人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化
作者：狄春辉 钟英成 施群
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：肌钙蛋白；代谢；人心肌肌钙蛋白I；大肠杆菌； 基因转移； 心血管疾病；诊断
北京医科大学学报000420 [摘 要] 目的：获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法。方法：利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA，并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白，纯化后用Western-blot进行鉴定。结果：从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA，克隆并在大肠杆菌中表达，表达量达30%以上。经离子交换柱纯化，最终产物纯度在95%以上。可与其特异性单克隆抗体反应。结论：cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化，为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法。
, 百拇医药
[中图分类号] Q51 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0351-03
The expression and purification of human cTnI overexpressed in E.coli
DI Chun-Hui
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ZHONG Ying-Cheng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药 SHI Qun
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To obtain and purify rhcTnI. Methods: cDNA encoding cTnI was amplified from heart muscle cDNA library by PCR and then subcloned into prokarytic vector with a thrombin linker. MS2-cTnI fusion protein was expressed in E.coli. Results: Up to 30% of total bacterial proteins were rhcTnI as shown in SDS-PAGE gel. The rhc TnI was purified to 95% homogeneity. Conclusion: rhc TnI can be expressed in E.coli in high quantity and purified to hear homogeneity.
, 百拇医药
KEY WORDS Troponin/metab; cTnI; Escherichia coli; Gene transfer; Cardiovascular diseases/diag
(J Beijing Med Univ, 2000,32:351-353)
肌钙蛋白(tropouin, Tn)是与心肌和骨骼肌收缩有关的调节蛋白，它由肌钙蛋白I(inhibitory component，TnI)、T(tropomyosin-binding component, TnT)、C(calcinmbinding component, TnC)3个亚基组成，TnI可分为骨骼肌快反应(fsTnI)、慢反应(ssTNI)和心肌(cTnI)3种亚型，cTnI基因长约6.2 kb，由8个外显子组成，可以编码205个 氨基酸的蛋白质，其相对分子质量为22 500，cTnI与fsTnI和ssTnI有40%的同源性，主要区别在1、2、3位外显子。 在cTnI 1、2、3外显子较长，可编码N端的47个氨基酸，而在sTnI 1、2、3外显子短，只能编码N端21个氨基酸，较cTnI短26个氨基酸，5、6、7外显子在cTnI和sTnI具有高度的同源性。心肌钙蛋白Ⅰ是心脏特有的一种收缩调节蛋白，心肌缺血、缺氧损伤时，心肌肌钙蛋白大量释放入血，可使血液中肌钙蛋白Ⅰ的水平明显升高，具有高度的心肌特异性，因此它可作为心肌损伤的一种特异指标，在心血管病的诊断中具有十分重要的意义。目前国外已研制出了检测cTnI的试剂盒，并在临床上广泛推广，收到了良好的社会和经济效益。而国内在这方面仍是空白，依赖进口产品，其价格昂贵，急需研制价廉、有效的cTnI检测试剂盒，以满足需要。为此本室 利用基因工程技术成功地在大肠杆菌中高效表达了人重组cTnI，并获得高纯度产品，这一成果为cTnI检测试剂盒的研究与开发提供了有力的基础[1]。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌pop2136(含CI857基因)为温控表达菌，pMTY4为本室构建的表达质粒[2], pGEM-3Zf(t)购自Promega公司。
1.2 PCR反应模板
取100 mg人心肌组织,研磨后利用美国GIBCO公司的TRIzol试剂盒，提取总RNA,逆转录合成cDNA作为PCR反应模板。
1.3 cTnI cDNA的PCR扩增
按文献[3]报道的cTnI序列设计引物，其中5′引物为5′-CTC ACC ATG GCG GAT GGG AGC AGC-3′，编码去除信号肽后的成熟cTnI蛋白，3′引物为5′-AGA GAA GCT TAT TCC TCA GTG GCC C-3′，内含Hind Ⅲ切点和TAA终止密码，以上述人心肌肌肉 cDNA文库为模板，按照常规PCR技术扩增35轮，琼脂糖电泳回收PCR产物。
, 百拇医药
1.4 cTnI表达质粒的构建
纯化的cTnI PCR产物先用Klenow处理，再用Hind Ⅲ消化，pMTY4的载体用Stu I和Hind Ⅲ双切，电泳回收大片段，将上述PCR产物与载体大片段连接，获得cTnI融合蛋白的高效表达质粒pMTY4- cTnI(图1)。
图1 pMT-cTnI质粒构建图
Figure 1 pMT-cTnI plasmid map
1.5 表达质粒pMTY4-cTnI
经过EcoRI和HindⅢ双酶切， 将cTnI cDNA片段插入pGEM-3Zf(+) 质粒，利用ALF Express Ⅱ自动序列测定仪(Pharmacia)进行测序，将结果与公布的序列相比较。
, 百拇医药
1.6 重组hcTnI的表达纯化和SDS-PAGE分析
按本室hIL-3操作方法略有改动。大肠杆菌表达的人重组cTnI以包涵体形式存在，经变性复性，利用Pharmcia公司的Gradi Frac System经两次阴离子交换层析，收集各层析峰进行电泳分析。
1.7 重组hcTnI的Western-blot鉴定
将重组的cTnI进行SDS-PAGE电泳，电泳后用半干式转移槽将gel上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，随后做免疫反应。首先，用3%(体积分数)的牛血清白蛋白封闭30 min，再用PBS洗2次，接着加一抗(抗cTnI的单克隆抗体)，室温作用2 h；用含0.2%(体积分数)的toween-20的PBS洗5次，加酶标二抗(碱磷酶标记的抗小鼠IgG抗体)，室温作用2 h，再用含0.2%(体积分数)的toween-20的PBS洗5次，最后加底物显色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 cTnI cDNA的扩增
琼脂糖电泳结果表明，出现700多bp的PCR扩增产物，与预期结果一致，DNA序列分析结果与公布cTnI的序列完全一致(图略)。
2.2 pMTY4-cTnI表达质粒的鉴定和表达
经PvuⅡ、XhoI、SmaI、EcoR I、Hind Ⅲ酶切鉴定，pMTY4-cTnI质粒酶切图谱与预期结果一致，证明构建成功。经转化大肠杆菌进行表达，SDS-PAGE分析发现在36 000处有明显表达带，与预期相对分子质量一致。表达量约占细菌总蛋白30%，表达的 cTnI经离子交换层析获高纯度cTnI，利用Gene公司的SYSGENE 成像系统分析纯度大于95%(图2)。
, 百拇医药
1, purified rhc TnI; 2, recovery rhc TnI; 3, inclusion body of rhc TnI;
4, rhc TnI after induce; 5, rhc TnI before induce;
6, mid-range protein molecular weight marker.
图2 重组人心肌肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及纯化的电泳结果
Figure 2 SDS-PAGE electrphoresis of rhc TnI
2.3 cTnI的Western-blot分析
Western-blot的结果表明本室表达的人重组cTnI可与进口的抗cTnI单克隆抗体特异反应(图3)，再次证明了我们获得了正确的重组cTnI克隆。
, 百拇医药
A1, pruified rhc TnI; A2, control (host bacterial protein);
B1, purified rhc TnI; B2, control (host bacterial protein).
图3 重组人心肌钙蛋白Western blot鉴定结果
Figure 3 Results of rhc TnI Westem-blot
3 讨论
心血管疾病是威胁人类生命的主要疾病之一，人们一直在努力寻找灵敏度高，特异性强的诊断指标。近年关于心肌肌钙蛋白的研究表明，心肌肌钙蛋白具有高度的心肌特异性，当心肌细胞损伤时，在血液中cTnI出现持续时间长，和心肌损伤程度及预后密切相关。因此它可作为心肌损伤的一种特异指标，在心血管病的诊断中具有十分重要的意义。
, http://www.100md.com
由于天然来源的cTnI含量低，无法批量提供。因此我们采用基因工程的方法，利用大肠杆菌表达系统大量获得cTnI。在cTnI的基因克隆及表达过程中，由于cTnI是一个外源基因，故很难在大肠杆菌中直接表达。为此，我们采用表达融合蛋白的方法，在cTnI前加上一段噬菌体的蛋白质MS2聚合酶片段，这样就获得了cTnI的高效表达克隆，表达量可达菌体蛋白质的30%以上。核酸序列测定结果与国外报道的序列一致，表达产物可与进口的抗cTnI单克隆抗体特异性反应。这一成果的取得为今后研究和开发cTnI的临床检测试剂提供了基础。
参考文献
1，王晓红，狄春辉，刘乃奎.肌钙蛋白I与心血管疾病[J].中国动脉硬化杂志,1999，5:12
2，Liu HT, Wang YG, Zhang YM， et al. Traf19, a Novel apoptosis-Related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal[J], BBRC,1999,254:203-210
3，Armour KL, Harris WJ, Tempest PR, et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA encoding human cardiac troponin I[J].Gene， 1993，131(2):287-292
(2000-03-31收稿), 百拇医药
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：肌钙蛋白；代谢；人心肌肌钙蛋白I；大肠杆菌； 基因转移； 心血管疾病；诊断
北京医科大学学报000420 [摘 要] 目的：获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法。方法：利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA，并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白，纯化后用Western-blot进行鉴定。结果：从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA，克隆并在大肠杆菌中表达，表达量达30%以上。经离子交换柱纯化，最终产物纯度在95%以上。可与其特异性单克隆抗体反应。结论：cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化，为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法。
, 百拇医药
[中图分类号] Q51 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0351-03
The expression and purification of human cTnI overexpressed in E.coli
DI Chun-Hui
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ZHONG Ying-Cheng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药 SHI Qun
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To obtain and purify rhcTnI. Methods: cDNA encoding cTnI was amplified from heart muscle cDNA library by PCR and then subcloned into prokarytic vector with a thrombin linker. MS2-cTnI fusion protein was expressed in E.coli. Results: Up to 30% of total bacterial proteins were rhcTnI as shown in SDS-PAGE gel. The rhc TnI was purified to 95% homogeneity. Conclusion: rhc TnI can be expressed in E.coli in high quantity and purified to hear homogeneity.
, 百拇医药
KEY WORDS Troponin/metab; cTnI; Escherichia coli; Gene transfer; Cardiovascular diseases/diag
(J Beijing Med Univ, 2000,32:351-353)
肌钙蛋白(tropouin, Tn)是与心肌和骨骼肌收缩有关的调节蛋白，它由肌钙蛋白I(inhibitory component，TnI)、T(tropomyosin-binding component, TnT)、C(calcinmbinding component, TnC)3个亚基组成，TnI可分为骨骼肌快反应(fsTnI)、慢反应(ssTNI)和心肌(cTnI)3种亚型，cTnI基因长约6.2 kb，由8个外显子组成，可以编码205个 氨基酸的蛋白质，其相对分子质量为22 500，cTnI与fsTnI和ssTnI有40%的同源性，主要区别在1、2、3位外显子。 在cTnI 1、2、3外显子较长，可编码N端的47个氨基酸，而在sTnI 1、2、3外显子短，只能编码N端21个氨基酸，较cTnI短26个氨基酸，5、6、7外显子在cTnI和sTnI具有高度的同源性。心肌钙蛋白Ⅰ是心脏特有的一种收缩调节蛋白，心肌缺血、缺氧损伤时，心肌肌钙蛋白大量释放入血，可使血液中肌钙蛋白Ⅰ的水平明显升高，具有高度的心肌特异性，因此它可作为心肌损伤的一种特异指标，在心血管病的诊断中具有十分重要的意义。目前国外已研制出了检测cTnI的试剂盒，并在临床上广泛推广，收到了良好的社会和经济效益。而国内在这方面仍是空白，依赖进口产品，其价格昂贵，急需研制价廉、有效的cTnI检测试剂盒，以满足需要。为此本室 利用基因工程技术成功地在大肠杆菌中高效表达了人重组cTnI，并获得高纯度产品，这一成果为cTnI检测试剂盒的研究与开发提供了有力的基础[1]。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌pop2136(含CI857基因)为温控表达菌，pMTY4为本室构建的表达质粒[2], pGEM-3Zf(t)购自Promega公司。
1.2 PCR反应模板
取100 mg人心肌组织,研磨后利用美国GIBCO公司的TRIzol试剂盒，提取总RNA,逆转录合成cDNA作为PCR反应模板。
1.3 cTnI cDNA的PCR扩增
按文献[3]报道的cTnI序列设计引物，其中5′引物为5′-CTC ACC ATG GCG GAT GGG AGC AGC-3′，编码去除信号肽后的成熟cTnI蛋白，3′引物为5′-AGA GAA GCT TAT TCC TCA GTG GCC C-3′，内含Hind Ⅲ切点和TAA终止密码，以上述人心肌肌肉 cDNA文库为模板，按照常规PCR技术扩增35轮，琼脂糖电泳回收PCR产物。
, 百拇医药
1.4 cTnI表达质粒的构建
纯化的cTnI PCR产物先用Klenow处理，再用Hind Ⅲ消化，pMTY4的载体用Stu I和Hind Ⅲ双切，电泳回收大片段，将上述PCR产物与载体大片段连接，获得cTnI融合蛋白的高效表达质粒pMTY4- cTnI(图1)。
图1 pMT-cTnI质粒构建图
Figure 1 pMT-cTnI plasmid map
1.5 表达质粒pMTY4-cTnI
经过EcoRI和HindⅢ双酶切， 将cTnI cDNA片段插入pGEM-3Zf(+) 质粒，利用ALF Express Ⅱ自动序列测定仪(Pharmacia)进行测序，将结果与公布的序列相比较。
, 百拇医药
1.6 重组hcTnI的表达纯化和SDS-PAGE分析
按本室hIL-3操作方法略有改动。大肠杆菌表达的人重组cTnI以包涵体形式存在，经变性复性，利用Pharmcia公司的Gradi Frac System经两次阴离子交换层析，收集各层析峰进行电泳分析。
1.7 重组hcTnI的Western-blot鉴定
将重组的cTnI进行SDS-PAGE电泳，电泳后用半干式转移槽将gel上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，随后做免疫反应。首先，用3%(体积分数)的牛血清白蛋白封闭30 min，再用PBS洗2次，接着加一抗(抗cTnI的单克隆抗体)，室温作用2 h；用含0.2%(体积分数)的toween-20的PBS洗5次，加酶标二抗(碱磷酶标记的抗小鼠IgG抗体)，室温作用2 h，再用含0.2%(体积分数)的toween-20的PBS洗5次，最后加底物显色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 cTnI cDNA的扩增
琼脂糖电泳结果表明，出现700多bp的PCR扩增产物，与预期结果一致，DNA序列分析结果与公布cTnI的序列完全一致(图略)。
2.2 pMTY4-cTnI表达质粒的鉴定和表达
经PvuⅡ、XhoI、SmaI、EcoR I、Hind Ⅲ酶切鉴定，pMTY4-cTnI质粒酶切图谱与预期结果一致，证明构建成功。经转化大肠杆菌进行表达，SDS-PAGE分析发现在36 000处有明显表达带，与预期相对分子质量一致。表达量约占细菌总蛋白30%，表达的 cTnI经离子交换层析获高纯度cTnI，利用Gene公司的SYSGENE 成像系统分析纯度大于95%(图2)。
, 百拇医药
1, purified rhc TnI; 2, recovery rhc TnI; 3, inclusion body of rhc TnI;
4, rhc TnI after induce; 5, rhc TnI before induce;
6, mid-range protein molecular weight marker.
图2 重组人心肌肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及纯化的电泳结果
Figure 2 SDS-PAGE electrphoresis of rhc TnI
2.3 cTnI的Western-blot分析
Western-blot的结果表明本室表达的人重组cTnI可与进口的抗cTnI单克隆抗体特异反应(图3)，再次证明了我们获得了正确的重组cTnI克隆。
, 百拇医药
A1, pruified rhc TnI; A2, control (host bacterial protein);
B1, purified rhc TnI; B2, control (host bacterial protein).
图3 重组人心肌钙蛋白Western blot鉴定结果
Figure 3 Results of rhc TnI Westem-blot
3 讨论
心血管疾病是威胁人类生命的主要疾病之一，人们一直在努力寻找灵敏度高，特异性强的诊断指标。近年关于心肌肌钙蛋白的研究表明，心肌肌钙蛋白具有高度的心肌特异性，当心肌细胞损伤时，在血液中cTnI出现持续时间长，和心肌损伤程度及预后密切相关。因此它可作为心肌损伤的一种特异指标，在心血管病的诊断中具有十分重要的意义。
, http://www.100md.com
由于天然来源的cTnI含量低，无法批量提供。因此我们采用基因工程的方法，利用大肠杆菌表达系统大量获得cTnI。在cTnI的基因克隆及表达过程中，由于cTnI是一个外源基因，故很难在大肠杆菌中直接表达。为此，我们采用表达融合蛋白的方法，在cTnI前加上一段噬菌体的蛋白质MS2聚合酶片段，这样就获得了cTnI的高效表达克隆，表达量可达菌体蛋白质的30%以上。核酸序列测定结果与国外报道的序列一致，表达产物可与进口的抗cTnI单克隆抗体特异性反应。这一成果的取得为今后研究和开发cTnI的临床检测试剂提供了基础。
参考文献
1，王晓红，狄春辉，刘乃奎.肌钙蛋白I与心血管疾病[J].中国动脉硬化杂志,1999，5:12
2，Liu HT, Wang YG, Zhang YM， et al. Traf19, a Novel apoptosis-Related gene cloned from human leukemia cell line TF-1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal[J], BBRC,1999,254:203-210
3，Armour KL, Harris WJ, Tempest PR, et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA encoding human cardiac troponin I[J].Gene， 1993，131(2):287-292
(2000-03-31收稿), 百拇医药