HL-60细胞降钙素基因高甲基化的发生机制
作者：赵明明 白志勇 白晓川 徐国宾 武淑兰
单位：赵明明 白志勇 武淑兰(北京医科大学第一医院血液内科,北京 100034)；白晓川(宁夏医学院附属医院)；徐国宾(北京医科大学第一医院检验科,北京 100034)
关键词：HL-60细胞；降钙素；甲基化；DNA -胞嘧啶-甲基转移酶；代谢
北京医科大学学报000614 [摘 要]目的：探讨HL-60细胞降钙素基因高甲基化的发生机制。方法：采用HL-60细胞，以正常骨髓单个核细胞为对照，应用甲基化敏感的限制性内切酶消化，结合设有内外参照的PCR 技术，检测CT 基因甲基化状态；应用同位素微量分析法检测DNA-胞嘧啶-甲基转移酶(DNA-cytosin-methyltransferase,MTase)活性；应用RT-PCR技术检测MTase 基因表达水平。结果：HL-60细胞经甲基化敏感的内切酶HpaⅡ消化后仍可扩增出清晰的CT基因特异条带，提示CT基因5′端呈高甲基化状态； HL-60细胞MTase 活性平均测定值为539.9 Bq，是正常骨髓单个核细胞(平均21.8 Bq)的29.8 倍；MTase基因的mRNA表达水平以MTase与β-actin内参照RT-PCR产物的比值表示，HL-60细胞(0.72)为正常对照(0.02)的36倍。结论：HL-60细胞CT基因呈高甲基化状态，MTase活性增高可能是其发生机制之一。
, http://www.100md.com
中图分类号]Q505 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0530-03
Study on the mechanism of the hypermethylation of the calcitonin gene in HL-60 cells
ZHAO Ming-Ming,BAI Zhi-Yong,BAI Xiao-Chuan,WU Shu-Lan
(Department of Hematology)
XU Guo-Bin
(Department of Laboratory Medical Science,the First Hospital，Beijing Medical University,Beijing 100034,China)
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective:To explore the mechanism of hypermethylation pattern of the calcitonin (CT) gene in the HL-60 cells.Methods:Methylation pattern of CT gene in the HL60 cells was detected by PCR technique combined with methylation sensitive restriction endonuclease digestion.DNA-Cytosine-Methyltransferase (MTase) activity and mRNA expression of MTase gene were detected by isotope-labeled microassay and RT-PCR,respectively.Results:A specific band of CT gene was obtained after HpaⅡ digestion,which suggested hypermethylation in 5′ region of CT gene in HL-60 cells.The MTase activity in the HL-60(mean 539.9 Bq) was 28.8 fold higher than that of the control (mean 21.8 Bq).The level of MTase gene expression was evaluated by the ratio of density between MTase band and β-actin band.The ratio of the HL-60 cells (0.72) was 36-fold higher than that of the control (0.02).Conclusion:Increased MTase activity might be one of possible mechanisms of CT gene hypermethylation in the HL-60 cells.
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KEY WORDS HL-60 cells;Calcitonin;Methylation;DNA-(cytosine-5-) methyltransferase/metab
甲基化异常被认为是肿瘤的一个特征[1]。与细胞的恶性转化、肿瘤的发生、浸润及转移相关的基因局部甲基化模式的改变已成为令人瞩目的研究领域，其中包括对降钙素(calcitonin,CT)基因甲基化模式的研究。 CT基因位于染色体11p15，是肿瘤时发生DNA 高甲基化的热点区域。在白血病等血液系统恶性肿瘤时CT基因常呈高甲基化状态，提示CT 基因高甲基化与血液细胞恶性转化密切相关[2，3]。研究其发生机制对白血病防治有重要意义。 本文通过检测白血病细胞系HL-60细胞的CT 基因甲基化状态、DNA-胞嘧啶-甲基转移酶(DNA-cytosine-methyltransferase,MTase)活性及MTase 基因表达水平，以探讨HL-60 细胞CT基因高甲基化的发生机制。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
HL-60细胞按常规方法于含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液，37 ℃，5%(体积分数)CO2条件下培养。
1.2 对照细胞
取本院心外科非肿瘤患者手术切除的肋骨骨髓，经淋巴细胞分离液分离后吸取单个核细胞。
1.3 PCR检测CT基因甲基化模式
DNA制备,甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ及其同裂酶MspⅠ消化,PCR引物及反应条件均按本室报告的方法[3]。
1.4 同位素微量分析法检测MTase活性
, 百拇医药
按本室报告的方法[4]，采用24 μl 反应体系，蛋白定量为5 μg的细胞裂解物1.11×105 Bq 3H-SAM,0.5 μg Poly[d(I-C)d(I-C)]，pH 7.8，37 ℃,2 h，液闪液中测定1 min放射性活度(Bq)为标准测定条件。
1.5 RT-PCR检测MTase的mRNA表达
RNA制备：采用Trizol Reagent,按Promega公司说明制备总RNA标本。
MTase引物：有义链引物设计在该酶cDNA序列的第3 631～3 647位核苷酸，序列为5′-GATAGAGATCAAGCTGCC-3′；反义链引物为第4 112～4 129位核苷酸的互补序列，5′-GCCGAAGGTGCACTGATA-3′。经RT-PCR扩增的特异性条带为498 bp片段[5]。
, 百拇医药
β-actin引物：有义链引物为β-actin cDNA序列第407～426位核苷酸，5′-CATGTT TGAGACCTTCAACA-3′；反义链引物为β-actin cDNA序列第703～720位核苷酸的互补序列，5′-TCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。经RT-PCR扩增的特异性条带为314bp片段。
逆转录反应：20 μl总体系中包括总RNA 2 μg，反义逆转录引物25 pmol,dNTP各250 μmol.L-1，逆转录酶AMV 10 u，42 ℃反应1 h。
PCR反应：25 μl反应体系中含1 μl逆转录反应终液为模板cDNA，MTase引物各25 pmol，β-actin引物各3.125 pmol，dNTP各50 μmol.L-1，MgCl2 1.5 mmol.L-1，Taq聚合酶0.6 u，94 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，末次延伸72 ℃ 10 min。每次实验均设不加逆转录产物模板的阴性对照。
, 百拇医药
产物鉴定：取RT-PCR终产物6 μl,100 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,银染显色,激光扫描，经积分得出每一条带的相对强度，以MTase条带扫描值/β-actin条带扫描值表示。
2 结果
2.1 HL-60细胞CT基因呈高甲基化状态(图1)
正常骨髓单个核细胞未经酶切的DNA标本经PCR扩增后，可产生固有的566 bp CT基因的特异条带，该产物含CT基因M4位点(即CT基因5′端第13个MspⅠ识别位点)附近的序列，因此，标本经MspⅠ或其同裂酶HpaⅡ消化后CT基因的特异条带消失(图1A)。与正常骨髓单个核细胞对照相同，HL-60细胞未经酶切的DNA标本也可以扩增出566 bp CT基因的特异条带；MspⅠ消化的标本CT基因的特异条带消失,而甲基化敏感的同裂酶HpaⅡ不能识别发生高甲基化的M4位点，因此HL-60细胞DNA 经HpaⅡ消化后，仍扩增出清晰的566 bp CT基因的特异条带(图1B)。检测经3次重复结果一致，提示 HL-60细胞CT基因5′端M4位点呈高甲基化状态。
, 百拇医药
2.2 HL-60细胞MTase活性增强
MTase活性双管重复测定，以放射性活度(Bq)表示，空白对照为4.3和3.3,平均值为3.8;正常骨髓单个核细胞为21.5和22.0，平均值为21.8;HL-60细胞为529.1和550.6,平均值为539.9,分别减去空白对照后HL-60细胞是正常对照的29.8倍(536.1/18.0)，提示HL-60细胞MTase活性增高。
2.3 HL-60细胞MTase基因RNA表达增高
RT-PCR产物经激光密度仪扫描，以MTase和β-actin条带扫描值的比值分析MTase基因的RNA表达水平，正常骨髓单个核细胞比值为0.02，HL-60细胞为0.72，是正常对照的36倍(图2)。检测经3次重复结果一致。
3 讨论
, 百拇医药
众多研究发现，局部基因高甲基化在各种肿瘤中普遍存在，特别是某些与恶性转化、肿瘤发生、浸润和转移相关的基因，如p16基因、E-cad基因等，它们的5′端CpG岛在肿瘤时常呈高甲基化状态。局部DNA高甲基化可直接关闭正常表达的基因，并可能与肿瘤关系密切[1]，因此，研究局部DNA高甲基化的发生机制对探讨血液肿瘤的发病机制及寻求肿瘤防治的新途径有重要意义。
图1 经PCR扩增的CT基因产物
Figure 1 Products of CT gene by PCR amplification
图2 RT-PCR检测MTase基因的RNA表达
, 百拇医药
Figure 2 RNA expression of MTase gene by RT-PCR
CT基因的高甲基化在血液系统恶性肿瘤中是高发现象，这种现象被认为可能是血液细胞恶性转化的标志之一[2，3]。真核生物的甲基化是由MTase 催化完成的,因此，本文采用人类白血病细胞系HL-60 细胞为研究对象，应用限制性内切酶结合设有内外参照的PCR 技术发现HL-60细胞的CT基因呈高甲基化状态。经同位素微量法检测发现其MTase活性高达正常对照的29.8倍，提示HL-60细胞CT 基因的高甲基化与MTase 活性增高有关。进而采用 RT-PCR 技术检测发现MTase 基因表达高至正常对照的36倍，提示 HL-60细胞的MTase异常在mRNA水平即已存在，据此推测MTase活性增高是HL-60细胞CT基因局部高甲基化的发生机制之一。
90年代以来肿瘤细胞MTase的异常逐渐引起研究者的重视，已发现在肺癌细胞系及SV40转化的肺成纤维细胞系中MTase基因转录增高[6]；在大肠癌组织中MTase基因转录增高，且酶活性增高[7]；MTase 基因转染的小鼠成纤维细胞系出现恶变[8]。这些研究结果高度提示MTase异常对肿瘤的发生、发展至关重要。
, http://www.100md.com
综上所述，在血液系统恶性肿瘤性疾病防治中，局部DNA 甲基化异常及MTase 的异常是值得重视的问题；干扰甲基化，开辟白血病防治新途径是值得探索的新课题。
基金项目：卫生部科研基金(94-1-250)资助课题；
参考文献
1，Wachsman JT.DNA methylation and the association between genetic and epigenetic change:relation to carcinogenesis[J].Mutat Res,1997,375:1-8
2，Ihalainen J,Pakkala S,Savolainen E,et al.Hypermethylation of the calcitonin gene in Myelodysplastic syndrome[J].Leukemia,1993,7(2):263-267
, 百拇医药
3，Wu SL,Xie GL,Bai RK,et al.Semi-quantitative study of calcitonin gene methylation in myelodysplastic syndrome[J].Chin Med J,1998,111(8):690-693
4，白志勇，徐国宾,武淑兰.同位素示踪微量法测定白血病细胞DNA-甲基转移酶活性[J].北京医科大学学报，2000，32:76-78
5，Yen RC,Vertino PM,Nelkin BD,et al.Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase[J].Nucl Acids Res,1992,20(9):2287-2291
6，El-deiry WS,Nelkin SD,Celano P,et al.High expression of the DNA methyltransferase gene characterizes human neoplastic cells and progression stages of colon cancer[J].Proc Nalt Acad Sci USA,1991,88:3470-3474
, http://www.100md.com
7，Issa J,Vertino PM,Wu JJ,et al.Increased Cytosine DNA-methyltransferase activity during colon cancer progression[J].J Natl Cancer Inst.1993,85(15):1235-1240
8，Wu JJ,Issa J,Herman J,et al.Expression of an exogenous eukaryotic DNA methyltransferase gene induces transformation of NIH 3T3 cells[J].Proc Nalt Acad Sci USA,1993,90:8891-8895
收稿日期：1999-04-24, http://www.100md.com
单位：赵明明 白志勇 武淑兰(北京医科大学第一医院血液内科,北京 100034)；白晓川(宁夏医学院附属医院)；徐国宾(北京医科大学第一医院检验科,北京 100034)
关键词：HL-60细胞；降钙素；甲基化；DNA -胞嘧啶-甲基转移酶；代谢
北京医科大学学报000614 [摘 要]目的：探讨HL-60细胞降钙素基因高甲基化的发生机制。方法：采用HL-60细胞，以正常骨髓单个核细胞为对照，应用甲基化敏感的限制性内切酶消化，结合设有内外参照的PCR 技术，检测CT 基因甲基化状态；应用同位素微量分析法检测DNA-胞嘧啶-甲基转移酶(DNA-cytosin-methyltransferase,MTase)活性；应用RT-PCR技术检测MTase 基因表达水平。结果：HL-60细胞经甲基化敏感的内切酶HpaⅡ消化后仍可扩增出清晰的CT基因特异条带，提示CT基因5′端呈高甲基化状态； HL-60细胞MTase 活性平均测定值为539.9 Bq，是正常骨髓单个核细胞(平均21.8 Bq)的29.8 倍；MTase基因的mRNA表达水平以MTase与β-actin内参照RT-PCR产物的比值表示，HL-60细胞(0.72)为正常对照(0.02)的36倍。结论：HL-60细胞CT基因呈高甲基化状态，MTase活性增高可能是其发生机制之一。
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中图分类号]Q505 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0530-03
Study on the mechanism of the hypermethylation of the calcitonin gene in HL-60 cells
ZHAO Ming-Ming,BAI Zhi-Yong,BAI Xiao-Chuan,WU Shu-Lan
(Department of Hematology)
XU Guo-Bin
(Department of Laboratory Medical Science,the First Hospital，Beijing Medical University,Beijing 100034,China)
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ABSTRACT Objective:To explore the mechanism of hypermethylation pattern of the calcitonin (CT) gene in the HL-60 cells.Methods:Methylation pattern of CT gene in the HL60 cells was detected by PCR technique combined with methylation sensitive restriction endonuclease digestion.DNA-Cytosine-Methyltransferase (MTase) activity and mRNA expression of MTase gene were detected by isotope-labeled microassay and RT-PCR,respectively.Results:A specific band of CT gene was obtained after HpaⅡ digestion,which suggested hypermethylation in 5′ region of CT gene in HL-60 cells.The MTase activity in the HL-60(mean 539.9 Bq) was 28.8 fold higher than that of the control (mean 21.8 Bq).The level of MTase gene expression was evaluated by the ratio of density between MTase band and β-actin band.The ratio of the HL-60 cells (0.72) was 36-fold higher than that of the control (0.02).Conclusion:Increased MTase activity might be one of possible mechanisms of CT gene hypermethylation in the HL-60 cells.
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KEY WORDS HL-60 cells;Calcitonin;Methylation;DNA-(cytosine-5-) methyltransferase/metab
甲基化异常被认为是肿瘤的一个特征[1]。与细胞的恶性转化、肿瘤的发生、浸润及转移相关的基因局部甲基化模式的改变已成为令人瞩目的研究领域，其中包括对降钙素(calcitonin,CT)基因甲基化模式的研究。 CT基因位于染色体11p15，是肿瘤时发生DNA 高甲基化的热点区域。在白血病等血液系统恶性肿瘤时CT基因常呈高甲基化状态，提示CT 基因高甲基化与血液细胞恶性转化密切相关[2，3]。研究其发生机制对白血病防治有重要意义。 本文通过检测白血病细胞系HL-60细胞的CT 基因甲基化状态、DNA-胞嘧啶-甲基转移酶(DNA-cytosine-methyltransferase,MTase)活性及MTase 基因表达水平，以探讨HL-60 细胞CT基因高甲基化的发生机制。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养
HL-60细胞按常规方法于含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液，37 ℃，5%(体积分数)CO2条件下培养。
1.2 对照细胞
取本院心外科非肿瘤患者手术切除的肋骨骨髓，经淋巴细胞分离液分离后吸取单个核细胞。
1.3 PCR检测CT基因甲基化模式
DNA制备,甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ及其同裂酶MspⅠ消化,PCR引物及反应条件均按本室报告的方法[3]。
1.4 同位素微量分析法检测MTase活性
, 百拇医药
按本室报告的方法[4]，采用24 μl 反应体系，蛋白定量为5 μg的细胞裂解物1.11×105 Bq 3H-SAM,0.5 μg Poly[d(I-C)d(I-C)]，pH 7.8，37 ℃,2 h，液闪液中测定1 min放射性活度(Bq)为标准测定条件。
1.5 RT-PCR检测MTase的mRNA表达
RNA制备：采用Trizol Reagent,按Promega公司说明制备总RNA标本。
MTase引物：有义链引物设计在该酶cDNA序列的第3 631～3 647位核苷酸，序列为5′-GATAGAGATCAAGCTGCC-3′；反义链引物为第4 112～4 129位核苷酸的互补序列，5′-GCCGAAGGTGCACTGATA-3′。经RT-PCR扩增的特异性条带为498 bp片段[5]。
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β-actin引物：有义链引物为β-actin cDNA序列第407～426位核苷酸，5′-CATGTT TGAGACCTTCAACA-3′；反义链引物为β-actin cDNA序列第703～720位核苷酸的互补序列，5′-TCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。经RT-PCR扩增的特异性条带为314bp片段。
逆转录反应：20 μl总体系中包括总RNA 2 μg，反义逆转录引物25 pmol,dNTP各250 μmol.L-1，逆转录酶AMV 10 u，42 ℃反应1 h。
PCR反应：25 μl反应体系中含1 μl逆转录反应终液为模板cDNA，MTase引物各25 pmol，β-actin引物各3.125 pmol，dNTP各50 μmol.L-1，MgCl2 1.5 mmol.L-1，Taq聚合酶0.6 u，94 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，末次延伸72 ℃ 10 min。每次实验均设不加逆转录产物模板的阴性对照。
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产物鉴定：取RT-PCR终产物6 μl,100 g.L-1聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,银染显色,激光扫描，经积分得出每一条带的相对强度，以MTase条带扫描值/β-actin条带扫描值表示。
2 结果
2.1 HL-60细胞CT基因呈高甲基化状态(图1)
正常骨髓单个核细胞未经酶切的DNA标本经PCR扩增后，可产生固有的566 bp CT基因的特异条带，该产物含CT基因M4位点(即CT基因5′端第13个MspⅠ识别位点)附近的序列，因此，标本经MspⅠ或其同裂酶HpaⅡ消化后CT基因的特异条带消失(图1A)。与正常骨髓单个核细胞对照相同，HL-60细胞未经酶切的DNA标本也可以扩增出566 bp CT基因的特异条带；MspⅠ消化的标本CT基因的特异条带消失,而甲基化敏感的同裂酶HpaⅡ不能识别发生高甲基化的M4位点，因此HL-60细胞DNA 经HpaⅡ消化后，仍扩增出清晰的566 bp CT基因的特异条带(图1B)。检测经3次重复结果一致，提示 HL-60细胞CT基因5′端M4位点呈高甲基化状态。
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2.2 HL-60细胞MTase活性增强
MTase活性双管重复测定，以放射性活度(Bq)表示，空白对照为4.3和3.3,平均值为3.8;正常骨髓单个核细胞为21.5和22.0，平均值为21.8;HL-60细胞为529.1和550.6,平均值为539.9,分别减去空白对照后HL-60细胞是正常对照的29.8倍(536.1/18.0)，提示HL-60细胞MTase活性增高。
2.3 HL-60细胞MTase基因RNA表达增高
RT-PCR产物经激光密度仪扫描，以MTase和β-actin条带扫描值的比值分析MTase基因的RNA表达水平，正常骨髓单个核细胞比值为0.02，HL-60细胞为0.72，是正常对照的36倍(图2)。检测经3次重复结果一致。
3 讨论
, 百拇医药
众多研究发现，局部基因高甲基化在各种肿瘤中普遍存在，特别是某些与恶性转化、肿瘤发生、浸润和转移相关的基因，如p16基因、E-cad基因等，它们的5′端CpG岛在肿瘤时常呈高甲基化状态。局部DNA高甲基化可直接关闭正常表达的基因，并可能与肿瘤关系密切[1]，因此，研究局部DNA高甲基化的发生机制对探讨血液肿瘤的发病机制及寻求肿瘤防治的新途径有重要意义。
图1 经PCR扩增的CT基因产物
Figure 1 Products of CT gene by PCR amplification
图2 RT-PCR检测MTase基因的RNA表达
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Figure 2 RNA expression of MTase gene by RT-PCR
CT基因的高甲基化在血液系统恶性肿瘤中是高发现象，这种现象被认为可能是血液细胞恶性转化的标志之一[2，3]。真核生物的甲基化是由MTase 催化完成的,因此，本文采用人类白血病细胞系HL-60 细胞为研究对象，应用限制性内切酶结合设有内外参照的PCR 技术发现HL-60细胞的CT基因呈高甲基化状态。经同位素微量法检测发现其MTase活性高达正常对照的29.8倍，提示HL-60细胞CT 基因的高甲基化与MTase 活性增高有关。进而采用 RT-PCR 技术检测发现MTase 基因表达高至正常对照的36倍，提示 HL-60细胞的MTase异常在mRNA水平即已存在，据此推测MTase活性增高是HL-60细胞CT基因局部高甲基化的发生机制之一。
90年代以来肿瘤细胞MTase的异常逐渐引起研究者的重视，已发现在肺癌细胞系及SV40转化的肺成纤维细胞系中MTase基因转录增高[6]；在大肠癌组织中MTase基因转录增高，且酶活性增高[7]；MTase 基因转染的小鼠成纤维细胞系出现恶变[8]。这些研究结果高度提示MTase异常对肿瘤的发生、发展至关重要。
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综上所述，在血液系统恶性肿瘤性疾病防治中，局部DNA 甲基化异常及MTase 的异常是值得重视的问题；干扰甲基化，开辟白血病防治新途径是值得探索的新课题。
基金项目：卫生部科研基金(94-1-250)资助课题；
参考文献
1，Wachsman JT.DNA methylation and the association between genetic and epigenetic change:relation to carcinogenesis[J].Mutat Res,1997,375:1-8
2，Ihalainen J,Pakkala S,Savolainen E,et al.Hypermethylation of the calcitonin gene in Myelodysplastic syndrome[J].Leukemia,1993,7(2):263-267
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3，Wu SL,Xie GL,Bai RK,et al.Semi-quantitative study of calcitonin gene methylation in myelodysplastic syndrome[J].Chin Med J,1998,111(8):690-693
4，白志勇，徐国宾,武淑兰.同位素示踪微量法测定白血病细胞DNA-甲基转移酶活性[J].北京医科大学学报，2000，32:76-78
5，Yen RC,Vertino PM,Nelkin BD,et al.Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase[J].Nucl Acids Res,1992,20(9):2287-2291
6，El-deiry WS,Nelkin SD,Celano P,et al.High expression of the DNA methyltransferase gene characterizes human neoplastic cells and progression stages of colon cancer[J].Proc Nalt Acad Sci USA,1991,88:3470-3474
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7，Issa J,Vertino PM,Wu JJ,et al.Increased Cytosine DNA-methyltransferase activity during colon cancer progression[J].J Natl Cancer Inst.1993,85(15):1235-1240
8，Wu JJ,Issa J,Herman J,et al.Expression of an exogenous eukaryotic DNA methyltransferase gene induces transformation of NIH 3T3 cells[J].Proc Nalt Acad Sci USA,1993,90:8891-8895
收稿日期：1999-04-24, http://www.100md.com