大鼠溶栓模型建立及其应用
作者：琳娜 杨坚 王超 赵明 彭师奇 宋东光 翁冀中
单位：琳娜 杨坚 王超 赵明 彭师奇(北京大学药学院药物化学系, 北京 100083)；宋东光 翁冀中(北京大学北联公司)
关键词：血栓溶解疗法；疾病模型；动物
北京医科大学学报000326 [摘 要] 目的：建立大鼠动静脉旁路插管溶栓模型，评价QP6A的溶栓作用。方法：用尿激酶的溶栓作用验证该溶栓模型的可靠性，用生理盐水(3 ml.kg-1)作空白对照，用尿激酶(20 000 IU.kg-1)作阳性对照，在该模型上评价了QP6A(10 μmol.kg-1)的溶血栓作用。结果：给药1 h后，尿激酶组血栓减重(13±5) mg，QP6A组血栓减重(9±6) mg，二者与生理盐水组血栓减重(0.8±7.0) mg相比差异有显著性。结论：该溶栓模型在药物研究中可用于活性评价，QP6A有望成为一种新的溶栓药物。
, 百拇医药
[中图分类号]R654.4 [文献标识码]B
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0283-02
The establishment of rat model of thrombolysis and its application
LIN Na，YANG Jian，WANG Chao，ZHAO Ming，PENG Shi-Qi
(Department of Medicinal Chemistry, School of Phamaceutical Sciences,Peking University,Beijing 100083, China)
SONG Dong-Guang，WENG Ji-Zhong
, 百拇医药
(Beilian Company of Peking University)
ABSTRACT Objective: To establish the rat model of thrombolysis and evaluate the thrombolytic effect of QP6A. Methods: The reliability of the rat model was confirmed by the thrombolysis of urokinase (UK). With normal saline and UK as blank control and positive control respectively, the thrombolytic effect of QP6A was evaluated. Results: After treating with UK and QP6A for 1 h, the thrombi were reduced to (13±5) mg and (9±6) mg respectively. The results indicated that both UK and QP6A had thrombolytic effects compared with NS (0.8±7) mg (P<0.05). Conclusion: This rat model is useful in drug evaluation. QP6A might be a potential thrombolytic agent.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Thrombolytic therapy; Disease models, animal▲
在心血管疾病中，血管栓塞性疾病(例如高血压，动脉粥样硬化基础上发生的心肌缺血，心肌梗死，脑血管意外和外周血管疾病等)危害尤其严重。目前认为，血管栓塞主要起因于血栓形成，血管壁痉挛和血管壁增生。发病机制尚未完全阐明，防治仍然困难。80年代流行的各种血管再通术(药物溶栓，血管成形术，激光再通术，血管搭桥术，PTCA，旋切血管动脉粥样硬化斑块等)仍有费用昂贵，术后血管再狭窄，血栓再形成，全身出血倾向，血流盗流，免疫反应等多方面的不足。依据细胞和/或分子水平血管栓塞性疾病的发病机制，寻找新的血管再通剂，是90年代新药研究的热点之一。
在1993年发布的新药临床前研究指导原则汇编中，动静脉旁路血栓模型是溶栓药物评价的主要模型之一。在文献报道的相关模型中，大鼠动静脉旁路丝线法为抗血栓模型[1]，陈家树等[2]报道的大鼠溶血栓模型为颈动脉旁路模型。本文对所述两个模型进行了适当的修饰，建立了大鼠动静脉旁路溶血栓模型。QP6A是在对纤维蛋白降解产物Peptide6A进行结构修饰过程中得到的线性五肽，其活性明显优于后者，它的组成为Gln-Arg-Pro-Ala-Lys，相对分子质量为598[3～6]。1997年被列入国家科技部“1035”工程，作为一类新药开发。应用上述模型对QP6A的溶血栓作用进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 材料与模型的建立
肝素钠为上海第二军医大学政翔医用科技实业公司产品，戊巴比妥钠为北京育才精细化工厂产品，尿激酶为广东天普生化制药有限公司产品，QP6A由我们用液相法合成。Wistar大鼠[一级，雄性，(250±50)g]购自北京大学医学部实验动物科学部。
1.1 模型
1.1.1 血栓的制备 往垂直固定的玻璃管(长15 mm，内径2.5 mm，外径5.0 mm，管底用胶塞密封)中注入0.1 ml枸橼酸化的大鼠动脉血液,该血液复钙未凝。往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2 mm的不锈钢丝绕成,螺旋部分长12 mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0 mm，托柄与螺旋相连，长7.0 mm，呈问号型。血液凝固15 min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精确称重(质量范围为74～84 mg)。
, 百拇医药
1.1.2 旁路管道的制备 旁路管道由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60.0 mm，内径3.5 mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0 mm，内径1.0 mm，外径2.0 mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0 mm，另一端的外部套一段长7.0 mm，外径为3.5 mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50 IU.kg-1)，备用。
1.1.3 大鼠颈动静脉旁路插管模型 Wistar大鼠(雄性，250～300 g)按80 mg.kg-1剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定后进行手术：分离气管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50 IU.kg-1)，此时注射器不要撤离聚乙烯管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉。此即大鼠动静脉旁路溶栓模型。
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1.1.4 溶栓评价 用头皮针将生理盐水(3 ml.kg-1)，尿激酶的生理盐水溶液(20 000 IU.kg-1)或QP6A的生理盐水溶液(10 μmol.kg-1)通过旁路管的中段，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处缓慢注入到血液中(约6 min)。使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或QP6A(治疗剂)通过血液循环，按静脉—心脏—动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1 h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计各组的血栓质量差值(
±s)，并做t检验。
2 结果
空白对照组，阳性对照组和QP6A组的血栓减重值列入表1。
, 百拇医药
表1 由生理盐水，尿激酶以及QP6A导致的血栓减重(±s)
Table 1 Reduction of thrombus with NS,UK and QP6A (±s) Groups
Dosage
m/mg
NS
3 ml.kg-1
0.76±7.40
UK
, 百拇医药
20 000 IU.kg-1
12.81±5.15
QP6A
10 μmol.kg-1
8.65±5.79
m， reduction mass of thrombus；NS，normal saline；UK，urokinase；n=10，comparing with NS，P<0.05.
从表1的血栓减重情况以及统计结果看，QP6A显示了明显的溶栓作用。
3 讨论
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本文提供的模型是大鼠动静脉旁路(丝线法)抗血栓模型和大鼠动脉溶血栓模型的融合与改进。与前者不同的是，旁路管道中段内的丝线换成了本模型中血栓包裹的不锈钢质血栓固定螺旋，中段管的内径由1.5 mm增至3.5 mm，动物由血栓形成前给药变为血栓放入中段管后给药，治疗时间由15 min延长到1 h；与后者不同的是，血栓固定螺旋由漏斗状改为圆柱状，螺旋的长度由20 mm缩短为15 mm，旁路管道的中段管内径由5.0 mm缩小为3.5 mm，由动脉旁路插管变为动静脉旁路插管。本文对原有模型的改进有可能带来一些好处，例如适当缩小中段管路的内径可保持血流在各段的速度差别不大，又例如血栓固定螺旋改为圆柱形有可能避免漏斗型血栓承受的血流冲击力。这些都有助于提高模型的可重复性。另外，本文提供的模型也保留了所述两个模型的固有优点，例如手术不太复杂，容易掌握；器械简便，容易制作；血栓由枸橼酸化后复钙的大鼠血液制作，它的成分与临床的血栓成分接近；制备的血栓固定在带托柄的螺旋上，可以方便地准确称量。
本文提供的模型制作的血栓(包括血栓固定螺旋)质量可以稳定在74～84 mg的范围内，这类血栓在生理盐水组中的质量变化绕零点摆动，在尿激酶(20 000 IU.kg-1)组中则明显减重，幅度可以达到(12.81±5.15) mg，与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。这些结果说明了本文提供的模型有明确的稳定性与可靠性，可用于活性评价。
, http://www.100md.com
本文采用该模型以生理盐水作空白对照，以尿激酶作阳性对照(剂量为20 000 IU.kg-1)，测定了QP6A的溶血栓作用。发现在10 μmol.kg-1剂量下，QP6A可以使血栓明显减重，幅度可以达到(8.65±5.79)mg，与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)，与尿激酶组(20 000 IU.kg-1)比较差异无显著性(P>0.05)。本实验证实了QP6A的溶栓作用，为深入进行临床前药效学研究提供了基础。■
参考文献
[1]汪 钟.血栓法.见：药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1994.1124
[2]陈家树，梁陆光.一个新的可定量的大鼠血栓模型[J].中国药理学通报，1996，12(5)：473-474
, http://www.100md.com
[3]Belew M, Gerdin B, Larsson L, et al. Structure-activity relationships of vasoactive peptides derived from fibrin or fibrinogen degraded by plasmin[J]. Biochem Biophysica Acta， 1980,621: 169-173
[4]Mehta JL， Nichols WW， Saldeen J. Effects of peptide 6A on coronary blood flow dynamics in canine coronary thrombosis[J]. J Cardiovasc Pharmacol， 1989,13(6):803-811
[5]赵 明，彭师奇，程铁明，等.P6A的合成和功能[J].化学通报， 1990，12：29-30
[6]赵 明，彭师奇，蔡孟深，等.P6A的结构修饰与舒血管活性[J].自然科学进展， 1993，3(6)：529-534
收稿日期：1999-11-18, 百拇医药
单位：琳娜 杨坚 王超 赵明 彭师奇(北京大学药学院药物化学系, 北京 100083)；宋东光 翁冀中(北京大学北联公司)
关键词：血栓溶解疗法；疾病模型；动物
北京医科大学学报000326 [摘 要] 目的：建立大鼠动静脉旁路插管溶栓模型，评价QP6A的溶栓作用。方法：用尿激酶的溶栓作用验证该溶栓模型的可靠性，用生理盐水(3 ml.kg-1)作空白对照，用尿激酶(20 000 IU.kg-1)作阳性对照，在该模型上评价了QP6A(10 μmol.kg-1)的溶血栓作用。结果：给药1 h后，尿激酶组血栓减重(13±5) mg，QP6A组血栓减重(9±6) mg，二者与生理盐水组血栓减重(0.8±7.0) mg相比差异有显著性。结论：该溶栓模型在药物研究中可用于活性评价，QP6A有望成为一种新的溶栓药物。
, 百拇医药
[中图分类号]R654.4 [文献标识码]B
[文章编号] 1000-1530(2000)03-0283-02
The establishment of rat model of thrombolysis and its application
LIN Na，YANG Jian，WANG Chao，ZHAO Ming，PENG Shi-Qi
(Department of Medicinal Chemistry, School of Phamaceutical Sciences,Peking University,Beijing 100083, China)
SONG Dong-Guang，WENG Ji-Zhong
, 百拇医药
(Beilian Company of Peking University)
ABSTRACT Objective: To establish the rat model of thrombolysis and evaluate the thrombolytic effect of QP6A. Methods: The reliability of the rat model was confirmed by the thrombolysis of urokinase (UK). With normal saline and UK as blank control and positive control respectively, the thrombolytic effect of QP6A was evaluated. Results: After treating with UK and QP6A for 1 h, the thrombi were reduced to (13±5) mg and (9±6) mg respectively. The results indicated that both UK and QP6A had thrombolytic effects compared with NS (0.8±7) mg (P<0.05). Conclusion: This rat model is useful in drug evaluation. QP6A might be a potential thrombolytic agent.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Thrombolytic therapy; Disease models, animal▲
在心血管疾病中，血管栓塞性疾病(例如高血压，动脉粥样硬化基础上发生的心肌缺血，心肌梗死，脑血管意外和外周血管疾病等)危害尤其严重。目前认为，血管栓塞主要起因于血栓形成，血管壁痉挛和血管壁增生。发病机制尚未完全阐明，防治仍然困难。80年代流行的各种血管再通术(药物溶栓，血管成形术，激光再通术，血管搭桥术，PTCA，旋切血管动脉粥样硬化斑块等)仍有费用昂贵，术后血管再狭窄，血栓再形成，全身出血倾向，血流盗流，免疫反应等多方面的不足。依据细胞和/或分子水平血管栓塞性疾病的发病机制，寻找新的血管再通剂，是90年代新药研究的热点之一。
在1993年发布的新药临床前研究指导原则汇编中，动静脉旁路血栓模型是溶栓药物评价的主要模型之一。在文献报道的相关模型中，大鼠动静脉旁路丝线法为抗血栓模型[1]，陈家树等[2]报道的大鼠溶血栓模型为颈动脉旁路模型。本文对所述两个模型进行了适当的修饰，建立了大鼠动静脉旁路溶血栓模型。QP6A是在对纤维蛋白降解产物Peptide6A进行结构修饰过程中得到的线性五肽，其活性明显优于后者，它的组成为Gln-Arg-Pro-Ala-Lys，相对分子质量为598[3～6]。1997年被列入国家科技部“1035”工程，作为一类新药开发。应用上述模型对QP6A的溶血栓作用进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 材料与模型的建立
肝素钠为上海第二军医大学政翔医用科技实业公司产品，戊巴比妥钠为北京育才精细化工厂产品，尿激酶为广东天普生化制药有限公司产品，QP6A由我们用液相法合成。Wistar大鼠[一级，雄性，(250±50)g]购自北京大学医学部实验动物科学部。
1.1 模型
1.1.1 血栓的制备 往垂直固定的玻璃管(长15 mm，内径2.5 mm，外径5.0 mm，管底用胶塞密封)中注入0.1 ml枸橼酸化的大鼠动脉血液,该血液复钙未凝。往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0.2 mm的不锈钢丝绕成,螺旋部分长12 mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0 mm，托柄与螺旋相连，长7.0 mm，呈问号型。血液凝固15 min后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精确称重(质量范围为74～84 mg)。
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1.1.2 旁路管道的制备 旁路管道由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60.0 mm，内径3.5 mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0 mm，内径1.0 mm，外径2.0 mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0 mm，另一端的外部套一段长7.0 mm，外径为3.5 mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内，胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50 IU.kg-1)，备用。
1.1.3 大鼠颈动静脉旁路插管模型 Wistar大鼠(雄性，250～300 g)按80 mg.kg-1剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定后进行手术：分离气管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段内血栓固定螺旋的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50 IU.kg-1)，此时注射器不要撤离聚乙烯管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉。此即大鼠动静脉旁路溶栓模型。
, http://www.100md.com
1.1.4 溶栓评价 用头皮针将生理盐水(3 ml.kg-1)，尿激酶的生理盐水溶液(20 000 IU.kg-1)或QP6A的生理盐水溶液(10 μmol.kg-1)通过旁路管的中段，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处缓慢注入到血液中(约6 min)。使生理盐水(空白对照)，尿激酶(阳性对照)或QP6A(治疗剂)通过血液循环，按静脉—心脏—动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，1 h后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计各组的血栓质量差值(
±s)，并做t检验。2 结果
空白对照组，阳性对照组和QP6A组的血栓减重值列入表1。
, 百拇医药
表1 由生理盐水，尿激酶以及QP6A导致的血栓减重(
±s)Table 1 Reduction of thrombus with NS,UK and QP6A (
±s) GroupsDosage
m/mg
NS
3 ml.kg-1
0.76±7.40
UK
, 百拇医药
20 000 IU.kg-1
12.81±5.15
QP6A
10 μmol.kg-1
8.65±5.79
m， reduction mass of thrombus；NS，normal saline；UK，urokinase；n=10，comparing with NS，P<0.05.
从表1的血栓减重情况以及统计结果看，QP6A显示了明显的溶栓作用。
3 讨论
, http://www.100md.com
本文提供的模型是大鼠动静脉旁路(丝线法)抗血栓模型和大鼠动脉溶血栓模型的融合与改进。与前者不同的是，旁路管道中段内的丝线换成了本模型中血栓包裹的不锈钢质血栓固定螺旋，中段管的内径由1.5 mm增至3.5 mm，动物由血栓形成前给药变为血栓放入中段管后给药，治疗时间由15 min延长到1 h；与后者不同的是，血栓固定螺旋由漏斗状改为圆柱状，螺旋的长度由20 mm缩短为15 mm，旁路管道的中段管内径由5.0 mm缩小为3.5 mm，由动脉旁路插管变为动静脉旁路插管。本文对原有模型的改进有可能带来一些好处，例如适当缩小中段管路的内径可保持血流在各段的速度差别不大，又例如血栓固定螺旋改为圆柱形有可能避免漏斗型血栓承受的血流冲击力。这些都有助于提高模型的可重复性。另外，本文提供的模型也保留了所述两个模型的固有优点，例如手术不太复杂，容易掌握；器械简便，容易制作；血栓由枸橼酸化后复钙的大鼠血液制作，它的成分与临床的血栓成分接近；制备的血栓固定在带托柄的螺旋上，可以方便地准确称量。
本文提供的模型制作的血栓(包括血栓固定螺旋)质量可以稳定在74～84 mg的范围内，这类血栓在生理盐水组中的质量变化绕零点摆动，在尿激酶(20 000 IU.kg-1)组中则明显减重，幅度可以达到(12.81±5.15) mg，与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)。这些结果说明了本文提供的模型有明确的稳定性与可靠性，可用于活性评价。
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本文采用该模型以生理盐水作空白对照，以尿激酶作阳性对照(剂量为20 000 IU.kg-1)，测定了QP6A的溶血栓作用。发现在10 μmol.kg-1剂量下，QP6A可以使血栓明显减重，幅度可以达到(8.65±5.79)mg，与生理盐水组比较差异有显著性(P<0.05)，与尿激酶组(20 000 IU.kg-1)比较差异无显著性(P>0.05)。本实验证实了QP6A的溶栓作用，为深入进行临床前药效学研究提供了基础。■
参考文献
[1]汪 钟.血栓法.见：药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1994.1124
[2]陈家树，梁陆光.一个新的可定量的大鼠血栓模型[J].中国药理学通报，1996，12(5)：473-474
, http://www.100md.com
[3]Belew M, Gerdin B, Larsson L, et al. Structure-activity relationships of vasoactive peptides derived from fibrin or fibrinogen degraded by plasmin[J]. Biochem Biophysica Acta， 1980,621: 169-173
[4]Mehta JL， Nichols WW， Saldeen J. Effects of peptide 6A on coronary blood flow dynamics in canine coronary thrombosis[J]. J Cardiovasc Pharmacol， 1989,13(6):803-811
[5]赵 明，彭师奇，程铁明，等.P6A的合成和功能[J].化学通报， 1990，12：29-30
[6]赵 明，彭师奇，蔡孟深，等.P6A的结构修饰与舒血管活性[J].自然科学进展， 1993，3(6)：529-534
收稿日期：1999-11-18, 百拇医药