主要组织相容性复合体在人卵巢上皮癌组织中的表达
作者：徐立新 冯捷 唐军民 钱和年 唐岩 姚煜 李枫
单位：徐立新 冯捷 钱和年 姚煜(北京大学人民医院妇科肿瘤中心，北京 100044)；唐岩 唐军民 李枫(北京大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系)
关键词：基因；MHC；Ⅰ类；代谢；卵巢肿瘤；遗传学；上皮细胞
北京医科大学学报000605 [摘 要]目的：通过观察主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。方法：ABC免疫组织化学技术和图像分析。结果：在卵巢上皮癌中，HLA-I+细胞数量与正常卵巢组织相比较明显减少(P<0.05)，并与临床分期和病理分级相关，而表达强度虽亦降低，但差异未见显著性；同时，HLA-DR+细胞数量增多，表达强度增强，且与正常卵巢组织相比较差异具有显著性(P<0.05)。结论：人卵巢上皮癌局部微环境中MHC表达的变化在机体自身抗卵巢肿瘤免疫中起重要作用，这为临床开展卵巢癌的生物治疗提供了实验室依据。
, 百拇医药
[中图分类号]R737.31 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0496-04
The expression of major histocompatibility complex in human ovarian epithelial carcinoma
XU Li-Xin,FENG Jie,QIAN He-Nian,YAO Yu
(Gynecologic Oncology Center,Peking University People's Hospital,Beijing 100044， China)
TANG Jun-Min,TANG Yan,LI Feng
, 百拇医药
(Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:To investigate the numbers and the expression of major histocompatibility complex (MHC) positive cells in human ovarian carcinoma tissues and provide the experimental data in the further biological therapy of ovarian carcinoma.Methods:ABC Immunocytochemistry and Computer imaging techniques.Results:The result showed that the number of HLA-Ⅰ+ cells as fewer in ovarian carcinoma than that of in normal ovarian tissues which were related with clinical stages and pathologic grades whereas the expressive intensity of HLA-Ⅰ had only the tendency to reduce without significant differences.On the other hand,the number of HLA-DR+ cells increased and its expression intensity was stronger in ovarian epithelial cancer than in normal ovarian tissues with significant differences (P<0.05).Conclusion:The expression changes of MHC in local micro-environment of ovarian epithelial carcinoma may play an important role in initiating auto-immunity against ovarian carcinoma.These must be very useful for the further clinical biological therapy of ovarian carcinoma.
, 百拇医药
KEY WORDS Genes,MHC class Ⅰ/metab；Ovarian neoplasms/genet;Epithelial cells
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一组编码细胞表面蛋白分子或抗原的基因组，小鼠的MHC为H-2，而在人则称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。HLA-Ⅰ类主要负责内、外源性抗原(如肿瘤抗原)的加工和呈递。HLA-Ⅱ类，即HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ等主要参与外源性抗原的加工和呈递。肿瘤细胞表面MHC的表达密度降低或缺如，可使肿瘤不呈现或仅呈现弱的抗原性，是造成肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，继续增殖并发生转移的重要原因。研究表明对于某些肿瘤来说，单独一种抗原的丢失有时并不能造成肿瘤的免疫逃避，但只要MHC分子出现某一点异常，即可使肿瘤永远逃避机体的免疫杀伤[1]。用ABC免疫组织化学技术和图像分析观察MHC在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，可了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为进一步在临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料的收集及分类
收集自1993年1月～1998年11月手术切除的31例人卵巢上皮癌、16例良性卵巢肿瘤及10例正常卵巢组织，术前均未经化疗及放疗，均有病理证明并经专家再次鉴定，以上组织分别来源于北京大学第一、人民、第三医院、北京军区总院、北京妇产医院、中国医学科学院肿瘤医院。
31例卵巢上皮癌的患者年龄为25～74岁，临床分期：Ⅰ期4 例、Ⅱ期6 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期1 例。病理分级：高分化(G1)4例、 中等分化(G2)9例、 低分化(G3)18 例；病理类型包括浆液性腺癌、粘液性腺癌、混合性上皮癌、透明细胞癌等。
1.2 组织处理及ABC免疫组织化学技术
各组织经OCT冷冻包埋，用Leica冰冻切片机切5 μm厚冷冻切片，冷风吹干，冷丙酮固定5 min，备用。
, 百拇医药
将冰冻切片用PBS(0.01 mol*L-1 pH 7.36)洗3次(5 min/次)，用0.3%(体积分数)的H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下20 min。PBS洗后，加正常马血清封闭，室温30 min，或 37 ℃ 20 min。弃去血清，滴加适当稀释的抗体[HLA-Ⅰ(体积比1∶900)、HLA-DR(体积比1∶500)，均购于Pharmingen]，室温1 h，转入4℃冰箱过夜(18 h以上)。PBS洗3次，滴加生物素标记的马抗鼠IgG(体积比1∶330)，37 ℃ 1 h。PBS洗3次，滴加过氧化物酶标记的链酶卵白素(体积比1∶200)，37 ℃ 1 h。PBS洗2次，Tris-HCl缓冲液洗1次，DAB液显色，按不同抗体分别固定控制显色时间。终止显色后，水冲洗，Mayor苏木精或2%(体积比)甲绿复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，烤干后镜下观察，图像分析。
1.3 图像分析
, 百拇医药
所有的冰冻切片标本进行ABC法免疫组化染色后，用Leica Q 500MC进行图像分析。每个标本随机选取不重叠的10个视野，选择每张切片的空白处进行校正，并调整灰度，然后对阳性物质进行二值化处理和图像整修，由计算机系统自动计算出阳性细胞的平均灰度和阳性细胞数，根据光密度值(OD)= Lg(空白灰度/平均标本灰度)得出平均光密度(MOD)值(表示表达强度)及标准差(s)值等。
1.4 结果的统计学处理
3组间数据以
±s表示。用Sta-Win软件统计包中的单因素方差分析(ANOVA)，先对3组间均数进行比较，再用t检验(t-test)进行组间两两比较。
2 结果
2.1 HLA-Ⅰ在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图1，2)
, 百拇医药
实验结果显示，HLA-Ⅰ抗原呈棕黄色，表达在阳性细胞的细胞膜和细胞质，细胞膜较细胞质着色深(图1)。卵巢上皮癌、良性卵巢肿瘤中的HLA-Ⅰ+细胞数较正常卵巢组织明显减少(表1)，差异有极显著性(P<0.001)；另外，癌组织中HLA-Ⅰ+细胞数与临床分期和病理分级有关(表2)。HLA-Ⅰ阳性细胞表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中较正常卵巢组织相比虽有降低，但差异没有显著性(P>0.05，表3)，且与临床分期和病理分级无关。
表1 不同抗原阳性细胞在卵巢各组织中的数量(个/视野)(±s)
Table 1 The number of different antigen positive cells
in the various ovarian tissues (number/vision)(±s)
, http://www.100md.com
Normol ovarian
tissues
Benign ovarian
tumor
Ovarian epithelial
carcinoma
HLA-Ⅰ+
38.8±24.3
5.4±4.5***
7.3±5.8***
HLA-DR+
, 百拇医药
7.2±2.9
6.0±5.5
12.1±8.4**
t-test， **P<0.05，***P<0.001.
2.2 HLA-DR在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图3，4)
结果显示，HLA-DR抗原在正常卵巢组织分布于间质中，在卵巢上皮癌组织多分布于癌巢附近间质中，少数分布在癌细胞膜。呈棕黄色表达,在阳性细胞的细胞膜和细胞浆，细胞膜较细胞浆着色深。卵巢上皮癌中的HLA-DR+细胞数与良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织相比均明显增多，且差异有显著性(P<0.05,表1)。另外，在卵巢上皮癌组织中，HLA-DR+细胞数的变化与临床分期和病理分级无关；同时，HLA-DR的表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中比在正常卵巢组织中均明显增强(表3)，且差异有显著性(P<0.05)，并与临床分期和病理分级有关(表2)。
, http://www.100md.com
表2 卵巢上皮癌组织中HLA与临床分期和病理分级的关系
Table 2 The relationship between HLA and clinical stages and pathologic grade in the ovarian epithelial carcinoma tissues (±s)
Case
HLA-Ⅰ
HLA-DR
Numbers
MOD
Numbers
, 百拇医药
MOD
Ⅰ
4
8.45±6.62
0.12±0.00
12.05±3.12
0.10±0.00
Ⅱ
6
7.60±4.87
0.12±0.02
12.90±2.46
, http://www.100md.com
0.14±0.01
Ⅲ
21
6.20±2.26
0.11±0.01
9.20±6.22
0.14±0.03
G1
4
8.98±4.26
0.12±0.01
, 百拇医药
13.15±0.09
0.11±0.00
G2
9
9.97±2.61
0.12±0.01
11.49±7.51
0.15±0.01
G3
18
5.80±1.26
, 百拇医药 0.12±0.01
14.13±5.26
0.13±0.01
t-test,* P<0.05.
图1 HLA-Ⅰ+细胞在正常卵巢组织中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×400
Figure 1 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the normal ovarian tissues ABC immunohistochemical method ×400
, 百拇医药
图2 HLA-Ⅰ+ 细胞在卵巢上皮癌中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×400
Figure 2 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the ovarian epithelial carcinoma tissues ABC immunohistochemical method ×400
图3 HLA-DR+ 细胞在正常卵巢中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×200
Figure 3 The distribution of HLA-DR+ cells in the normal ovarian tissues ABC immunohistochemical method ×200
, 百拇医药
图4 HLA-DR+细胞在卵巢上皮癌中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×200
Figure 4 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the ovarian epithelial carcinoma tissues ABC immunohistochemical method ×200
表3 卵巢各组织中不同抗原表达强度的比较(±s)
Table 3 The expressive intensity of different antigen
in the various ovarian tissues(±s)
, 百拇医药
MOD
Normol ovarian
tissues(n=10)
Benign ovarian
tumor(n=16)
Ovarian epithelial
carcinoma(n=31)
HLA-Ⅰ+
0.122±0.020
0.118±0.012
0.115±0.013
, http://www.100md.com
HLA-DR+
0.114±0.019
0.139±0.025
0.141±0.028
t-test,*P<0.05.3 讨论
HLA在卵巢上皮癌的表达，本实验在卵巢上皮癌中HLA-Ⅰ的表达强度减弱，但差异没有显著性；而其阳性细胞的数量明显减少，表明HLA-Ⅰ类总表达量是下降的，由此导致肿瘤细胞免疫原性降低，不能有效地将肿瘤抗原呈递给CD8+ T细胞，因而不能有效发挥CD8+ T细胞的细胞毒作用,这与Kono[2]的观点相似。说明HLA-Ⅰ类限制性因素下降是卵巢肿瘤细胞逃避CD8+ T细胞特异性杀伤的一个重要因素，另外HLA-Ⅰ类总表达量的下降也增加了肿瘤对NK细胞杀伤的敏感性，促进了免疫逃避的发生。
, 百拇医药
卵巢上皮癌中MHC与T细胞的关系：Kooi等[3]用免疫组织化学的方法观察卵巢上皮癌中HLA-Ⅰ或HLA-Ⅱ类抗原及白细胞抗原(LCA、CD3、CD4、CD8)决定簇的情况。结果在90%(18/20)的卵巢上皮癌冰冻切片中，至少有5%的肿瘤细胞表达HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类抗原，同时还观察到，HLA-Ⅰ+ 的卵巢上皮癌细胞数量与CD3+、CD4+、CD8+细胞数量分别呈明显的相关关系；HLA-Ⅱ+的肿瘤细胞数量仅与CD8+T细胞呈正相关。本实验也发现，在卵巢肿瘤组织中，HLA-Ⅰ+ 的表达与CD3+的表达呈明显的相关关系(r=0.43)。因而，可以说明在卵巢上皮癌的微环境中，HLA的表达与T细胞相关。
另外，HLA-DR表达在抗原呈递细胞的表面。具有吞噬功能的抗原呈递细胞在激活CTL免疫应答中发挥着关键性的作用[4，5]。抗原在APC内经溶酶体作用，被水解成肽段，然后与MHC-Ⅱ类分子结合形成稳定的MHC-Ⅱ类抗原复合体，被运送到细胞表面，由CD4+ T细胞识别，并激活CD4+ T细胞。本实验发现，HLA-DR的表达强度增强，且HLA-DR+ 细胞在卵巢上皮癌中的数量较卵巢良性肿瘤、正常卵巢组织中的数量均明显增多(P<0.05)。说明在卵巢上皮癌微环境中，抗原呈递细胞的功能有增强的趋势。同时在另外的实验中发现，在卵巢上皮癌中，HLA-DR+细胞与CD4+ T细胞无相关关系，即并没有CD4+ T细胞被激活的现象。Allarena等[6]也曾获得相同的结果。提示，可能存在某种抑制的机制打破了机体免疫监视的平衡，破坏了HLA-DR+细胞与CD4+ T细胞之间的关系。如果能应用一些方法解除这种免疫抑制的状态，使CD4+T细胞增加可能会刺激CD8+T细胞活性，产生较好的杀伤作用。北京大学人民医院妇科肿瘤研究室经过多年研究制备了卵巢癌抗独特型抗体6B11。实验表明，6B11能引起CD4+T细胞增殖，且这种作用可被GM-CSF加强，该研究室还应用基因工程方法构建了6B11-GM融合蛋白。体外实验发现6B11-GM融合蛋白不仅引起了CD4+T细胞的增殖，并有很好的杀伤作用，而且还使APC表达HLA-DR增加，亦再次说明CD4+T细胞的增殖是通过MHC-Ⅱ类途径实现的，提示6B11-GM融合蛋白可作为肿瘤疫苗[7]。我们的细胞表型抗原实验研究证明应用这种疫苗是非常必要的。6B11-GM融合蛋白的作用机制可能是克服了HLA-DR与CD4之间的抑制作用，但还需要进一步深入研究，以便为开展卵巢癌的生物治疗提供理论上的指导。
, 百拇医药
参考文献
1，Seung S,Urban JL,Scheiber H.A tumor escape variant that has lost one major histocompatibility complex class Ⅰ restriction element induces specific CD8+ T cells to an antigen that no longer serves as a target[J].J Exp Med,1993，177：178-933
2，Kono K,Halapi E,Hising C,et al.Mechanisms of escape from CD8+ T cell clones specific for the her-2/neu proto-oncogene expressed in ovarian carcinomas:related and unrelated to decreased MHC-Ⅰ expression[J].Int J Cancer,1997，70:112-119
, 百拇医药
3，Kooi S,Zhang HZ,Patenia R,et al.HLA class Ⅰ expression on human ovarian carcinoma cells correlates with T-cell infiltration in vivo and T-cell expansion in vitro in low concentrations of recombinant interleukin-2[J].Cell Immunol,1996，174(2):116-128
4，Bevan MJ.Antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes in vivo[J].J Exp Med,1995，182:639-641
5，Rock KL.A new foreign policy:MHC class Ⅰ molecules monitor the outside world[J].Immunol Today,1996，17(3):131-137
6，Allarena P,Presti LO,De Bello M,et al.Proliferative respose of lymphocytes from cancer patients to autologous tumor cells[J].Immunol Immunolther,1988，27:69-76
7，杨飞雪，钱和年，刘 蓓.卵巢癌抗独特型抗体/hGM-CSF融合蛋白体外对免疫细胞的刺激作用[J].北京医科大学学报,1999，31:9-12
收稿日期：1999-11-01, http://www.100md.com
单位：徐立新 冯捷 钱和年 姚煜(北京大学人民医院妇科肿瘤中心，北京 100044)；唐岩 唐军民 李枫(北京大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系)
关键词：基因；MHC；Ⅰ类；代谢；卵巢肿瘤；遗传学；上皮细胞
北京医科大学学报000605 [摘 要]目的：通过观察主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。方法：ABC免疫组织化学技术和图像分析。结果：在卵巢上皮癌中，HLA-I+细胞数量与正常卵巢组织相比较明显减少(P<0.05)，并与临床分期和病理分级相关，而表达强度虽亦降低，但差异未见显著性；同时，HLA-DR+细胞数量增多，表达强度增强，且与正常卵巢组织相比较差异具有显著性(P<0.05)。结论：人卵巢上皮癌局部微环境中MHC表达的变化在机体自身抗卵巢肿瘤免疫中起重要作用，这为临床开展卵巢癌的生物治疗提供了实验室依据。
, 百拇医药
[中图分类号]R737.31 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0496-04
The expression of major histocompatibility complex in human ovarian epithelial carcinoma
XU Li-Xin,FENG Jie,QIAN He-Nian,YAO Yu
(Gynecologic Oncology Center,Peking University People's Hospital,Beijing 100044， China)
TANG Jun-Min,TANG Yan,LI Feng
, 百拇医药
(Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:To investigate the numbers and the expression of major histocompatibility complex (MHC) positive cells in human ovarian carcinoma tissues and provide the experimental data in the further biological therapy of ovarian carcinoma.Methods:ABC Immunocytochemistry and Computer imaging techniques.Results:The result showed that the number of HLA-Ⅰ+ cells as fewer in ovarian carcinoma than that of in normal ovarian tissues which were related with clinical stages and pathologic grades whereas the expressive intensity of HLA-Ⅰ had only the tendency to reduce without significant differences.On the other hand,the number of HLA-DR+ cells increased and its expression intensity was stronger in ovarian epithelial cancer than in normal ovarian tissues with significant differences (P<0.05).Conclusion:The expression changes of MHC in local micro-environment of ovarian epithelial carcinoma may play an important role in initiating auto-immunity against ovarian carcinoma.These must be very useful for the further clinical biological therapy of ovarian carcinoma.
, 百拇医药
KEY WORDS Genes,MHC class Ⅰ/metab；Ovarian neoplasms/genet;Epithelial cells
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一组编码细胞表面蛋白分子或抗原的基因组，小鼠的MHC为H-2，而在人则称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。HLA-Ⅰ类主要负责内、外源性抗原(如肿瘤抗原)的加工和呈递。HLA-Ⅱ类，即HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ等主要参与外源性抗原的加工和呈递。肿瘤细胞表面MHC的表达密度降低或缺如，可使肿瘤不呈现或仅呈现弱的抗原性，是造成肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，继续增殖并发生转移的重要原因。研究表明对于某些肿瘤来说，单独一种抗原的丢失有时并不能造成肿瘤的免疫逃避，但只要MHC分子出现某一点异常，即可使肿瘤永远逃避机体的免疫杀伤[1]。用ABC免疫组织化学技术和图像分析观察MHC在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，可了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为进一步在临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料的收集及分类
收集自1993年1月～1998年11月手术切除的31例人卵巢上皮癌、16例良性卵巢肿瘤及10例正常卵巢组织，术前均未经化疗及放疗，均有病理证明并经专家再次鉴定，以上组织分别来源于北京大学第一、人民、第三医院、北京军区总院、北京妇产医院、中国医学科学院肿瘤医院。
31例卵巢上皮癌的患者年龄为25～74岁，临床分期：Ⅰ期4 例、Ⅱ期6 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期1 例。病理分级：高分化(G1)4例、 中等分化(G2)9例、 低分化(G3)18 例；病理类型包括浆液性腺癌、粘液性腺癌、混合性上皮癌、透明细胞癌等。
1.2 组织处理及ABC免疫组织化学技术
各组织经OCT冷冻包埋，用Leica冰冻切片机切5 μm厚冷冻切片，冷风吹干，冷丙酮固定5 min，备用。
, 百拇医药
将冰冻切片用PBS(0.01 mol*L-1 pH 7.36)洗3次(5 min/次)，用0.3%(体积分数)的H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下20 min。PBS洗后，加正常马血清封闭，室温30 min，或 37 ℃ 20 min。弃去血清，滴加适当稀释的抗体[HLA-Ⅰ(体积比1∶900)、HLA-DR(体积比1∶500)，均购于Pharmingen]，室温1 h，转入4℃冰箱过夜(18 h以上)。PBS洗3次，滴加生物素标记的马抗鼠IgG(体积比1∶330)，37 ℃ 1 h。PBS洗3次，滴加过氧化物酶标记的链酶卵白素(体积比1∶200)，37 ℃ 1 h。PBS洗2次，Tris-HCl缓冲液洗1次，DAB液显色，按不同抗体分别固定控制显色时间。终止显色后，水冲洗，Mayor苏木精或2%(体积比)甲绿复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，烤干后镜下观察，图像分析。
1.3 图像分析
, 百拇医药
所有的冰冻切片标本进行ABC法免疫组化染色后，用Leica Q 500MC进行图像分析。每个标本随机选取不重叠的10个视野，选择每张切片的空白处进行校正，并调整灰度，然后对阳性物质进行二值化处理和图像整修，由计算机系统自动计算出阳性细胞的平均灰度和阳性细胞数，根据光密度值(OD)= Lg(空白灰度/平均标本灰度)得出平均光密度(MOD)值(表示表达强度)及标准差(s)值等。
1.4 结果的统计学处理
3组间数据以
±s表示。用Sta-Win软件统计包中的单因素方差分析(ANOVA)，先对3组间均数进行比较，再用t检验(t-test)进行组间两两比较。2 结果
2.1 HLA-Ⅰ在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图1，2)
, 百拇医药
实验结果显示，HLA-Ⅰ抗原呈棕黄色，表达在阳性细胞的细胞膜和细胞质，细胞膜较细胞质着色深(图1)。卵巢上皮癌、良性卵巢肿瘤中的HLA-Ⅰ+细胞数较正常卵巢组织明显减少(表1)，差异有极显著性(P<0.001)；另外，癌组织中HLA-Ⅰ+细胞数与临床分期和病理分级有关(表2)。HLA-Ⅰ阳性细胞表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中较正常卵巢组织相比虽有降低，但差异没有显著性(P>0.05，表3)，且与临床分期和病理分级无关。
表1 不同抗原阳性细胞在卵巢各组织中的数量(个/视野)(
±s)Table 1 The number of different antigen positive cells
in the various ovarian tissues (number/vision)(
±s), http://www.100md.com
Normol ovarian
tissues
Benign ovarian
tumor
Ovarian epithelial
carcinoma
HLA-Ⅰ+
38.8±24.3
5.4±4.5***
7.3±5.8***
HLA-DR+
, 百拇医药
7.2±2.9
6.0±5.5
12.1±8.4**
t-test， **P<0.05，***P<0.001.
2.2 HLA-DR在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图3，4)
结果显示，HLA-DR抗原在正常卵巢组织分布于间质中，在卵巢上皮癌组织多分布于癌巢附近间质中，少数分布在癌细胞膜。呈棕黄色表达,在阳性细胞的细胞膜和细胞浆，细胞膜较细胞浆着色深。卵巢上皮癌中的HLA-DR+细胞数与良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织相比均明显增多，且差异有显著性(P<0.05,表1)。另外，在卵巢上皮癌组织中，HLA-DR+细胞数的变化与临床分期和病理分级无关；同时，HLA-DR的表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中比在正常卵巢组织中均明显增强(表3)，且差异有显著性(P<0.05)，并与临床分期和病理分级有关(表2)。
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表2 卵巢上皮癌组织中HLA与临床分期和病理分级的关系
Table 2 The relationship between HLA and clinical stages and pathologic grade in the ovarian epithelial carcinoma tissues (
±s)Case
HLA-Ⅰ
HLA-DR
Numbers
MOD
Numbers
, 百拇医药
MOD
Ⅰ
4
8.45±6.62
0.12±0.00
12.05±3.12
0.10±0.00
Ⅱ
6
7.60±4.87
0.12±0.02
12.90±2.46
, http://www.100md.com
0.14±0.01
Ⅲ
21
6.20±2.26
0.11±0.01
9.20±6.22
0.14±0.03
G1
4
8.98±4.26
0.12±0.01
, 百拇医药
13.15±0.09
0.11±0.00
G2
9
9.97±2.61
0.12±0.01
11.49±7.51
0.15±0.01
G3
18
5.80±1.26
, 百拇医药 0.12±0.01
14.13±5.26
0.13±0.01
t-test,* P<0.05.
图1 HLA-Ⅰ+细胞在正常卵巢组织中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×400
Figure 1 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the normal ovarian tissues ABC immunohistochemical method ×400
, 百拇医药
图2 HLA-Ⅰ+ 细胞在卵巢上皮癌中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×400
Figure 2 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the ovarian epithelial carcinoma tissues ABC immunohistochemical method ×400
图3 HLA-DR+ 细胞在正常卵巢中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×200
Figure 3 The distribution of HLA-DR+ cells in the normal ovarian tissues ABC immunohistochemical method ×200
, 百拇医药
图4 HLA-DR+细胞在卵巢上皮癌中的分布 ABC免疫组织化学方法 ×200
Figure 4 The distribution of HLA-Ⅰ+ cells in the ovarian epithelial carcinoma tissues ABC immunohistochemical method ×200
表3 卵巢各组织中不同抗原表达强度的比较(
±s)Table 3 The expressive intensity of different antigen
in the various ovarian tissues(
±s), 百拇医药
MOD
Normol ovarian
tissues(n=10)
Benign ovarian
tumor(n=16)
Ovarian epithelial
carcinoma(n=31)
HLA-Ⅰ+
0.122±0.020
0.118±0.012
0.115±0.013
, http://www.100md.com
HLA-DR+
0.114±0.019
0.139±0.025
0.141±0.028
t-test,*P<0.05.3 讨论
HLA在卵巢上皮癌的表达，本实验在卵巢上皮癌中HLA-Ⅰ的表达强度减弱，但差异没有显著性；而其阳性细胞的数量明显减少，表明HLA-Ⅰ类总表达量是下降的，由此导致肿瘤细胞免疫原性降低，不能有效地将肿瘤抗原呈递给CD8+ T细胞，因而不能有效发挥CD8+ T细胞的细胞毒作用,这与Kono[2]的观点相似。说明HLA-Ⅰ类限制性因素下降是卵巢肿瘤细胞逃避CD8+ T细胞特异性杀伤的一个重要因素，另外HLA-Ⅰ类总表达量的下降也增加了肿瘤对NK细胞杀伤的敏感性，促进了免疫逃避的发生。
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卵巢上皮癌中MHC与T细胞的关系：Kooi等[3]用免疫组织化学的方法观察卵巢上皮癌中HLA-Ⅰ或HLA-Ⅱ类抗原及白细胞抗原(LCA、CD3、CD4、CD8)决定簇的情况。结果在90%(18/20)的卵巢上皮癌冰冻切片中，至少有5%的肿瘤细胞表达HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类抗原，同时还观察到，HLA-Ⅰ+ 的卵巢上皮癌细胞数量与CD3+、CD4+、CD8+细胞数量分别呈明显的相关关系；HLA-Ⅱ+的肿瘤细胞数量仅与CD8+T细胞呈正相关。本实验也发现，在卵巢肿瘤组织中，HLA-Ⅰ+ 的表达与CD3+的表达呈明显的相关关系(r=0.43)。因而，可以说明在卵巢上皮癌的微环境中，HLA的表达与T细胞相关。
另外，HLA-DR表达在抗原呈递细胞的表面。具有吞噬功能的抗原呈递细胞在激活CTL免疫应答中发挥着关键性的作用[4，5]。抗原在APC内经溶酶体作用，被水解成肽段，然后与MHC-Ⅱ类分子结合形成稳定的MHC-Ⅱ类抗原复合体，被运送到细胞表面，由CD4+ T细胞识别，并激活CD4+ T细胞。本实验发现，HLA-DR的表达强度增强，且HLA-DR+ 细胞在卵巢上皮癌中的数量较卵巢良性肿瘤、正常卵巢组织中的数量均明显增多(P<0.05)。说明在卵巢上皮癌微环境中，抗原呈递细胞的功能有增强的趋势。同时在另外的实验中发现，在卵巢上皮癌中，HLA-DR+细胞与CD4+ T细胞无相关关系，即并没有CD4+ T细胞被激活的现象。Allarena等[6]也曾获得相同的结果。提示，可能存在某种抑制的机制打破了机体免疫监视的平衡，破坏了HLA-DR+细胞与CD4+ T细胞之间的关系。如果能应用一些方法解除这种免疫抑制的状态，使CD4+T细胞增加可能会刺激CD8+T细胞活性，产生较好的杀伤作用。北京大学人民医院妇科肿瘤研究室经过多年研究制备了卵巢癌抗独特型抗体6B11。实验表明，6B11能引起CD4+T细胞增殖，且这种作用可被GM-CSF加强，该研究室还应用基因工程方法构建了6B11-GM融合蛋白。体外实验发现6B11-GM融合蛋白不仅引起了CD4+T细胞的增殖，并有很好的杀伤作用，而且还使APC表达HLA-DR增加，亦再次说明CD4+T细胞的增殖是通过MHC-Ⅱ类途径实现的，提示6B11-GM融合蛋白可作为肿瘤疫苗[7]。我们的细胞表型抗原实验研究证明应用这种疫苗是非常必要的。6B11-GM融合蛋白的作用机制可能是克服了HLA-DR与CD4之间的抑制作用，但还需要进一步深入研究，以便为开展卵巢癌的生物治疗提供理论上的指导。
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参考文献
1，Seung S,Urban JL,Scheiber H.A tumor escape variant that has lost one major histocompatibility complex class Ⅰ restriction element induces specific CD8+ T cells to an antigen that no longer serves as a target[J].J Exp Med,1993，177：178-933
2，Kono K,Halapi E,Hising C,et al.Mechanisms of escape from CD8+ T cell clones specific for the her-2/neu proto-oncogene expressed in ovarian carcinomas:related and unrelated to decreased MHC-Ⅰ expression[J].Int J Cancer,1997，70:112-119
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3，Kooi S,Zhang HZ,Patenia R,et al.HLA class Ⅰ expression on human ovarian carcinoma cells correlates with T-cell infiltration in vivo and T-cell expansion in vitro in low concentrations of recombinant interleukin-2[J].Cell Immunol,1996，174(2):116-128
4，Bevan MJ.Antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes in vivo[J].J Exp Med,1995，182:639-641
5，Rock KL.A new foreign policy:MHC class Ⅰ molecules monitor the outside world[J].Immunol Today,1996，17(3):131-137
6，Allarena P,Presti LO,De Bello M,et al.Proliferative respose of lymphocytes from cancer patients to autologous tumor cells[J].Immunol Immunolther,1988，27:69-76
7，杨飞雪，钱和年，刘 蓓.卵巢癌抗独特型抗体/hGM-CSF融合蛋白体外对免疫细胞的刺激作用[J].北京医科大学学报,1999，31:9-12
收稿日期：1999-11-01, http://www.100md.com