老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞细胞外基质成分和基底膜厚度的变化
作者：邱忠民 何冰 宋明臣 李海潮
单位：北京大学第一医院呼吸内科，北京 100034
关键词：肺泡；细胞外基质；基底膜；解剖学和组织学；衰老
北京医科大学学报000621 [摘 要]目的：探讨老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞细胞外基质成分和基底膜厚度的变化。方法：用免疫细胞化学和图像分析技术分析幼年(1～2个月)、中年(8～9个月)和老年(25～28个月)大鼠肺泡Ⅱ型细胞层粘连蛋白和纤维连接蛋白的变化及肺泡Ⅱ型细胞基底膜的厚度。结果：老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞层粘连蛋白减少，纤维连接蛋白增多，基底膜增厚。结论：老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞细胞外基质的代谢发生改变，可能导致肺泡修复能力的异常。
[中图分类号]Q242-332 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0555-02
, http://www.100md.com
Changes of extracellular matrix in type Ⅱ cells and thickness of basement membrane in old rats
QIU Zhong-Min,HE Bing,SONG Ming-Chen,LI Hai-Chao
(Division of Respiratory Medicine,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China)
ABSTRACT Objective：To observe the changes of extracellular matrix in type Ⅱ cells and thickness of basement membrane beneath type Ⅱ cells in old rats.Methods:Inmmunocytochemistry and image analysis were used to measure the relative contents of laminin and fibronectin in type Ⅱ cells in young (1-2 months),adult (8-9 months) and old (25-28 months) rats.Results：There were less laminin,more fibronectin in type Ⅱ cells and thicker basement membrane beneath type Ⅱ cells in old rats.Conclusion：These results suggest the altered metabolism of extracellular matrix from type Ⅱ cells in old rats,which may result in abnormal recovery of alveoli after being injured.
, 百拇医药
KEY WORDS Pulmonary alveoli；Extracellular matrix;Basilar membrane/anat；Aging
老年肺的特点是其结构和功能的退行性变，因此对外界致病因素抵抗力弱，易患呼吸道感染、慢性阻塞性肺病和肺癌等疾病[1]。一般认为老年肺的发生是由于肺内细胞和细胞外基质发生衰老性改变的结果。以往的研究多侧重于探讨老年肺时肺内成纤维细胞对细胞外基质的影响，而对肺上皮细胞和细胞外基质相互作用研究很少。本文通过观察老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞的细胞外基质成分层粘连蛋白(laminin,Ln)、纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)和基底膜厚度的变化，以探讨这种相互作用在老年肺的变化及其意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠，由我校实验动物中心提供，分为幼年组(1～2个月)、中年组(8～9个月)和老年组(25～28个月)3组，每组30只。
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1.2 肺泡Ⅱ型细胞基底膜厚度的分析
每组6只大鼠，以50 mg.kg-1腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉。气管内注入单宁酸-戊二醛-0.075 mol.L-1磷酸缓冲液(pH 7.2)，保持1.96 kPa的压力使肺膨胀。内固定15 min后，在左肺上下两叶各取小块肺组织，切成1～2 cm3大小，于上述固定液中室温固定1 h，0.18 mol.L-1蔗糖-0.075 mol.L-1磷酸缓冲液漂洗4次，每次10 min。行电镜常规制片。以细胞表面有微绒毛及胞浆有嗜锇板层体颗粒为肺泡Ⅱ型细胞识别标志，于透射电镜(日本JEM100CX-11型)下放大4万倍对其基底膜照相，每个标本按随机表随机摄4～5张。每组各获底片29张。用德国IBAS-2000图像处理系统求出基底膜的面积和最大长径。面积和最大长径之比为基底膜的平均厚度(nm)。
, 百拇医药
1.3 细胞免疫化学
各组大鼠各24只，按文献[2]所报道的方法进行Ⅱ型细胞的分离、纯化和培养。将分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞接种于无菌盖玻片上，37 ℃，5%(体积分数)CO2的条件下分别培养24、48和96 h。PBS冲洗，预冷的多聚甲醛固定5 min，PBS洗5 min×3次。TritonX-100室温处理15 min。按照辣根过氧化物酶标记的SP组化试剂盒(中山公司)说明书进行免疫细胞化学染色。兔抗鼠Ln或Fn多克隆抗体(美国Gibco)的体积比为1∶100，阴性对照采用PBS代替I抗。每组按随机表随机取15张切片，于IBAS-2000图像处理系统随机扫描3个视野，分别求出积分吸光值和细胞总面积，两者之比为每个细胞的平均吸光密度比。
1.4 数据分析
实验数据用方差分析统计方法。
2 结果
, 百拇医药
2.1 老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜厚度的变化
一般形态观察见老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞游离面的微绒毛减少、脱落或消失，细胞部分与基底膜分离。胞内板层体结构尚清晰，与中幼年相比并无大的改变。部分板层体呈空泡样变，但这种改变并非老年大鼠特有，幼年和中年组肺泡Ⅱ型细胞板层体也有类似现象。肺泡上皮基底膜为典型的3层结构，即靠细胞上皮面的稀疏外层、靠肺间质的稀疏内层和两者之间的电子致密层。各年龄组肺泡Ⅱ型细胞基侧部均可见胞浆突起伸入或穿过基底膜，引起基底膜的中断。不同年龄组大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜的厚度分别为：幼年组(83±24) nm、中年组(135±47) nm和老年组(219±73) nm。老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜明显增厚，与前两组相比，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞Ln和Fn的变化
肺泡Ⅱ型细胞培养24 h后，贴壁生长呈圆形，单个散在分布，单宁酸染色见胞浆内布满呈深黑色的板层体颗粒。培养48～72 h，可见细胞伸展变扁，细胞体积增大，胞体呈多角形，细胞融合呈单细胞层。培养96 h，细胞体积进一步增大，而细胞数量有所减少。免疫细胞化学显示来自不同年龄组和不同培养时间的肺泡Ⅱ型细胞均含Ln和Fn。在同一培养时间点，老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞内Ln含量减少，Fn含量增多(表1)。
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表1 不同年龄组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Fn和Ln的集成光密度(
±s)
Table 1 The integrated optical density of laminin and fibronectin in type Ⅱ pulmonary epithelial cells in rats of different age group(±s)
Group
24h
48h
96h
Young
, 百拇医药
0.327±0.019
0.283±0.041
0.320±0.026
Laminin
Adult
0.280±0.009
0.208±0.015
0.270±0.039
Old
0.267±0.031
0.186±0.017
0.265±0.035
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Young
0.255±0.016
0.266±0.012
0.216±0.014
Fibronectin
Adult
0.251±0.012
0.271±0.052
0.235±0.020
Old#＃
0.327±0.019
, 百拇医药
0.396±0.022
0.265±0.032
n=15;..P<0.01 comparied with adult and old group;## P<0.01 comparied with young and adult group.3 讨论
和肺泡I型细胞相比，肺泡Ⅱ型细胞的基底膜具有如下特点：(1)基底膜不完整，呈断裂的片状；(2)肺泡Ⅱ型细胞有胞突伸入或穿过基底膜与间质细胞及非细胞成分保持结构联系；(3)硫酸肝素蛋白多糖含量相对较少，仅为肺泡I型细胞基底膜含量的一半左右，且不象肺泡I型细胞那样主要分布于基底膜的稀疏外层，而是在3层中均匀分布。基底膜的这些特点决定肺泡Ⅱ型细胞的分化状态、功能和肺泡内定位分布[3]，而基底膜成分和结构的相对稳定则有赖于肺泡Ⅱ型细胞对基底膜细胞外基质成分的代谢[4]。
, 百拇医药
早年研究表明，随年龄增长，肺泡上皮基底膜逐渐增厚，尤以老年阶段明显。本科曾观察到老年大鼠肺泡上皮基底膜的增厚，并伴有基底膜Ⅳ型胶原和Ln减少，Fn增多[5]。肺泡上皮基底膜的95%由肺泡I型细胞所覆盖，上述改变可能仅反映了该细胞细胞外基质环境的变化。本文发现老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜也增厚，可能说明老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞对基底膜细胞外基质代谢能力发生了改变，致使肺泡上皮基底膜细胞外基质出现过度堆积。
肺损伤修复过程是肺泡Ⅱ型细胞增殖并向肺泡I型细胞分化，使肺泡壁重新上皮化，以恢复气血屏障。同时肺泡Ⅱ型细胞也合成、分泌并降解基底膜细胞外基质，有限的修补被破坏的肺泡上皮基底膜。已证明肺泡Ⅱ型细胞能合成和分泌IV型原胶原、Ln、Fn及硫酸肝素蛋白多糖等细胞外基质的成分[6]。Ln和Fn的合成和分泌受肺泡Ⅱ型细胞分化状态的影响。静止状态的肺泡Ⅱ型细胞仅分泌少量的Ln和Fn，但当肺泡Ⅱ型细胞处于向I型细胞分化的中间过程时，细胞外基质合成水平改变，表现为细胞内Ln基本不变，Fn明显增多，Ln/Fn比值增大[7]。合成与分泌的细胞外基质反过来又能影响肺泡Ⅱ型细胞的生物学行为，如Ln的主要功能是维持体内肺泡Ⅱ型细胞的立方形状和合成与分泌表面活性物质的能力，而Fn则是促使肺泡Ⅱ型细胞向肺泡Ⅰ型细胞的转变。因此，肺泡Ⅱ型细胞和基底膜细胞外基质的相互作用贯穿于整个修复过程。本实验中不同培养时间幼年大鼠肺泡Ⅱ型细胞内Ln及Fn含量的变化规律与以往文献报道的基本一致，但取自老年大鼠的肺泡Ⅱ型细胞在同一培养时间点细胞内Ln减少，Fn增多，可能是老年大鼠肺泡上皮基底膜Ln含量下降，Fn增多的原因。并可能导致肺泡修复能力的异常，致使修复不及时或不完全，参与老年肺形态结构和功能改变的形成。
, 百拇医药
参考文献
1，Kauffmann F,Frette C.The aging lung:an epidemiological perspective[J].Respir Med,1993,87:5-7
2 邱忠民，何冰，宋明臣.肺泡Ⅱ型细胞的分离纯化及年龄对其增殖的作用[J].北京医科大学学报,1998,30(2):156-159
3，Lwebuga Mukasa.Matrix-driven pneumocyte differentiation.Am Rev Respir Dis,1991,144:452-457
4，Dunsmore SE,Rannels DE.Turnover of extracellular matrix by type Ⅱ pulmonary epithelial cells[J].Am J Physiol,1995,268:L336-L346
, http://www.100md.com
5，刘新民，何 冰.大鼠肺细胞外基质的研究[J].中华老年医学杂志,1996,15:170-172
6，Dunsmore SE,Martinez-Williams C,Goodman RA,et al.Composition of extracellular matrix of type Ⅱ pulmonary epithelial cells in primary culture[J].Am J Physiol，1995，269:L754-L765
7，Dunsmore SE,Lee YC,Martinez-Williams C,et al.Synthesis of fibronectin and laminin by type Ⅱ pulmonary epithelial cells[J].Am J Physiol，1996，270:L215-L223
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药
单位：北京大学第一医院呼吸内科，北京 100034
关键词：肺泡；细胞外基质；基底膜；解剖学和组织学；衰老
北京医科大学学报000621 [摘 要]目的：探讨老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞细胞外基质成分和基底膜厚度的变化。方法：用免疫细胞化学和图像分析技术分析幼年(1～2个月)、中年(8～9个月)和老年(25～28个月)大鼠肺泡Ⅱ型细胞层粘连蛋白和纤维连接蛋白的变化及肺泡Ⅱ型细胞基底膜的厚度。结果：老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞层粘连蛋白减少，纤维连接蛋白增多，基底膜增厚。结论：老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞细胞外基质的代谢发生改变，可能导致肺泡修复能力的异常。
[中图分类号]Q242-332 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0555-02
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Changes of extracellular matrix in type Ⅱ cells and thickness of basement membrane in old rats
QIU Zhong-Min,HE Bing,SONG Ming-Chen,LI Hai-Chao
(Division of Respiratory Medicine,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China)
ABSTRACT Objective：To observe the changes of extracellular matrix in type Ⅱ cells and thickness of basement membrane beneath type Ⅱ cells in old rats.Methods:Inmmunocytochemistry and image analysis were used to measure the relative contents of laminin and fibronectin in type Ⅱ cells in young (1-2 months),adult (8-9 months) and old (25-28 months) rats.Results：There were less laminin,more fibronectin in type Ⅱ cells and thicker basement membrane beneath type Ⅱ cells in old rats.Conclusion：These results suggest the altered metabolism of extracellular matrix from type Ⅱ cells in old rats,which may result in abnormal recovery of alveoli after being injured.
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KEY WORDS Pulmonary alveoli；Extracellular matrix;Basilar membrane/anat；Aging
老年肺的特点是其结构和功能的退行性变，因此对外界致病因素抵抗力弱，易患呼吸道感染、慢性阻塞性肺病和肺癌等疾病[1]。一般认为老年肺的发生是由于肺内细胞和细胞外基质发生衰老性改变的结果。以往的研究多侧重于探讨老年肺时肺内成纤维细胞对细胞外基质的影响，而对肺上皮细胞和细胞外基质相互作用研究很少。本文通过观察老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞的细胞外基质成分层粘连蛋白(laminin,Ln)、纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)和基底膜厚度的变化，以探讨这种相互作用在老年肺的变化及其意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠，由我校实验动物中心提供，分为幼年组(1～2个月)、中年组(8～9个月)和老年组(25～28个月)3组，每组30只。
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1.2 肺泡Ⅱ型细胞基底膜厚度的分析
每组6只大鼠，以50 mg.kg-1腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉。气管内注入单宁酸-戊二醛-0.075 mol.L-1磷酸缓冲液(pH 7.2)，保持1.96 kPa的压力使肺膨胀。内固定15 min后，在左肺上下两叶各取小块肺组织，切成1～2 cm3大小，于上述固定液中室温固定1 h，0.18 mol.L-1蔗糖-0.075 mol.L-1磷酸缓冲液漂洗4次，每次10 min。行电镜常规制片。以细胞表面有微绒毛及胞浆有嗜锇板层体颗粒为肺泡Ⅱ型细胞识别标志，于透射电镜(日本JEM100CX-11型)下放大4万倍对其基底膜照相，每个标本按随机表随机摄4～5张。每组各获底片29张。用德国IBAS-2000图像处理系统求出基底膜的面积和最大长径。面积和最大长径之比为基底膜的平均厚度(nm)。
, 百拇医药
1.3 细胞免疫化学
各组大鼠各24只，按文献[2]所报道的方法进行Ⅱ型细胞的分离、纯化和培养。将分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞接种于无菌盖玻片上，37 ℃，5%(体积分数)CO2的条件下分别培养24、48和96 h。PBS冲洗，预冷的多聚甲醛固定5 min，PBS洗5 min×3次。TritonX-100室温处理15 min。按照辣根过氧化物酶标记的SP组化试剂盒(中山公司)说明书进行免疫细胞化学染色。兔抗鼠Ln或Fn多克隆抗体(美国Gibco)的体积比为1∶100，阴性对照采用PBS代替I抗。每组按随机表随机取15张切片，于IBAS-2000图像处理系统随机扫描3个视野，分别求出积分吸光值和细胞总面积，两者之比为每个细胞的平均吸光密度比。
1.4 数据分析
实验数据用方差分析统计方法。
2 结果
, 百拇医药
2.1 老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜厚度的变化
一般形态观察见老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞游离面的微绒毛减少、脱落或消失，细胞部分与基底膜分离。胞内板层体结构尚清晰，与中幼年相比并无大的改变。部分板层体呈空泡样变，但这种改变并非老年大鼠特有，幼年和中年组肺泡Ⅱ型细胞板层体也有类似现象。肺泡上皮基底膜为典型的3层结构，即靠细胞上皮面的稀疏外层、靠肺间质的稀疏内层和两者之间的电子致密层。各年龄组肺泡Ⅱ型细胞基侧部均可见胞浆突起伸入或穿过基底膜，引起基底膜的中断。不同年龄组大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜的厚度分别为：幼年组(83±24) nm、中年组(135±47) nm和老年组(219±73) nm。老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜明显增厚，与前两组相比，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞Ln和Fn的变化
肺泡Ⅱ型细胞培养24 h后，贴壁生长呈圆形，单个散在分布，单宁酸染色见胞浆内布满呈深黑色的板层体颗粒。培养48～72 h，可见细胞伸展变扁，细胞体积增大，胞体呈多角形，细胞融合呈单细胞层。培养96 h，细胞体积进一步增大，而细胞数量有所减少。免疫细胞化学显示来自不同年龄组和不同培养时间的肺泡Ⅱ型细胞均含Ln和Fn。在同一培养时间点，老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞内Ln含量减少，Fn含量增多(表1)。
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表1 不同年龄组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Fn和Ln的集成光密度(
±s)Table 1 The integrated optical density of laminin and fibronectin in type Ⅱ pulmonary epithelial cells in rats of different age group(
±s)Group
24h
48h
96h
Young
, 百拇医药
0.327±0.019
0.283±0.041
0.320±0.026
Laminin
Adult
0.280±0.009
0.208±0.015
0.270±0.039
Old
0.267±0.031
0.186±0.017
0.265±0.035
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Young
0.255±0.016
0.266±0.012
0.216±0.014
Fibronectin
Adult
0.251±0.012
0.271±0.052
0.235±0.020
Old#＃
0.327±0.019
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0.396±0.022
0.265±0.032
n=15;..P<0.01 comparied with adult and old group;## P<0.01 comparied with young and adult group.3 讨论
和肺泡I型细胞相比，肺泡Ⅱ型细胞的基底膜具有如下特点：(1)基底膜不完整，呈断裂的片状；(2)肺泡Ⅱ型细胞有胞突伸入或穿过基底膜与间质细胞及非细胞成分保持结构联系；(3)硫酸肝素蛋白多糖含量相对较少，仅为肺泡I型细胞基底膜含量的一半左右，且不象肺泡I型细胞那样主要分布于基底膜的稀疏外层，而是在3层中均匀分布。基底膜的这些特点决定肺泡Ⅱ型细胞的分化状态、功能和肺泡内定位分布[3]，而基底膜成分和结构的相对稳定则有赖于肺泡Ⅱ型细胞对基底膜细胞外基质成分的代谢[4]。
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早年研究表明，随年龄增长，肺泡上皮基底膜逐渐增厚，尤以老年阶段明显。本科曾观察到老年大鼠肺泡上皮基底膜的增厚，并伴有基底膜Ⅳ型胶原和Ln减少，Fn增多[5]。肺泡上皮基底膜的95%由肺泡I型细胞所覆盖，上述改变可能仅反映了该细胞细胞外基质环境的变化。本文发现老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜也增厚，可能说明老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞对基底膜细胞外基质代谢能力发生了改变，致使肺泡上皮基底膜细胞外基质出现过度堆积。
肺损伤修复过程是肺泡Ⅱ型细胞增殖并向肺泡I型细胞分化，使肺泡壁重新上皮化，以恢复气血屏障。同时肺泡Ⅱ型细胞也合成、分泌并降解基底膜细胞外基质，有限的修补被破坏的肺泡上皮基底膜。已证明肺泡Ⅱ型细胞能合成和分泌IV型原胶原、Ln、Fn及硫酸肝素蛋白多糖等细胞外基质的成分[6]。Ln和Fn的合成和分泌受肺泡Ⅱ型细胞分化状态的影响。静止状态的肺泡Ⅱ型细胞仅分泌少量的Ln和Fn，但当肺泡Ⅱ型细胞处于向I型细胞分化的中间过程时，细胞外基质合成水平改变，表现为细胞内Ln基本不变，Fn明显增多，Ln/Fn比值增大[7]。合成与分泌的细胞外基质反过来又能影响肺泡Ⅱ型细胞的生物学行为，如Ln的主要功能是维持体内肺泡Ⅱ型细胞的立方形状和合成与分泌表面活性物质的能力，而Fn则是促使肺泡Ⅱ型细胞向肺泡Ⅰ型细胞的转变。因此，肺泡Ⅱ型细胞和基底膜细胞外基质的相互作用贯穿于整个修复过程。本实验中不同培养时间幼年大鼠肺泡Ⅱ型细胞内Ln及Fn含量的变化规律与以往文献报道的基本一致，但取自老年大鼠的肺泡Ⅱ型细胞在同一培养时间点细胞内Ln减少，Fn增多，可能是老年大鼠肺泡上皮基底膜Ln含量下降，Fn增多的原因。并可能导致肺泡修复能力的异常，致使修复不及时或不完全，参与老年肺形态结构和功能改变的形成。
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参考文献
1，Kauffmann F,Frette C.The aging lung:an epidemiological perspective[J].Respir Med,1993,87:5-7
2 邱忠民，何冰，宋明臣.肺泡Ⅱ型细胞的分离纯化及年龄对其增殖的作用[J].北京医科大学学报,1998,30(2):156-159
3，Lwebuga Mukasa.Matrix-driven pneumocyte differentiation.Am Rev Respir Dis,1991,144:452-457
4，Dunsmore SE,Rannels DE.Turnover of extracellular matrix by type Ⅱ pulmonary epithelial cells[J].Am J Physiol,1995,268:L336-L346
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5，刘新民，何 冰.大鼠肺细胞外基质的研究[J].中华老年医学杂志,1996,15:170-172
6，Dunsmore SE,Martinez-Williams C,Goodman RA,et al.Composition of extracellular matrix of type Ⅱ pulmonary epithelial cells in primary culture[J].Am J Physiol，1995，269:L754-L765
7，Dunsmore SE,Lee YC,Martinez-Williams C,et al.Synthesis of fibronectin and laminin by type Ⅱ pulmonary epithelial cells[J].Am J Physiol，1996，270:L215-L223
收稿日期：1999-04-25, 百拇医药