99mTc标记抗癌胚抗原单抗C50片段Fab’及其生物分布研究
作者：杨志 林保和 韩燕 牟阿平 孔健 张梅颖
单位：杨志 林保和 韩燕 牟阿平 张梅颖(北京大学临床肿瘤学院核医学科，北京 100036)；孔健(北京生物制品研究所)
关键词：99mTc；抗体；单克隆；癌胚抗原；同位素标记
北京医科大学学报000616 [摘 要]目的：研究克服99mTc标记抗癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)单抗体内生物半衰期长、血液廓清速度慢、晚时相放射性信号弱等缺点的方法,用直接标记法进行了99mTc标记抗CEA抗体C50片断Fab’的研究。方法:经胃蛋白酶切得的C50片断F(ab’)2用适量的2-巯基乙醇还原，Sephadex G50柱分离获得纯度大于90%的Fab’片断。取0.6～1.0 mg纯化的片段Fab’(体积<1.0 ml),加入0.4～0.8 mg葡庚糖酸钠及新鲜配制的SnCl2溶液5～10μg,然后加入新鲜淋洗的Na99mTcO4淋洗液,反应10～15min。用高压液相色谱监测放化纯度和抗体纯度。荷CL-187(结肠癌)裸鼠静脉注射99mTc-Fab’，观察标记抗体片段在不同时相的体内分布。结果：标记率大于90%。荷瘤裸鼠体内分布结果显示：在注射99mTc-Fab’ 4 h后瘤/血、瘤/肝、瘤/肺放射性摄取比分别为1.93、2.35和3.13，24 h后则分别为4.91、2.62和5.26，肿瘤的ID(%)/g(每克组织的摄取率)为2.73。虽然注射99mTc标记的全抗C50后24 h，肿瘤的ID(%)/g高达12.5，但瘤/血比值仅为1.51。结论：采用99mTc直接法标记Fab’是成功的，肿瘤与非肿瘤(T/NT)的比值除肾外在早期4 h时均大于2.0，明显高于全抗的T/NT比值，有利于在注射后短时间内获得清晰的图像，因而99mTc-C50 Fab’是很有希望的放射免疫显像药物。
, 百拇医药
[中图分类号]R730.4 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0536-04
Studies of 99mTc labeled carcinoembyronic antigen monoclonal antibody C50 fragment Fab’ and biodistrobution
YANG Zhi,LIN Bao-He,HAN Yan,MU A-Ping,ZHANG Mei-Ying
(Department of Nuclear Medicine,Peking University School of Oncology，Beijing 100036，China)
KONG Jian
, 百拇医药
(National Vaccine and Serum Institute)
ABSTRACT Objective:To study 99mTc labeled anti-CEA antibody C50 fragment Fab’ and its biodistribution.Methods:F(ab)’2 of C50 was reduced by 2-mercapthonal and purified by Sephadex G50 column.Fab’ was obtained with a purity of over 90%.0.6-1.0 mg Fab’(<1.0 ml) was mixed with 0.4-0.8 mg glucoheptonate,followed by adding 5-10 μl freshly prepared SnCl2 solution (1.0mg SnCl2 in 0.01mol.L-1 HCl).Then about 1.0ml of freshly eluted Na 99mTcO4 was added to the mixture mentioned above and the mixture was slightly shaken.The solution was incubated at room temperature for 15 min.The labeling efficiency was determined by HPLC or ITLC-SG method.Nude mice bearing CL-187 tumor xenografts were injected with 99mTc-Fab’ via vein tail and the ID(%)/g (% injected doses /g) of organs were obtained at various time points of postinjection.Results:The labeling efficiency of 99mTc-Fab’ was more than 90%.The ratios of tumor to blood,liver and lung were 1.93,2.35 and 3.13 4 hours after injection.In addition,these ratios reached up to 4.91,2.62,and 5.26,24 hours after injection respectively.4 hours and 24 hours after injection of 99mTc-Fab’,the ID(%)/g of tumor was 4.53 and 2.73 respectively.Although at the 24 th hour,the ID(%)/g of tumor of 99mTc-C50(intact) reached up to 12.5,the ratio of tumor/blood was only about 1.5.Conclusion:99mTc labeled Fab' was successfully prepared by direct labeling technique,and the T/NT ratios were more than 2.0 except that with the kidney which was significantly higher than that of 99mTc-labeled C50 (intact).These are favorable to get clear images at earlier time after injection of 99mTc-Fab'.These indicate that 99mTc-C50 Fab' seems to be a good radiopharmaceutical for RII.
, 百拇医药
KEY WORDS 99mTc;Antibodies,monoclonal;Carcinoembryonic antigen;Isotop labeling
由于99mTc在核医学诊断上具有优良的核物理性能,近年来广泛用于标记各种单克隆抗体进行放射免疫显像研究。全抗的生物半衰期一般都较长，与99mTc的物理半衰期不相匹配，而影响了使用。抗癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)抗体C50亚类为IgG1，直接进行99mTc的标记在用药后短时间内很难获得高清晰度的图像(血液清除缓慢，T/NT比值较低)，需进行双时相采集，而延长检查时间，延迟相(20～24 h)采集时放射性信号较弱，需采集较长时间才能累积足够的信号。于是我们在成功地用99mTc标记抗胃癌单抗3H11的基础上[1，2]，又进行了99mTc标记抗CEA抗体C50片段的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
2-巯基乙醇(2-mercapthonal,2-ME)，氯化亚锡和葡庚糖酸钠(glucohetonate,GH)均为AR级，Sigma公司产品；C50抗体由北京市生物制品研究所提供，Sephadex G50进口分装，SPECT由Sopha公司提供，Waters 510 HPLC为Waters公司产品，紫外分光光度计由发玛西亚公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 抗体片段Fab’的制备及其标记
抗体C50在适量的胃蛋白酶和反应介质作用一段时间后,进行纯化分离和浓缩,而获得抗体片段F(ab’)2。抗体片段F(ab’)2经2-ME还原获得片段Fab’,方法与文献[1]介绍的相似。反应一定时间后用Sephadex G50柱分离,用电泳法检测还原后抗体的相对分子质量。将纯化后的抗体片段Fab’分装,保存于-70℃的低温冰箱中,备用。
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取纯化的抗体片段Fab’ 0.6～1.0 mg(体积<1.0 ml),加入0.4～0.8 mg GH及新鲜配制的SnCl2溶液5～10 μg,再加新鲜淋洗的Na99mTcO4淋洗液,反应10～15 min，最终反应的pH为7.2。
全抗C50的还原和标记方法同前。
1.2.2 标记率及稳定性的测定
柱层析：采用Sephadex G50柱(100 mm×8 mm)，用0.01 mmol*L-1 pH7.2的PBS淋洗，上柱体积0.2 ml，收集各淋洗液于0.5 ml的试管中，共20管，分别测定各管中的放射性活度和280 nm处的紫外吸收。
将快速薄层层析-硅胶纸(ITLC-SG)裁成10 cm×1.0 cm的小条，于110℃的烘箱中烘烤30 min，置于干燥器中密封保存待用。将标记溶液1～2 μl 点于活化的ITLC-SG距底端1 cm处，2 min后分别置于两种体系中行上行展开。第一种为在生理盐水体系中，游离99mTc迁移到前沿，标记抗体留在原点；第2种为水、乙醇、氨水体积比为5∶2∶1体系,在此体系中,先将点样纸条点上7.5×10-4 mol*L-1的人血清白蛋白后再点样。胶体留在原点，其余组分展开到前沿。当展开到10 cm左右，吹干，剪成10条，用定标器测定放射性计数，计算标记率。
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采用Waters 510高压液相色谱仪(high-pressure liquid chromatography,HPLC)和蛋白分析柱及紫外和放射性双重检测装置进行标记抗体分析。淋洗剂为pH 7.2的0.01 mmol*L-1的PBS，淋洗速度为1.0 ml*min-1，淋洗时间为20 min，所得信号用计算机处理。
观察99mTc-Fab’在7.5×10-4 mol*L-1的人血清白蛋白和生理盐水及0.05 mol*L-1的二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)中的稳定性，用ELISA法测定标记抗体活性。
1.2.3 荷瘤裸鼠模型的建立及其生物分布 取6～7周龄的裸鼠，每只右腋下接种CL-187结肠癌细胞2×106，饲养于SPF级动物房。待肿瘤生长至100 mg左右(约2周,直径约0.6 cm)，各组动物(每组5只)经尾静脉注射标记物99mTc-Fab’或99mTc-C50 0.1 ml(7.4 MBq),于γ照相机下经不同时间观察放射性分布及肿瘤显像情况.用药后4 h和24 h分别处死、解剖，测定组织重量及放射性计数，计算ID(%)/g。
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2 结果
采用胃蛋白酶法切割C50，F(ab’)2的产率约为30%,用电泳法检测,纯度(质量分数)大于95%.用2-ME将F(ab’)2还原,纯化分离后得到Fab’,纯度约为90%.电泳谱带显示:全抗C50的相对分子质量为16万,F(ab’)2的相对分子质量为11万,Fab’的相对分子质量为5万～6万之间HPLC的紫外吸收峰显示：Fab’组分中含有10%(质量分数)左右的F(ab’)2。
99mTc标记C50全抗和Fab’的标记率>90%。标记后的抗体用ELISA法测定免疫活性均>80%。经除菌滤膜过滤后，标记抗体细菌和热源均符合静脉注射要求。
图1(A、B、C)为C50全抗、F(ab’)2及Fab’的紫外吸收峰，其峰时间分别为7.05、7.96和9.28 min。同时图1B和图1C均有另一小峰，前者为小碎片，后者为未还原彻底的F(ab’)2。各放射性峰出现的时间与此一致，因此可以证明99mTc标记在抗体分子上。
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3种分析方法——ITLC-SG、柱层析和HPLC测定标记率的结果基本一致，无明显差别。
图1 全抗C50及其片段F(ab’)2和Fab’的紫外吸收曲线
Figure 1 UV absorbed curve of C50 (intact),fragment of F(ab’)2 and Fab’
体外稳定性结果见表1。在3种介质中37℃放置6 h后结合在抗体分子Fab’上的99mTc>95%,在24 h仍>90%,表明在体外较为稳定,这与文献报道一致[3，4]。
表1 99mTc-Fab’的体外稳定性(%,
±s)
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Table 1 Stability of 99m Tc-Fab' in vitro (%,±s) t/h
Saline
DTPA
(50 mmol*L-1)
HSA
(7.5×10-4 mol*L-1)
0～1
99.3±0.5
98.5±0.7
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99.2±0.6
3
96.8±2.6
98.3±1.2
97.9±1.3
6
95.2±1.8
96.1±1.5
96.8±1.1
24
93.5±2.3
94.5±1.7
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95.8±2.6
n=5.
表2的动物体内分布结果显示：注射99mTc-Fab’ 4 h后其瘤/血、瘤/肝、瘤/肺的(放射性摄取)比值分别为1.93、2.35和3.13;其24 h后则分别为4.91、2.62和5.26,除肾外,24 h时T/NT比值均>2.0;肿瘤的ID(%)/g为2.73。注射99mTc标记的C50全抗24 h后，肿瘤的ID(%)/g高达12.5,但瘤/血比值仅为1.51。
99mTc-Fab’的荷瘤裸鼠显像结果表明(图2)用药后4.5 h，肿瘤已清晰可辨；到22 h时肿瘤显像已非常清晰，但肾影也非常明显。未见胃肠道和甲状腺明显的放射性浓聚，表明99mTc-Fab’体内稳定性佳。而99mTc-C50(全抗)的荷瘤裸鼠显像(图3)在4 h时肿瘤非常模糊,到21 h时显像就清晰了。
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图2 注射99mTc-Fab’后不同时间荷瘤裸鼠显像(正前位)
Figure 2 Gamma imaging of nude mice bearing CL187 colorectal
cancer in right axilla after injection 99m Tc-Fab’(AV)
3 讨论
99mTc标记抗肿瘤单抗放免显像对已知病灶的鉴别诊断，寻找原发灶以及鉴别手术疤痕与肿瘤复发具有重要意义[2]。但完整抗体分子体内生物半衰期较长，血液清除较慢，要获得较高的靶与非靶比值需要较长时间。99mTc直接标记全抗显像，一般于给药后24 h左右，方能获得满意的结果，然而99mTc的物理半衰期仅为6 h，因此晚期显像时，放射性信号较低，需要长时间采集才能获得较满意的图像。99mTc标记的抗体片段则能较好地解决这一问题。本研究表明：99mTc标记的Fab’可在注射后3～5 h显像,最晚不超过8 h,大大缩短了诊断时间和图像采集时间,减少了显像工作量及占机时间,而用于病人进行该项检查的费用也会相对降低。同时由于提高了显像质量，因此用99mTc-Fab'进行RII能比全抗进行RII检测微小残存病灶更灵敏。
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表2 99mTc-Fab′和99mTc-C50(全抗)在裸鼠体内分布
Table 2 Biodisbution of 99m Tc-Fab’ and 99m Tc-C50(intact) in nude mice Organ
t/h
99mTc-Fab’
99mTc-C50(intact,24 h)
ID(%)/g
T/NT
ID(%)/g
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T/NT
Tumor
4
453±0.71
24
2.73±0.52
12.5±1.77
Liver
4
1.99±0.32
2.35±0.38
24
1.10±0.17
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2.62±0.53
6.79±0.52
2.15±0.32
Blood
4
2.38±0.13
1.93±0.29
24
0.55±0.13
4.91±0.65
8.29±0.35
1.51±0.17
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Lung
4
1.50±0.29
3.13±0.46
24
0.51±0.09
5.26±0.15
3.73±0.27
3.55±0.33
Stomach
4
1.17±0.12
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3.94±0.25
24
0.33±0.11
8.32±1.75
1.98±0.33
6.83±1.12
Intestine
4
1.13±0.22
4.08±0.83
24
0.22±0.09
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12.4±2.35
0.92±0.17
13.9±2.18
Kidney
4
48.3±1.98
0.09±0.01
24
39.1±2.52
0.07±0.01
9.24±1.71
1.35±0.19
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图3 注射99mTc-C50(全抗)后不同时间荷瘤裸鼠显像(正前位)
Figure 3 Gamma imaging of nude mice bearing CL-187 colorectal
cancer in right axilla after injection 99m Tc-C50(Intact,AV)
片段的血清除快，因而肿瘤的ID%的绝对值有所下降，用药后24h为2.73，约为全抗的1/5。然而与C50全抗相比，采用99mTc-Fab’的T/NT比值提高了近3倍，用药后4 h就能获得较高的T/NT比值，瘤/血、瘤/肝和瘤/肺(放射性摄取)比值分别为1.93、2.35和3.13，因而对肿瘤的诊断非常有利。但99mTc标记片段的最大缺陷是瘤/肾比值太低，肾脏中较强的放射性将影响腹腔肿瘤的诊断，目前已有不少学者在研究如何降低肾脏中的放射性，减少肾内放射性聚集对肿瘤诊断的影响。
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综上所述，采用直接法制备，方法相对简便，所得产品体内外稳定性较好，标记物能较好地定位于肿瘤细胞中。与99mTc标记全抗比较，99mTc标记的Fab'最佳显像时间提前，图像对比度明显提高。
参考文献
1，杨 志，林保和，张梅颖，等.99mTc直接法标记单抗3H11及其初步临床应用[J].中华核医学杂志，1996，16：85-88
2，林保和，杨 志，张梅颖，等.26例肿瘤患者放射免疫显像的初步临床应用[J].中华核医学杂志，1997，17：116
3，Garron JY，David M，Anastasia L,et al.Preparation of a pure
99mTc-F(ab’)2 radioimmunoconjugate by direct labeling methods[J].Nucl Med Biol,1994,21;649-655
4，Kinght LC,Maurer AH,Ammar IA,et al.99mTc antifibrin Fab' fragment for image thrombi:Evaluation in a canine model.Radiology,1989,173:163-169
收稿日期：1999-05-10, 百拇医药
单位：杨志 林保和 韩燕 牟阿平 张梅颖(北京大学临床肿瘤学院核医学科，北京 100036)；孔健(北京生物制品研究所)
关键词：99mTc；抗体；单克隆；癌胚抗原；同位素标记
北京医科大学学报000616 [摘 要]目的：研究克服99mTc标记抗癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)单抗体内生物半衰期长、血液廓清速度慢、晚时相放射性信号弱等缺点的方法,用直接标记法进行了99mTc标记抗CEA抗体C50片断Fab’的研究。方法:经胃蛋白酶切得的C50片断F(ab’)2用适量的2-巯基乙醇还原，Sephadex G50柱分离获得纯度大于90%的Fab’片断。取0.6～1.0 mg纯化的片段Fab’(体积<1.0 ml),加入0.4～0.8 mg葡庚糖酸钠及新鲜配制的SnCl2溶液5～10μg,然后加入新鲜淋洗的Na99mTcO4淋洗液,反应10～15min。用高压液相色谱监测放化纯度和抗体纯度。荷CL-187(结肠癌)裸鼠静脉注射99mTc-Fab’，观察标记抗体片段在不同时相的体内分布。结果：标记率大于90%。荷瘤裸鼠体内分布结果显示：在注射99mTc-Fab’ 4 h后瘤/血、瘤/肝、瘤/肺放射性摄取比分别为1.93、2.35和3.13，24 h后则分别为4.91、2.62和5.26，肿瘤的ID(%)/g(每克组织的摄取率)为2.73。虽然注射99mTc标记的全抗C50后24 h，肿瘤的ID(%)/g高达12.5，但瘤/血比值仅为1.51。结论：采用99mTc直接法标记Fab’是成功的，肿瘤与非肿瘤(T/NT)的比值除肾外在早期4 h时均大于2.0，明显高于全抗的T/NT比值，有利于在注射后短时间内获得清晰的图像，因而99mTc-C50 Fab’是很有希望的放射免疫显像药物。
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[中图分类号]R730.4 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0536-04
Studies of 99mTc labeled carcinoembyronic antigen monoclonal antibody C50 fragment Fab’ and biodistrobution
YANG Zhi,LIN Bao-He,HAN Yan,MU A-Ping,ZHANG Mei-Ying
(Department of Nuclear Medicine,Peking University School of Oncology，Beijing 100036，China)
KONG Jian
, 百拇医药
(National Vaccine and Serum Institute)
ABSTRACT Objective:To study 99mTc labeled anti-CEA antibody C50 fragment Fab’ and its biodistribution.Methods:F(ab)’2 of C50 was reduced by 2-mercapthonal and purified by Sephadex G50 column.Fab’ was obtained with a purity of over 90%.0.6-1.0 mg Fab’(<1.0 ml) was mixed with 0.4-0.8 mg glucoheptonate,followed by adding 5-10 μl freshly prepared SnCl2 solution (1.0mg SnCl2 in 0.01mol.L-1 HCl).Then about 1.0ml of freshly eluted Na 99mTcO4 was added to the mixture mentioned above and the mixture was slightly shaken.The solution was incubated at room temperature for 15 min.The labeling efficiency was determined by HPLC or ITLC-SG method.Nude mice bearing CL-187 tumor xenografts were injected with 99mTc-Fab’ via vein tail and the ID(%)/g (% injected doses /g) of organs were obtained at various time points of postinjection.Results:The labeling efficiency of 99mTc-Fab’ was more than 90%.The ratios of tumor to blood,liver and lung were 1.93,2.35 and 3.13 4 hours after injection.In addition,these ratios reached up to 4.91,2.62,and 5.26,24 hours after injection respectively.4 hours and 24 hours after injection of 99mTc-Fab’,the ID(%)/g of tumor was 4.53 and 2.73 respectively.Although at the 24 th hour,the ID(%)/g of tumor of 99mTc-C50(intact) reached up to 12.5,the ratio of tumor/blood was only about 1.5.Conclusion:99mTc labeled Fab' was successfully prepared by direct labeling technique,and the T/NT ratios were more than 2.0 except that with the kidney which was significantly higher than that of 99mTc-labeled C50 (intact).These are favorable to get clear images at earlier time after injection of 99mTc-Fab'.These indicate that 99mTc-C50 Fab' seems to be a good radiopharmaceutical for RII.
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KEY WORDS 99mTc;Antibodies,monoclonal;Carcinoembryonic antigen;Isotop labeling
由于99mTc在核医学诊断上具有优良的核物理性能,近年来广泛用于标记各种单克隆抗体进行放射免疫显像研究。全抗的生物半衰期一般都较长，与99mTc的物理半衰期不相匹配，而影响了使用。抗癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)抗体C50亚类为IgG1，直接进行99mTc的标记在用药后短时间内很难获得高清晰度的图像(血液清除缓慢，T/NT比值较低)，需进行双时相采集，而延长检查时间，延迟相(20～24 h)采集时放射性信号较弱，需采集较长时间才能累积足够的信号。于是我们在成功地用99mTc标记抗胃癌单抗3H11的基础上[1，2]，又进行了99mTc标记抗CEA抗体C50片段的研究。
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1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
2-巯基乙醇(2-mercapthonal,2-ME)，氯化亚锡和葡庚糖酸钠(glucohetonate,GH)均为AR级，Sigma公司产品；C50抗体由北京市生物制品研究所提供，Sephadex G50进口分装，SPECT由Sopha公司提供，Waters 510 HPLC为Waters公司产品，紫外分光光度计由发玛西亚公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 抗体片段Fab’的制备及其标记
抗体C50在适量的胃蛋白酶和反应介质作用一段时间后,进行纯化分离和浓缩,而获得抗体片段F(ab’)2。抗体片段F(ab’)2经2-ME还原获得片段Fab’,方法与文献[1]介绍的相似。反应一定时间后用Sephadex G50柱分离,用电泳法检测还原后抗体的相对分子质量。将纯化后的抗体片段Fab’分装,保存于-70℃的低温冰箱中,备用。
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取纯化的抗体片段Fab’ 0.6～1.0 mg(体积<1.0 ml),加入0.4～0.8 mg GH及新鲜配制的SnCl2溶液5～10 μg,再加新鲜淋洗的Na99mTcO4淋洗液,反应10～15 min，最终反应的pH为7.2。
全抗C50的还原和标记方法同前。
1.2.2 标记率及稳定性的测定
柱层析：采用Sephadex G50柱(100 mm×8 mm)，用0.01 mmol*L-1 pH7.2的PBS淋洗，上柱体积0.2 ml，收集各淋洗液于0.5 ml的试管中，共20管，分别测定各管中的放射性活度和280 nm处的紫外吸收。
将快速薄层层析-硅胶纸(ITLC-SG)裁成10 cm×1.0 cm的小条，于110℃的烘箱中烘烤30 min，置于干燥器中密封保存待用。将标记溶液1～2 μl 点于活化的ITLC-SG距底端1 cm处，2 min后分别置于两种体系中行上行展开。第一种为在生理盐水体系中，游离99mTc迁移到前沿，标记抗体留在原点；第2种为水、乙醇、氨水体积比为5∶2∶1体系,在此体系中,先将点样纸条点上7.5×10-4 mol*L-1的人血清白蛋白后再点样。胶体留在原点，其余组分展开到前沿。当展开到10 cm左右，吹干，剪成10条，用定标器测定放射性计数，计算标记率。
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采用Waters 510高压液相色谱仪(high-pressure liquid chromatography,HPLC)和蛋白分析柱及紫外和放射性双重检测装置进行标记抗体分析。淋洗剂为pH 7.2的0.01 mmol*L-1的PBS，淋洗速度为1.0 ml*min-1，淋洗时间为20 min，所得信号用计算机处理。
观察99mTc-Fab’在7.5×10-4 mol*L-1的人血清白蛋白和生理盐水及0.05 mol*L-1的二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)中的稳定性，用ELISA法测定标记抗体活性。
1.2.3 荷瘤裸鼠模型的建立及其生物分布 取6～7周龄的裸鼠，每只右腋下接种CL-187结肠癌细胞2×106，饲养于SPF级动物房。待肿瘤生长至100 mg左右(约2周,直径约0.6 cm)，各组动物(每组5只)经尾静脉注射标记物99mTc-Fab’或99mTc-C50 0.1 ml(7.4 MBq),于γ照相机下经不同时间观察放射性分布及肿瘤显像情况.用药后4 h和24 h分别处死、解剖，测定组织重量及放射性计数，计算ID(%)/g。
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2 结果
采用胃蛋白酶法切割C50，F(ab’)2的产率约为30%,用电泳法检测,纯度(质量分数)大于95%.用2-ME将F(ab’)2还原,纯化分离后得到Fab’,纯度约为90%.电泳谱带显示:全抗C50的相对分子质量为16万,F(ab’)2的相对分子质量为11万,Fab’的相对分子质量为5万～6万之间HPLC的紫外吸收峰显示：Fab’组分中含有10%(质量分数)左右的F(ab’)2。
99mTc标记C50全抗和Fab’的标记率>90%。标记后的抗体用ELISA法测定免疫活性均>80%。经除菌滤膜过滤后，标记抗体细菌和热源均符合静脉注射要求。
图1(A、B、C)为C50全抗、F(ab’)2及Fab’的紫外吸收峰，其峰时间分别为7.05、7.96和9.28 min。同时图1B和图1C均有另一小峰，前者为小碎片，后者为未还原彻底的F(ab’)2。各放射性峰出现的时间与此一致，因此可以证明99mTc标记在抗体分子上。
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3种分析方法——ITLC-SG、柱层析和HPLC测定标记率的结果基本一致，无明显差别。
图1 全抗C50及其片段F(ab’)2和Fab’的紫外吸收曲线
Figure 1 UV absorbed curve of C50 (intact),fragment of F(ab’)2 and Fab’
体外稳定性结果见表1。在3种介质中37℃放置6 h后结合在抗体分子Fab’上的99mTc>95%,在24 h仍>90%,表明在体外较为稳定,这与文献报道一致[3，4]。
表1 99mTc-Fab’的体外稳定性(%,
±s), http://www.100md.com
Table 1 Stability of 99m Tc-Fab' in vitro (%,
±s) t/hSaline
DTPA
(50 mmol*L-1)
HSA
(7.5×10-4 mol*L-1)
0～1
99.3±0.5
98.5±0.7
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99.2±0.6
3
96.8±2.6
98.3±1.2
97.9±1.3
6
95.2±1.8
96.1±1.5
96.8±1.1
24
93.5±2.3
94.5±1.7
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95.8±2.6
n=5.
表2的动物体内分布结果显示：注射99mTc-Fab’ 4 h后其瘤/血、瘤/肝、瘤/肺的(放射性摄取)比值分别为1.93、2.35和3.13;其24 h后则分别为4.91、2.62和5.26,除肾外,24 h时T/NT比值均>2.0;肿瘤的ID(%)/g为2.73。注射99mTc标记的C50全抗24 h后，肿瘤的ID(%)/g高达12.5,但瘤/血比值仅为1.51。
99mTc-Fab’的荷瘤裸鼠显像结果表明(图2)用药后4.5 h，肿瘤已清晰可辨；到22 h时肿瘤显像已非常清晰，但肾影也非常明显。未见胃肠道和甲状腺明显的放射性浓聚，表明99mTc-Fab’体内稳定性佳。而99mTc-C50(全抗)的荷瘤裸鼠显像(图3)在4 h时肿瘤非常模糊,到21 h时显像就清晰了。
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图2 注射99mTc-Fab’后不同时间荷瘤裸鼠显像(正前位)
Figure 2 Gamma imaging of nude mice bearing CL187 colorectal
cancer in right axilla after injection 99m Tc-Fab’(AV)
3 讨论
99mTc标记抗肿瘤单抗放免显像对已知病灶的鉴别诊断，寻找原发灶以及鉴别手术疤痕与肿瘤复发具有重要意义[2]。但完整抗体分子体内生物半衰期较长，血液清除较慢，要获得较高的靶与非靶比值需要较长时间。99mTc直接标记全抗显像，一般于给药后24 h左右，方能获得满意的结果，然而99mTc的物理半衰期仅为6 h，因此晚期显像时，放射性信号较低，需要长时间采集才能获得较满意的图像。99mTc标记的抗体片段则能较好地解决这一问题。本研究表明：99mTc标记的Fab’可在注射后3～5 h显像,最晚不超过8 h,大大缩短了诊断时间和图像采集时间,减少了显像工作量及占机时间,而用于病人进行该项检查的费用也会相对降低。同时由于提高了显像质量，因此用99mTc-Fab'进行RII能比全抗进行RII检测微小残存病灶更灵敏。
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表2 99mTc-Fab′和99mTc-C50(全抗)在裸鼠体内分布
Table 2 Biodisbution of 99m Tc-Fab’ and 99m Tc-C50(intact) in nude mice Organ
t/h
99mTc-Fab’
99mTc-C50(intact,24 h)
ID(%)/g
T/NT
ID(%)/g
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T/NT
Tumor
4
453±0.71
24
2.73±0.52
12.5±1.77
Liver
4
1.99±0.32
2.35±0.38
24
1.10±0.17
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2.62±0.53
6.79±0.52
2.15±0.32
Blood
4
2.38±0.13
1.93±0.29
24
0.55±0.13
4.91±0.65
8.29±0.35
1.51±0.17
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Lung
4
1.50±0.29
3.13±0.46
24
0.51±0.09
5.26±0.15
3.73±0.27
3.55±0.33
Stomach
4
1.17±0.12
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3.94±0.25
24
0.33±0.11
8.32±1.75
1.98±0.33
6.83±1.12
Intestine
4
1.13±0.22
4.08±0.83
24
0.22±0.09
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12.4±2.35
0.92±0.17
13.9±2.18
Kidney
4
48.3±1.98
0.09±0.01
24
39.1±2.52
0.07±0.01
9.24±1.71
1.35±0.19
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图3 注射99mTc-C50(全抗)后不同时间荷瘤裸鼠显像(正前位)
Figure 3 Gamma imaging of nude mice bearing CL-187 colorectal
cancer in right axilla after injection 99m Tc-C50(Intact,AV)
片段的血清除快，因而肿瘤的ID%的绝对值有所下降，用药后24h为2.73，约为全抗的1/5。然而与C50全抗相比，采用99mTc-Fab’的T/NT比值提高了近3倍，用药后4 h就能获得较高的T/NT比值，瘤/血、瘤/肝和瘤/肺(放射性摄取)比值分别为1.93、2.35和3.13，因而对肿瘤的诊断非常有利。但99mTc标记片段的最大缺陷是瘤/肾比值太低，肾脏中较强的放射性将影响腹腔肿瘤的诊断，目前已有不少学者在研究如何降低肾脏中的放射性，减少肾内放射性聚集对肿瘤诊断的影响。
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综上所述，采用直接法制备，方法相对简便，所得产品体内外稳定性较好，标记物能较好地定位于肿瘤细胞中。与99mTc标记全抗比较，99mTc标记的Fab'最佳显像时间提前，图像对比度明显提高。
参考文献
1，杨 志，林保和，张梅颖，等.99mTc直接法标记单抗3H11及其初步临床应用[J].中华核医学杂志，1996，16：85-88
2，林保和，杨 志，张梅颖，等.26例肿瘤患者放射免疫显像的初步临床应用[J].中华核医学杂志，1997，17：116
3，Garron JY，David M，Anastasia L,et al.Preparation of a pure
99mTc-F(ab’)2 radioimmunoconjugate by direct labeling methods[J].Nucl Med Biol,1994,21;649-655
4，Kinght LC,Maurer AH,Ammar IA,et al.99mTc antifibrin Fab' fragment for image thrombi:Evaluation in a canine model.Radiology,1989,173:163-169
收稿日期：1999-05-10, 百拇医药