1298th nucleotides of mthfr gene
ZHU Hui-Ping, LIU Ming-Zhu, DAO Jing-Jing, LI Zhu
(Institute of Reproductivet Health, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of the 1298AC polymorphism of mthfr gene on the specific enzyme activity and thermolability of the enzyme. Methods: Whole blood samples from 64 Chinese females were obtained for detection of genotype and enzyme activity. The genotype was determined by PCR-RFLP protocol. Enzyme activity of lymphocytes were detected routinely. Thermolability was determined by detecting residual activity after incubation at 46℃ for 5 minutes. The enzyme activity and residual acticity percentage were compared among different genotypes. Results: With the genotype of 677CC, average specific activity of normal genotype of 1298AA is 12.263 nmol CH2O/(mg protein.h), compared with that of 9.524 nmol CH2O/(mg protein.h) of heterozygotic genotype of 1298AC and 7.830 nmol CH2O/(mg protein.h)homozygotic genotype of 1298CC. No difference of residual activity percentage among three genotypes was found. Conclusion: The 1298 A→C polymorphism may lead to reduction of the specific activity, while it does'nt affect the thermolability of the enzyme.
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KEY WORDS
KEY WORDS N5,N10-methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase/metab; Gene; Polymorphism (genetics)▲
N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR, EC1.1.1.68) 是一种黄素蛋白，催化体内N5,N10-亚甲基四氢叶酸生成N5-甲基四氢叶酸的还原反应。近来发现，mthfr基因第677位核苷酸的多态性可引起酶活性的轻度或中度降低，这样的个体并不表现典型的临床症状，但可引起同型半胱氨酸血症(homocysteinemia)。由于同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是心血管疾病和一些出生缺陷的危险因素之一，mthfr基因多态性也与这些疾病的发生有关[1～3]。最近van der Put等又报道了mthfr基因的一个多态性位点，即第1298位核苷酸的多态性。当该核苷酸为腺嘌呤(A)时，编码一个谷氨酸(glutamate, Glu)，如果被胞嘧啶(C)替代，则变为编码一个丙氨酸(alanine, Ala)[4]。本研究探讨了中国人mthfr基因1298A→C多态性与外周血淋巴细胞MTHFR酶活性和热稳定性的关系，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 外周血的采集
用K3-EDTA抗凝的负压采血管，采集肘静脉血5 ml。
1.2 mthfr A1298C基因型检测
从500 μl全血提取基因组DNA。红细胞裂解液：10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH=7.6), 5 mmol.L-1 MgCl2, 1%(体积分数) Triton X-100, 0.32 mol.L-1蔗糖；白细胞裂解液：10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH=8.3), 2.5 mmol.L-1 MgCl2, 0.45%(体积分数) Tween 20, 0.45%(体积分数) NP-40, 0.1%(体积分数)明胶。
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PCR反应：引物(上海Sangon公司合成)：上游：5′-CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3′，下游：5′-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3′；反应体系：总体积为25 μl,含1.2单位Taq聚合酶(华美),dNTPs各100 μmol.L-1,1.5 mmol.L-1 MgCl2, 10 mmol.L-1 Tris-HCl。反应条件：Perkin Elmer 9600型基因扩增仪：95℃预变性5 min；95℃变性15 s,60℃复性35 s,72℃延伸15 s，循环36次；72℃延伸7 min。扩增产物为163 bp。
限制性片段长度多态性分析：mthfr第1298位核苷酸从A到C的突变去除了一个限制性内切酶MboⅡ的识别位点。因此上述扩增产物用MboⅡ(Biolabs)酶切后进行PAGE电泳分析，以判断基因型。
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1.3 MTHFR酶活性检测
从5 ml外周血中常规分离淋巴细胞，冻融法裂解细胞。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并将裂解液稀释至200 mg.L-1。250 μl反应混合物中含0.3 mol.L-1磷酸钾缓冲液(pH=6.8)121 μl，0.05 mol.L-1 EDTA(pH=7.0)5 μl，4.5 mmol.L-1 FAD 3 μl，0.3 mol.L-1 VitK3 3 μl，细胞裂解液100 μl，0.28 mmol.L-1 [5-14C]甲基四氢叶酸水溶液(含48.6 mmol.L-1抗坏血酸)。37℃孵育20 min。在反应混合物中依次加入5 μl 1 mol.L-1甲醛溶液、100 μl0.25 mol.L-1双甲酮和50 μl 3 mol.L-1醋酸钾缓冲液终止反应，将混合物沸水浴5 min后，再冰浴5 min，使结晶充分析出。加入3 ml闪烁液(5 g.L-1 PPO,0.4 g.L-1 POPOP)进行液闪计数。酶活性以每小时内每毫克蛋白所生成的甲醛的量(nmol)表示。
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1.4 MTHFR热稳定性的检测
细胞裂解液经46℃灭活5 min后，检测其残余酶活性。热稳定性用残余酶活性占灭活前酶活性的百分比来表示。
2 结果
2.1 1298A→C多态性在中国人中的分布
mthfr 1298AC基因型检测电泳结果见图1。
M, marker.
图1 mthfr 1298AC 基因型PCR-RFLP分析结果
(200 g.L-1 PAGE电泳，110 V，45 min)
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Figure 1 PCR-RFLP analysis of mthfr 1298AC polymorphism
(200 g.L-1 PAGE,110 V,45 min)
检测的64名中国女性中，基因型为AA者共48人，占75%，杂合型(AC)共15人，占23.4%，纯合突变型仅有1人，占1.6%。1298C在该人群中的等位基因频率为(15+2)/64×2＝13.3%。
2.2 1298A→C多态性与特异性酶活性和热稳定性的关系
不同(1298A→C和677C→T)基因型特异性酶活性和残余酶活性百分比的比较见表1。
第677位核苷酸基因型相同时(如677CC)，1298AA(正常型)酶活性最高，1298AC(杂合型)酶活性稍低，1298CC(纯合突变型)酶活性最低，即酶活性随着突变等位基因数增加而降低。残余酶活性百分比则无明显下降趋势。当第677位和第1298位均为杂合突变时，平均酶活性低于677CC型；当第677位为纯合突变型677TT，第1298位为杂合型1298AC时，酶活性更低。
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2.3 1298AC基因型与677CT基因型的分布
检测的全部64份DNA样品中第677位为纯合突变(677TT)的共26例，其中25例第1298位为正常纯合型(1298AA)，仅有1例为杂合型(1298AC)；第1298位核苷酸为纯合突变型(1298CC)的只有1例，其第677位为正常纯合型，即677CC。两位点均为杂合型的(1298AC/677CT)共11例，占17.2%。
表1 MTHFR基因型与酶活性和残余酶活性百分比的关系(
±s)
Table 1 Relationship between MTHFR genotype,specific enzyme
activity and residual activity percentage(±s) Genotype
, 百拇医药
677CC
677CT
677TT
Specific activity(nmol.mg-1.h-1)
1298AA
12.263±3.805
6.709±2.679
2.720±1.683
1298AC
9.524±2.310
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5.526±1.753
1.460
1298CC
7.830
—
—
Residual activity percentage(%)
1298AA
85.00±9.33
81.12±9.19
68.68±9.08
1298AC
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82.80±7.92
79.08±9.49
56.20
1298CC
87.00
—
—
Specific activity: P<0.05 for 677TT vs 677CT and CC, 677CT vs 677CC; P<0.1 for 1298AC/677CT vs 1298AA/677CT. Residual activity percentage: P<0.05 for 677TT vs 677CC, 677CT vs 677CC.
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3 讨论
MTHFR是一种重要的一碳单位代谢酶。其酶活性缺陷可引起同型半胱氨酸在体内蓄积，越来越多的研究发现，MTHFR的基因缺陷与心血管疾病和出生缺陷的发生有关。
本研究对64例中国女性mthfr 1298A→C多态性进行了检测，仅发现了1例为纯合突变型，占1.6%，突变等位基因频率为13.3%，远低于van der Put报道的33%。提示该多态性的分布可能与677CT一样，存在种族或群体差异。为了准确估计中国人该多态性的分布情况，需要扩大样本量。
本研究发现，1298AC多态性与酶活性有关，即：正常型(1298AA)酶活性最高，杂合型(1298AC)较低，纯合型(1298CC)最低；而酶的热稳定性与1298AC多态性无关。这与van der Put的报道一致。此外还发现，该位点的多态性对酶活性的影响小于677CT多态性的影响。同时，由于中国人677T等位基因频率远高于1298C(资料未报道)，可以推测，677CT多态性对中国人MTHFR特异性酶活性的影响作用远大于1298AC。
, 百拇医药
van der Put[4]的报道中观察的所有纯合突变型1298CC，其677位核苷酸基因型均为正常型677CC，且677位核苷酸纯合突变型677TT，相应的1298位核苷酸均为正常纯合型1298AA，因此，van der Put等[4]认为，突变等位基因677T和1298C在染色体上呈反式排列，即这两个突变等位基因一般情况下不会同时存在于一条染色体上，并推测如果二者同时存在与一条染色体，将对酶的活性产生较大影响。本研究也考察了1298AC基因型与677CT基因型的关系，结果显示，仅有1例第1298位核苷酸纯合突变型1298CC，其相应的第677位核苷酸为正常型677CC；26例677位核苷酸纯合突变型677TT中，有25例相应的第1298位核苷酸均为正常型1298AA，与van der Put[4]的报道一致；由于本研究样本量较小，1298CC/677CC仅有1例，因此只能看出趋势，如下结论，还需扩大样本含量。值得注意的是，有1例基因型为677TT/1298AC，即该个体的一条染色体上同时存在突变等位基因677T和1298C，其酶活性很低，仅为每毫克蛋白每小时1.46 nmol CH2O，同时残余酶活性百分比也明显低于其它基因型的个体。
, 百拇医药
由于MTHFR在叶酸代谢及心血管疾病和出生缺陷中的重要意义，研究影响其酶活性的基因多态性将增进人们对上述疾病遗传易感性的认识，从而为阐明疾病发生的遗传背景和机制，实现早期预防和治疗奠定基础。■
基金项目：国家自然科学基金(39800130)和国家“863”高技术项目(102-10-03-04)。
参考文献
[1]Zhou J, Kang SS, Wong PWK, et al. Purification and Characterization of methylenetetrahydrofolate reductase from human cadaver liver[J]. Biochem Med Metab Biol，1990,43:234-242
[2]Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate genetic risk factors for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofo-late reductase[J]. Nat Genet，1995,10:111-113
, 百拇医药
[3]Whitehead AS, Gallagher P, Mills JL, et al. A genetic defect in 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase in neural tube defects[J]. Q J Med，1995,88:763-766
[4]van der Put NMJ, Gabreels F, Stevens EMB, et al. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects[J]? Am J Hum Genet，1998, 62: 1044-1051
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药
单位：北京大学生育健康研究所，北京 100083
关键词：N5,N10-亚甲基四氢叶酸；脱氢酶；代谢；基因；多态现象(遗传学)
北京医科大学学报000319 [摘 要] 目的：探讨mthfr基因第1298位核苷酸的多态性对酶活性及热稳定性的影响。方法：用PCR-RFLP方法检测64例中国女性mthfr基因第1298位核苷酸，并检测外周血淋巴细胞MTHFR酶活性和46℃灭活5 min后的残余酶活性，比较不同基因型其酶活性和热稳定性的差别。结果：第677位核苷酸基因型为677CC时，正常型1298AA平均酶活性最高，为每毫克蛋白每小时12.263 nmol CH2O，杂合型1298AC平均酶活性为每毫克蛋白每小时9.524 nmol CH2O，纯合突变型1298CC酶活性最低，仅为每毫克蛋白每小时7.830 nmol CH2O；第1298位核苷酸不同基因型的残余酶活性无明显差别。结论：mthfr基因第1298位核苷酸由A→C的变异可引起酶活性降低，但与热稳定性无关。
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[中图分类号]Q343.1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0262-03
Relationship between enzyme activity and polymorphism
of the 1298th nucleotides of mthfr gene
ZHU Hui-Ping, LIU Ming-Zhu, DAO Jing-Jing, LI Zhu
(Institute of Reproductivet Health, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of the 1298AC polymorphism of mthfr gene on the specific enzyme activity and thermolability of the enzyme. Methods: Whole blood samples from 64 Chinese females were obtained for detection of genotype and enzyme activity. The genotype was determined by PCR-RFLP protocol. Enzyme activity of lymphocytes were detected routinely. Thermolability was determined by detecting residual activity after incubation at 46℃ for 5 minutes. The enzyme activity and residual acticity percentage were compared among different genotypes. Results: With the genotype of 677CC, average specific activity of normal genotype of 1298AA is 12.263 nmol CH2O/(mg protein.h), compared with that of 9.524 nmol CH2O/(mg protein.h) of heterozygotic genotype of 1298AC and 7.830 nmol CH2O/(mg protein.h)homozygotic genotype of 1298CC. No difference of residual activity percentage among three genotypes was found. Conclusion: The 1298 A→C polymorphism may lead to reduction of the specific activity, while it does'nt affect the thermolability of the enzyme.
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KEY WORDS
KEY WORDS N5,N10-methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase/metab; Gene; Polymorphism (genetics)▲
N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR, EC1.1.1.68) 是一种黄素蛋白，催化体内N5,N10-亚甲基四氢叶酸生成N5-甲基四氢叶酸的还原反应。近来发现，mthfr基因第677位核苷酸的多态性可引起酶活性的轻度或中度降低，这样的个体并不表现典型的临床症状，但可引起同型半胱氨酸血症(homocysteinemia)。由于同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是心血管疾病和一些出生缺陷的危险因素之一，mthfr基因多态性也与这些疾病的发生有关[1～3]。最近van der Put等又报道了mthfr基因的一个多态性位点，即第1298位核苷酸的多态性。当该核苷酸为腺嘌呤(A)时，编码一个谷氨酸(glutamate, Glu)，如果被胞嘧啶(C)替代，则变为编码一个丙氨酸(alanine, Ala)[4]。本研究探讨了中国人mthfr基因1298A→C多态性与外周血淋巴细胞MTHFR酶活性和热稳定性的关系，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 外周血的采集
用K3-EDTA抗凝的负压采血管，采集肘静脉血5 ml。
1.2 mthfr A1298C基因型检测
从500 μl全血提取基因组DNA。红细胞裂解液：10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH=7.6), 5 mmol.L-1 MgCl2, 1%(体积分数) Triton X-100, 0.32 mol.L-1蔗糖；白细胞裂解液：10 mmol.L-1 Tris-HCl(pH=8.3), 2.5 mmol.L-1 MgCl2, 0.45%(体积分数) Tween 20, 0.45%(体积分数) NP-40, 0.1%(体积分数)明胶。
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PCR反应：引物(上海Sangon公司合成)：上游：5′-CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3′，下游：5′-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3′；反应体系：总体积为25 μl,含1.2单位Taq聚合酶(华美),dNTPs各100 μmol.L-1,1.5 mmol.L-1 MgCl2, 10 mmol.L-1 Tris-HCl。反应条件：Perkin Elmer 9600型基因扩增仪：95℃预变性5 min；95℃变性15 s,60℃复性35 s,72℃延伸15 s，循环36次；72℃延伸7 min。扩增产物为163 bp。
限制性片段长度多态性分析：mthfr第1298位核苷酸从A到C的突变去除了一个限制性内切酶MboⅡ的识别位点。因此上述扩增产物用MboⅡ(Biolabs)酶切后进行PAGE电泳分析，以判断基因型。
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1.3 MTHFR酶活性检测
从5 ml外周血中常规分离淋巴细胞，冻融法裂解细胞。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并将裂解液稀释至200 mg.L-1。250 μl反应混合物中含0.3 mol.L-1磷酸钾缓冲液(pH=6.8)121 μl，0.05 mol.L-1 EDTA(pH=7.0)5 μl，4.5 mmol.L-1 FAD 3 μl，0.3 mol.L-1 VitK3 3 μl，细胞裂解液100 μl，0.28 mmol.L-1 [5-14C]甲基四氢叶酸水溶液(含48.6 mmol.L-1抗坏血酸)。37℃孵育20 min。在反应混合物中依次加入5 μl 1 mol.L-1甲醛溶液、100 μl0.25 mol.L-1双甲酮和50 μl 3 mol.L-1醋酸钾缓冲液终止反应，将混合物沸水浴5 min后，再冰浴5 min，使结晶充分析出。加入3 ml闪烁液(5 g.L-1 PPO,0.4 g.L-1 POPOP)进行液闪计数。酶活性以每小时内每毫克蛋白所生成的甲醛的量(nmol)表示。
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1.4 MTHFR热稳定性的检测
细胞裂解液经46℃灭活5 min后，检测其残余酶活性。热稳定性用残余酶活性占灭活前酶活性的百分比来表示。
2 结果
2.1 1298A→C多态性在中国人中的分布
mthfr 1298AC基因型检测电泳结果见图1。
M, marker.
图1 mthfr 1298AC 基因型PCR-RFLP分析结果
(200 g.L-1 PAGE电泳，110 V，45 min)
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Figure 1 PCR-RFLP analysis of mthfr 1298AC polymorphism
(200 g.L-1 PAGE,110 V,45 min)
检测的64名中国女性中，基因型为AA者共48人，占75%，杂合型(AC)共15人，占23.4%，纯合突变型仅有1人，占1.6%。1298C在该人群中的等位基因频率为(15+2)/64×2＝13.3%。
2.2 1298A→C多态性与特异性酶活性和热稳定性的关系
不同(1298A→C和677C→T)基因型特异性酶活性和残余酶活性百分比的比较见表1。
第677位核苷酸基因型相同时(如677CC)，1298AA(正常型)酶活性最高，1298AC(杂合型)酶活性稍低，1298CC(纯合突变型)酶活性最低，即酶活性随着突变等位基因数增加而降低。残余酶活性百分比则无明显下降趋势。当第677位和第1298位均为杂合突变时，平均酶活性低于677CC型；当第677位为纯合突变型677TT，第1298位为杂合型1298AC时，酶活性更低。
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2.3 1298AC基因型与677CT基因型的分布
检测的全部64份DNA样品中第677位为纯合突变(677TT)的共26例，其中25例第1298位为正常纯合型(1298AA)，仅有1例为杂合型(1298AC)；第1298位核苷酸为纯合突变型(1298CC)的只有1例，其第677位为正常纯合型，即677CC。两位点均为杂合型的(1298AC/677CT)共11例，占17.2%。
表1 MTHFR基因型与酶活性和残余酶活性百分比的关系(
±s)Table 1 Relationship between MTHFR genotype,specific enzyme
activity and residual activity percentage(
±s) Genotype, 百拇医药
677CC
677CT
677TT
Specific activity(nmol.mg-1.h-1)
1298AA
12.263±3.805
6.709±2.679
2.720±1.683
1298AC
9.524±2.310
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5.526±1.753
1.460
1298CC
7.830
—
—
Residual activity percentage(%)
1298AA
85.00±9.33
81.12±9.19
68.68±9.08
1298AC
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82.80±7.92
79.08±9.49
56.20
1298CC
87.00
—
—
Specific activity: P<0.05 for 677TT vs 677CT and CC, 677CT vs 677CC; P<0.1 for 1298AC/677CT vs 1298AA/677CT. Residual activity percentage: P<0.05 for 677TT vs 677CC, 677CT vs 677CC.
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3 讨论
MTHFR是一种重要的一碳单位代谢酶。其酶活性缺陷可引起同型半胱氨酸在体内蓄积，越来越多的研究发现，MTHFR的基因缺陷与心血管疾病和出生缺陷的发生有关。
本研究对64例中国女性mthfr 1298A→C多态性进行了检测，仅发现了1例为纯合突变型，占1.6%，突变等位基因频率为13.3%，远低于van der Put报道的33%。提示该多态性的分布可能与677CT一样，存在种族或群体差异。为了准确估计中国人该多态性的分布情况，需要扩大样本量。
本研究发现，1298AC多态性与酶活性有关，即：正常型(1298AA)酶活性最高，杂合型(1298AC)较低，纯合型(1298CC)最低；而酶的热稳定性与1298AC多态性无关。这与van der Put的报道一致。此外还发现，该位点的多态性对酶活性的影响小于677CT多态性的影响。同时，由于中国人677T等位基因频率远高于1298C(资料未报道)，可以推测，677CT多态性对中国人MTHFR特异性酶活性的影响作用远大于1298AC。
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van der Put[4]的报道中观察的所有纯合突变型1298CC，其677位核苷酸基因型均为正常型677CC，且677位核苷酸纯合突变型677TT，相应的1298位核苷酸均为正常纯合型1298AA，因此，van der Put等[4]认为，突变等位基因677T和1298C在染色体上呈反式排列，即这两个突变等位基因一般情况下不会同时存在于一条染色体上，并推测如果二者同时存在与一条染色体，将对酶的活性产生较大影响。本研究也考察了1298AC基因型与677CT基因型的关系，结果显示，仅有1例第1298位核苷酸纯合突变型1298CC，其相应的第677位核苷酸为正常型677CC；26例677位核苷酸纯合突变型677TT中，有25例相应的第1298位核苷酸均为正常型1298AA，与van der Put[4]的报道一致；由于本研究样本量较小，1298CC/677CC仅有1例，因此只能看出趋势，如下结论，还需扩大样本含量。值得注意的是，有1例基因型为677TT/1298AC，即该个体的一条染色体上同时存在突变等位基因677T和1298C，其酶活性很低，仅为每毫克蛋白每小时1.46 nmol CH2O，同时残余酶活性百分比也明显低于其它基因型的个体。
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由于MTHFR在叶酸代谢及心血管疾病和出生缺陷中的重要意义，研究影响其酶活性的基因多态性将增进人们对上述疾病遗传易感性的认识，从而为阐明疾病发生的遗传背景和机制，实现早期预防和治疗奠定基础。■
基金项目：国家自然科学基金(39800130)和国家“863”高技术项目(102-10-03-04)。
参考文献
[1]Zhou J, Kang SS, Wong PWK, et al. Purification and Characterization of methylenetetrahydrofolate reductase from human cadaver liver[J]. Biochem Med Metab Biol，1990,43:234-242
[2]Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate genetic risk factors for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofo-late reductase[J]. Nat Genet，1995,10:111-113
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[3]Whitehead AS, Gallagher P, Mills JL, et al. A genetic defect in 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase in neural tube defects[J]. Q J Med，1995,88:763-766
[4]van der Put NMJ, Gabreels F, Stevens EMB, et al. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects[J]? Am J Hum Genet，1998, 62: 1044-1051
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药