子宫肌瘤孕激素受体A、B亚型的表达
作者：魏丽惠 屠铮 王建六 李小平 崔恒 钱和年
单位：北京大学人民医院妇科，北京 100044
关键词：子宫肿瘤；平滑肌瘤；孕激素类代谢；RNA；信使；代谢
北京医科大学学报000602 [摘 要]目的：探讨两种孕激素受体亚型(hPR-A和hPR-B)在子宫肌瘤发生、发展中的意义，为临床药物治疗子宫肌瘤提供理论依据。方法：选取30例因子宫肌瘤行全子宫切除术的标本，取肌瘤组织和正常肌层组织分别制成石蜡切片和冰冻标本。前者经免疫组化定位研究孕激素受体亚型；后者经蛋白质提取和Western印迹定量研究孕激素受体亚型的蛋白表达；从冰冻组织中提取RNA，通过逆转录-多聚酶链反应，半定量研究孕激素受体亚型的mRNA表达。结果：(1)免疫组化显示子宫肌瘤和正常肌层细胞的细胞核中，可见hPR阳性颗粒；(2)蛋白定量中hPR-(A+B)和hPR-A在子宫肌瘤的表达均高于正常肌层；子宫肌瘤和正常肌层中，hPR-B表达均明显高于hPR-A；(3) hPR-A、hPR-B和hPR-(A+B)的mRNA在肌瘤的表达量均高于周围正常肌层；(4)无论在子宫肌瘤还是在正常肌层组织中，hPR-A与hPR-B的mRNA表达量差异无显著性，与A、B亚型受体蛋白在子宫肌瘤和正常肌层的分布差异有显著性的情况不平行，提示可能存在转录后调控的差异。结论：hPR-A、hPR-B为核受体；A亚型蛋白表达在子宫肌瘤高于正常肌层；A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤表达均高于正常肌层；孕激素受体亚型，特别是hPR-A与子宫肌瘤的发生有关。
, 百拇医药
[中图分类号]R737.33 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0483-05
Expression of human progesterone receptor isoforms A and B in uterine leiomyoma
WEI Li-Hui,TU Zheng,WANG Jian-Liu,LI Xiao-Ping,CUI Heng,QIAN He-Nian
(Department of Gynecology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the role of two isoforms of human progesterone receptor (hPR-A and hPR-B)in the development and progression of uterine leiomyoma,their distribution and ratio of expression in leiomyoma and normal myometrium were detected respectively,that may be related to the remedy treatment for leiomyoma.Methods:The tissues of leiomyoma and normal myometrium from 30 uteri,which were excised for leiomyoma,were used for the localization and quantification of protein of the above isoforms.Immunohistochemistry and Western blot were applied respectively.Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the relative concentrations of the hPR isoforms.Results:(1)Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.(2)Concentrations of hPR-(A+B) and hPR-A in leiomyoma were higher than those in normal myometrium.Both isoforms were presented in leiomyoma and normal myometrium,with a consistent dominance of hPR-B over hPR-A.(3)There were more hPR-A,hPR-B and hPR-(A+B) in mRNA of leiomyoma than those in normal myometrium.(4) hPR-A and hPR-B in mRNA expressed equally in leiomyoma and normal myometrium，which was not parallel to the expression in protein.Conclusion:Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.The hPR-A in protein expressed higher level in leiomyoma than that in normal myometrium.hPR-A and hPR-B of mRNA were more in leiomyoma than those in normal myometrium.The development of uterine leiomyoma seems related to the progesterone receptor isoforms,especially hPR-A.
, 百拇医药
KEY WORDS Ulterine neoplasms;Leiomyoma;Progestational hormones/metab;RNA,messenger systems/metab
子宫肌瘤是一种激素依赖性的良性肿瘤，治疗长期以来以手术为主。但对于尚未生育的子宫肌瘤患者，手术治疗具有局限性，而针对发病机制的内分泌治疗受到广泛关注。除雌激素外，不少学者报道孕激素对子宫肌瘤的发病具有重要作用，而且这种作用通过孕激素受体介导。但这些研究多数为临床观察性研究或体外细胞学研究。为了进一步探讨孕激素的作用机制，本研究从蛋白和mRNA的分子水平探讨孕激素受体亚型与子宫肌瘤发生的关系[1]。
1 材料与方法
1.1 材料
选取1999年5至7月间，我院妇科收治的育龄期子宫肌瘤患者30例，均为汉族，平均年龄44.2岁(34～51岁)，月经规律，手术前3个月内未服用过激素类药物，无糖尿病、甲亢等内分泌合并症，均行子宫全切术。手术切除标本均经我院病理科确诊为子宫肌瘤，结合患者月经史和子宫内膜病理诊断，17例处于分泌期，13例处于增生期。术中子宫标本离体后15 min内分别切取肌瘤部位及远离肌瘤的正常子宫肌层组织各1.0 g，液氮内保存。另取一份相同部位组织经甲醛固定，石蜡包埋备用。
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单克隆抗体AB-52、B-30：美国Santa Cruz公司；单克隆抗体1A6：美国Zymed公司；单克隆抗体JZB39：美国芝加哥大学Geoffrey Greene教授惠赠；过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体：美国Jackson免疫试剂公司；过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒：美国KPL公司；常规免疫组化试剂盒Histostain-plus SP：美国Zymed公司惠赠；Trizol试剂盒：Gibco公司；逆转录酶M-MLV及Taq酶：Promega公司；DMEM培养基：Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化定位研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型 分别取手术切除的子宫肌瘤及正常肌层组织石蜡块，每块连续切取5张5 μm厚的切片，1张用于HE染色核实病理诊断；另4张应用Histostain-plus SP试剂盒进行免疫组化染色。分别应用鼠抗人的单抗：识别hPR-A和hPR-B的AB-52(体积比1∶40)、1A6(体积比1∶100)和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶20)；另一张不加一抗作为阴性对照。取子宫内膜组织切片作为阳性对照。
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1.2.2 Western印迹定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型 将冰冻组织匀浆，加入细胞悬浮缓冲液(10 mmol*L-1 Tris*HCl,100 mmol*L-1 NaCl,1 mmol*L-1 EDTA,100 mg*L-1苯*****)和上样缓冲液[50 mmol*L-1 Tris*HCl,100 mmol*L-1二硫苏糖醇,2%(质量分数)SDS,10%(体积分数)甘油],提取组织总蛋白。以考马斯亮蓝法(Bradford,1976)测定蛋白含量。将100 μg样本蛋白上样于8%(质量分数)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，半干法转膜(electrotransferred to nitrocellulose filter)2 h，硝纤膜在4 ℃含10%(质量分数)脱脂奶粉的Tris盐缓冲液中封闭过夜。一抗分别应用同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52(体积比1∶400)、1A6(体积比1∶1000)、JZB39(体积比1∶400)和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶400)，与硝纤膜室温杂交2 h；二抗为1∶1000(体积比)过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体，室温杂交1 h；应用过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒进行增强发光，曝光X光胶片并冲洗。图像扫描X光胶片，测定条带密度值，测定结果以配对t检验或成组t检验进行统计学分析。
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1.2.3 RT-PCR半定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型mRNA水平 冻存组织标本匀浆以Trizol试剂盒提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，逆转录为cDNA。根据孕激素受体的cDNA序列[1]，设计并合成符合分子生物学实验要求的引物序列：
hPR-B特异cDNA区域的引物序列，扩增片段长度529bp
上游 5′-TCATGACTGAGCTGAAGGCAAAG-3′
下游 5′-GAGCTGTCTCCAACCTTGCAC-3′
hPR-A和hPR-B共同cDNA区域的引物序列，扩增片段长度566bp
上游 5′-TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3′
, 百拇医药
下游 5′-CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3′
内参GAPDH的引物序列，扩增片段长度230bp[2]
上游 5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′
下游 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′
每个cDNA样品除分别完成上述3对引物的扩增外，另配制一PCR反应体系，不加任何引物进行扩增，扩增条件同hPR-A和hPR-B共同序列，作为阴性对照。每一PCR反应至少重复3次。PCR产物于2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，密度扫描分析仪测定扩增条带的密度值，配对t检验或成组t检验进行统计学分析。
2 结果
, 百拇医药 2.1 免疫组化定位孕激素受体亚型
免疫组化切片中，以同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52和1A6作为一抗，结果相似，在部分子宫肌瘤细胞、肌层细胞及内膜细胞的细胞核中，可见阳性的黄色或棕黄色颗粒，细胞膜和细胞浆中均未见阳性颗粒(图1)。应用特异性识别hPR-B的B-30抗体，可见类似结果(图2)，但是染色较AB-52和1A6为浅。表明孕激素受体A、B亚型均为核受体。
图1 子宫肌瘤组织(a)和正常肌层(b)的hPR-A和hPR-B
(抗体AB-52)免疫组化 ×200
Figure 1 Immunohistochemistry of leiomyoma (a) and normal
, 百拇医药
myometrial (b) tissues from one patient,using monoclonal antibody
(AB-52) against hPR-A and hPR-B.(Original magnification ×200)
2.2 孕激素受体亚型在子宫肌瘤及正常肌层表达的定量研究
hPR-(A+B)和hPR-A在子宫肌瘤表达均高于正常肌层 (P=0.0415,P=0.000563)，hPR-B表达在肌瘤和正常肌层差异无显著性(P=0.402；表1，图3、4)。应用识别hPR-A和hPR-B的单抗AB-52时，子宫肌瘤和正常子宫肌层中，hPR-B表达均明显高于hPR-A(P=2.97×10-12,P=1.19×10-15)。换用抗体1A6和JZB39重复实验，与上述结果相似。hPR-A/hPR-B在子宫肌瘤组织中明显高于正常肌层(P=5.85×10-6)。
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图2 子宫肌瘤组织(a)和正常肌层(b)的hPR-B
(抗体B-30)免疫组化 ×200
Figure 2 Immunohistochemistry of leiomyoma (a) and normal
myometrial (b) tissues from one patient,using monoclonal
antibody (B-30) against hPR-B.(Original magnification ×200)
2.3 RT-PCR半定量研究孕激素受体A、B亚型的mRNA水平
hPR-A、hPR-B、hPR-(A+B)的mRNA表达量在肌瘤高于周围正常肌层(P=0.00228;P=0.0175;P=0.00113)。mRNA表达量的比值hPR-A/hPR-B在肌瘤与正常肌层差异无显著性(P=0.837；表2，图5)。在子宫肌瘤组织中hPR-A与hPR-B的mRNA表达量差异无显著性(P=0.230)；在周围正常肌层组织中，hPR-A与hPR-B的mRNA表达量亦差异无显著性(P=0.138)。
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表1 Western印迹试验条带密度值(单抗AB-52,n=30)
Table 1 Immunoreactive bands density of Western blotting(monoclonal antibody AB-52,n=30)
Leiomyoma
Myometrium
Difference
P value
hPR-A
67018±15858
31131±11988
, 百拇医药
35887±5447
0.000563
hPR-B
228778±72897
225143±61078
3635±796
0.402
hPR-(A+B)
295796±90856
256275±98560
39521±1205
0.0415
, 百拇医药
hPR-A/hPR-B
0.29±0.09
0.12±0.05
0.17±0.08
0.00000585
P(hPR-A vs hPR-B)
2.97×10-12
1.19×10-15
2.4 基因表达的调控问题
同一组配对样本中，转录自同一基因的孕激素受体A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤的含量较正常肌层为多(表2)，提示子宫肌瘤的发生可能与基因水平或转录水平的异常调控有关。同一组织中，孕激素受体亚型A、B的mRNA和蛋白的比例不平行，表明其转录后水平的调控有差异。
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3 讨论
3.1 孕激素受体亚型与子宫肌瘤的关系
hPR是结构复杂的蛋白质，由多个结构功能域组成，至少存在两种不同亚型，A亚型(hPR-A)相对分子质量94×103，由769个氨基酸组成，B亚型(hPR-B)相对分子质量116×103，由933个氨基酸组成，在氨基端比A亚型长164个氨基酸[1]。
以往认为雌激素是肌瘤发生、发展的主要促进因素，近年愈来愈多的研究表明孕激素对子宫肌瘤的生长有重要作用[9]。孕激素通过其受体发生生物学效应。而孕激素受体两种亚型有结构和功能的差异，其分布及比例对孕激素靶器官的生理、病理变化产生不同影响。
3.2 孕激素受体亚型在子宫肌瘤的高表达
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本研究证实hPR在人子宫肌瘤的分布明显高于周围正常肌组织，与文献报道一致[10，11]，支持孕激素在子宫肌瘤发病机制中有重要作用的理论。应用蛋白免疫印迹法，虽然上样时总蛋白量一致，但是化学发光显示的孕激素受体亚型条带的密度在不同患者差别很大，可达1～2个数量级，说明hPR的蛋白表达个体差异很大，本研究将来自同一子宫的肌瘤和正常肌层组织配对比较，排除了个体差异对结果的影响，同时排除了不同激素环境对子宫肌瘤发生、发展的影响，试验结果直接反映肌瘤局部与正常肌层之间的差别。hPR在子宫肌瘤含量较高，说明孕激素对肌瘤局部的生物学效应较对周围正常肌层的作用强，细胞内转录活化作用增强，肌瘤局部增生活跃[10]，可能是子宫肌瘤形成的原因之一。
表2 子宫肌瘤与正常肌层孕激素受体亚型RT-PCR扩增条带密度值(n=22)
Table 2 RT-PCR bands density of hPR isoforms in myoma and normal myometrium(n=22)
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Leiomyoma
Myometrium
Difference
P value
hPR-A
0.863±0.387
0.429±0.302
0.433±0.285
0.00228
hPR-B
0.760±0.303
0.556±0.309
, 百拇医药
0.204±0.170
0.0175
hPR-(A+B)
1.622±0.574
0.985±0.473
0.637±0.393
0.00113
hPR-A/hPR-B
1.316±1.059
1.229±1.627
0.787±0.426
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0.837
P(hPR-A vs hPR-B)
0.230
0.138
图3 抗体AB-52的Western印迹
Figure 3 Western blot with monoclonal antibody AB-52 of 100μg
total protein from leiomyoma (3,5,7,9,11) and corresponding
normalmyometrium (4,6,8,10,12),in pairs,from 5 patients
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图4 抗体B-30的Western印迹
Figure 4 Western blot with monoclonal antibody B-30 of 100μg
total protein from leiomyoma (3,5,7,9,11) and corresponding
normal myometrium (4,6,8,10,12),in pairs,from 5 patients
孕激素受体A、B亚型的功能，与孕激素或其类似物结合时，hPR-B比hPR-A转录活化作用强[3，4]；hPR-A对hPR-B介导的类似物转录活化有抑制作用[3]。hPR-A可通过非PR结合DNA的机制，抑制雌激素受体[5]、雄激素受体、糖皮质激素受体和盐皮质激素受体[3]介导的转录作用；hPR-B无此作用[5]。两种孕激素受体亚型可能通过不同机制影响其他转录因子的活性[6]。孕激素受体作为整体，各结构域在执行功能时或协同或抑制[7]。
, 百拇医药
雌激素在体内和体外均能引起PR表达增加[8]。雌二醇通过诱导启动子A和启动子B，在转录水平增加hPR两亚型mRNA的数量[1]。另外，雌激素调控具有细胞特异性。雌二醇上调子宫内膜间质细胞A、B亚型的mRNA的表达，并呈剂量依赖性[8]。孕激素上调子宫内膜间质细胞PR蛋白和PR的mRNA的水平(A、B亚型)，并与配体受体结合相关[8]。孕激素下调子宫内膜腺上皮细胞PR和PR的mRNA的水平(A、B亚型)[8]。
图5 组织RNA的RT-PCR产物凝胶电泳
Figure 5 RT-PCR of total RNA extracted from tissues of
leiomyoma (lane 1-4) and corresponding normal myometrium (lane 6-9)
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from one uterus.Lane 5 represents PCR markers
本研究蛋白印迹显示，hPR-B在子宫肌瘤和正常肌层的表达差异无显著性，hPR-A在子宫肌瘤的表达明显高于正常肌层，导致肌瘤总hPR水平增高及hPR-A/hPR-B升高，与文献[10，11]报道一致。雌激素促瘤作用的机制之一是通过子宫局部雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导的转录活化作用，体外试验hPR-B比hPR-A活化转录的作用强[3]。hPR-A可通过非PR结合DNA的机制，抑制ER和hPR-B介导的转录活化作用[3，5]。hPR-A和配体结合后抑制hPR-B和ER的转录活性，为孕激素拮抗剂治疗子宫肌瘤提供了理论依据。
3.3 孕激素受体亚型的mRNA在子宫肌瘤高表达
本研究结果提示，子宫肌瘤的hPR-A与hPR-B亚型的mRNA表达均较周围正常肌层为高，与蛋白表达的差异平行。文献报道Northern印迹法显示9例子宫肌瘤的hPR的mRNA较正常肌层高2～15倍[10]。RNA酶保护性分析发现，11例中两种亚型mRNA表达在子宫肌瘤与周围正常肌层差异无显著性[11]，这种结果的差异可能与病例数的差别、研究方法不同等因素相关，采取扩大样本量，改进试验方法，应用多种方法对同一样本进行研究等措施，将有助于得到比较客观的结果。
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3.4 孕激素受体亚型表达的调控
子宫肌瘤孕激素受体A、B亚型的蛋白和mRNA表达量均较周围正常肌层为高，其机制目前尚未完全明确，可能涉及多种调控因素。
hPR表达受雌激素调控，故hPR高表达可能与雌激素或雌激素受体在子宫分布的变化有关。研究发现,雌激素在大鼠体内和体外人类子宫肌细胞系均能增加PR的表达[12，13]。子宫肌瘤比正常肌层雌二醇含量为高[10]，同时，子宫肌瘤局部的ER含量较高，雌激素的局部生物学效应因而增强，功能性ER的高表达导致PR水平增高[10]。进一步测定子宫肌瘤中ER的表达情况，可对这一机制深入探讨。
孕激素对hPR的表达亦有调控作用。孕激素可以增加子宫内膜间质细胞PR表达，并与配体受体结合相关[8]；孕激素下调子宫内膜腺上皮细胞PR表达[8]；对人乳癌细胞系(T47D,MD-231,MCF-7)和宫颈癌细胞系(HeLa)的研究显示，孕激素负反馈调节PR的mRNA和受体蛋白的表达，孕激素拮抗剂则没有这种作用[14]。本研究发现分泌期子宫肌瘤和正常肌层的hPR-A蛋白表达均较增生期增加，而其mRNA的含量仅在子宫肌瘤组织中有明显升高，可能提示孕激素对子宫肌瘤中的受体上调作用更明显，其作用可能发生在转录后水平。
, 百拇医药
本研究中，同一组配对样本中，转录自同一基因的孕激素受体A、B亚型的mRNA，在子宫肌瘤的含量较正常肌层为多，提示子宫肌瘤的发生可能与基因水平或转录水平的异常调控有关。同一组织中，孕激素受体亚型A、B的mRNA和蛋白的比例不平行，表明其转录后水平的调控不同。根据分子生物学的中心法则，任何蛋白质的表达均受到基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平等多个阶段的调控，具体何种机制通过何种方式造成子宫肌瘤的hPR亚型高表达，是深入探讨子宫肌瘤发病机制的关键，有待进一步的研究。
参考文献
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收稿日期：2000-06-19, http://www.100md.com
单位：北京大学人民医院妇科，北京 100044
关键词：子宫肿瘤；平滑肌瘤；孕激素类代谢；RNA；信使；代谢
北京医科大学学报000602 [摘 要]目的：探讨两种孕激素受体亚型(hPR-A和hPR-B)在子宫肌瘤发生、发展中的意义，为临床药物治疗子宫肌瘤提供理论依据。方法：选取30例因子宫肌瘤行全子宫切除术的标本，取肌瘤组织和正常肌层组织分别制成石蜡切片和冰冻标本。前者经免疫组化定位研究孕激素受体亚型；后者经蛋白质提取和Western印迹定量研究孕激素受体亚型的蛋白表达；从冰冻组织中提取RNA，通过逆转录-多聚酶链反应，半定量研究孕激素受体亚型的mRNA表达。结果：(1)免疫组化显示子宫肌瘤和正常肌层细胞的细胞核中，可见hPR阳性颗粒；(2)蛋白定量中hPR-(A+B)和hPR-A在子宫肌瘤的表达均高于正常肌层；子宫肌瘤和正常肌层中，hPR-B表达均明显高于hPR-A；(3) hPR-A、hPR-B和hPR-(A+B)的mRNA在肌瘤的表达量均高于周围正常肌层；(4)无论在子宫肌瘤还是在正常肌层组织中，hPR-A与hPR-B的mRNA表达量差异无显著性，与A、B亚型受体蛋白在子宫肌瘤和正常肌层的分布差异有显著性的情况不平行，提示可能存在转录后调控的差异。结论：hPR-A、hPR-B为核受体；A亚型蛋白表达在子宫肌瘤高于正常肌层；A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤表达均高于正常肌层；孕激素受体亚型，特别是hPR-A与子宫肌瘤的发生有关。
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Expression of human progesterone receptor isoforms A and B in uterine leiomyoma
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(Department of Gynecology,Peking University People's Hospital,Beijing 100044,China)
ABSTRACT Objective:To investigate the role of two isoforms of human progesterone receptor (hPR-A and hPR-B)in the development and progression of uterine leiomyoma,their distribution and ratio of expression in leiomyoma and normal myometrium were detected respectively,that may be related to the remedy treatment for leiomyoma.Methods:The tissues of leiomyoma and normal myometrium from 30 uteri,which were excised for leiomyoma,were used for the localization and quantification of protein of the above isoforms.Immunohistochemistry and Western blot were applied respectively.Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the relative concentrations of the hPR isoforms.Results:(1)Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.(2)Concentrations of hPR-(A+B) and hPR-A in leiomyoma were higher than those in normal myometrium.Both isoforms were presented in leiomyoma and normal myometrium,with a consistent dominance of hPR-B over hPR-A.(3)There were more hPR-A,hPR-B and hPR-(A+B) in mRNA of leiomyoma than those in normal myometrium.(4) hPR-A and hPR-B in mRNA expressed equally in leiomyoma and normal myometrium，which was not parallel to the expression in protein.Conclusion:Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.The hPR-A in protein expressed higher level in leiomyoma than that in normal myometrium.hPR-A and hPR-B of mRNA were more in leiomyoma than those in normal myometrium.The development of uterine leiomyoma seems related to the progesterone receptor isoforms,especially hPR-A.
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KEY WORDS Ulterine neoplasms;Leiomyoma;Progestational hormones/metab;RNA,messenger systems/metab
子宫肌瘤是一种激素依赖性的良性肿瘤，治疗长期以来以手术为主。但对于尚未生育的子宫肌瘤患者，手术治疗具有局限性，而针对发病机制的内分泌治疗受到广泛关注。除雌激素外，不少学者报道孕激素对子宫肌瘤的发病具有重要作用，而且这种作用通过孕激素受体介导。但这些研究多数为临床观察性研究或体外细胞学研究。为了进一步探讨孕激素的作用机制，本研究从蛋白和mRNA的分子水平探讨孕激素受体亚型与子宫肌瘤发生的关系[1]。
1 材料与方法
1.1 材料
选取1999年5至7月间，我院妇科收治的育龄期子宫肌瘤患者30例，均为汉族，平均年龄44.2岁(34～51岁)，月经规律，手术前3个月内未服用过激素类药物，无糖尿病、甲亢等内分泌合并症，均行子宫全切术。手术切除标本均经我院病理科确诊为子宫肌瘤，结合患者月经史和子宫内膜病理诊断，17例处于分泌期，13例处于增生期。术中子宫标本离体后15 min内分别切取肌瘤部位及远离肌瘤的正常子宫肌层组织各1.0 g，液氮内保存。另取一份相同部位组织经甲醛固定，石蜡包埋备用。
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单克隆抗体AB-52、B-30：美国Santa Cruz公司；单克隆抗体1A6：美国Zymed公司；单克隆抗体JZB39：美国芝加哥大学Geoffrey Greene教授惠赠；过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体：美国Jackson免疫试剂公司；过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒：美国KPL公司；常规免疫组化试剂盒Histostain-plus SP：美国Zymed公司惠赠；Trizol试剂盒：Gibco公司；逆转录酶M-MLV及Taq酶：Promega公司；DMEM培养基：Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化定位研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型 分别取手术切除的子宫肌瘤及正常肌层组织石蜡块，每块连续切取5张5 μm厚的切片，1张用于HE染色核实病理诊断；另4张应用Histostain-plus SP试剂盒进行免疫组化染色。分别应用鼠抗人的单抗：识别hPR-A和hPR-B的AB-52(体积比1∶40)、1A6(体积比1∶100)和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶20)；另一张不加一抗作为阴性对照。取子宫内膜组织切片作为阳性对照。
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1.2.2 Western印迹定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型 将冰冻组织匀浆，加入细胞悬浮缓冲液(10 mmol*L-1 Tris*HCl,100 mmol*L-1 NaCl,1 mmol*L-1 EDTA,100 mg*L-1苯*****)和上样缓冲液[50 mmol*L-1 Tris*HCl,100 mmol*L-1二硫苏糖醇,2%(质量分数)SDS,10%(体积分数)甘油],提取组织总蛋白。以考马斯亮蓝法(Bradford,1976)测定蛋白含量。将100 μg样本蛋白上样于8%(质量分数)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，半干法转膜(electrotransferred to nitrocellulose filter)2 h，硝纤膜在4 ℃含10%(质量分数)脱脂奶粉的Tris盐缓冲液中封闭过夜。一抗分别应用同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52(体积比1∶400)、1A6(体积比1∶1000)、JZB39(体积比1∶400)和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶400)，与硝纤膜室温杂交2 h；二抗为1∶1000(体积比)过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体，室温杂交1 h；应用过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒进行增强发光，曝光X光胶片并冲洗。图像扫描X光胶片，测定条带密度值，测定结果以配对t检验或成组t检验进行统计学分析。
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1.2.3 RT-PCR半定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型mRNA水平 冻存组织标本匀浆以Trizol试剂盒提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，逆转录为cDNA。根据孕激素受体的cDNA序列[1]，设计并合成符合分子生物学实验要求的引物序列：
hPR-B特异cDNA区域的引物序列，扩增片段长度529bp
上游 5′-TCATGACTGAGCTGAAGGCAAAG-3′
下游 5′-GAGCTGTCTCCAACCTTGCAC-3′
hPR-A和hPR-B共同cDNA区域的引物序列，扩增片段长度566bp
上游 5′-TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3′
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下游 5′-CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3′
内参GAPDH的引物序列，扩增片段长度230bp[2]
上游 5′-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′
下游 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′
每个cDNA样品除分别完成上述3对引物的扩增外，另配制一PCR反应体系，不加任何引物进行扩增，扩增条件同hPR-A和hPR-B共同序列，作为阴性对照。每一PCR反应至少重复3次。PCR产物于2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，密度扫描分析仪测定扩增条带的密度值，配对t检验或成组t检验进行统计学分析。
2 结果
, 百拇医药 2.1 免疫组化定位孕激素受体亚型
免疫组化切片中，以同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52和1A6作为一抗，结果相似，在部分子宫肌瘤细胞、肌层细胞及内膜细胞的细胞核中，可见阳性的黄色或棕黄色颗粒，细胞膜和细胞浆中均未见阳性颗粒(图1)。应用特异性识别hPR-B的B-30抗体，可见类似结果(图2)，但是染色较AB-52和1A6为浅。表明孕激素受体A、B亚型均为核受体。
图1 子宫肌瘤组织(a)和正常肌层(b)的hPR-A和hPR-B
(抗体AB-52)免疫组化 ×200
Figure 1 Immunohistochemistry of leiomyoma (a) and normal
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myometrial (b) tissues from one patient,using monoclonal antibody
(AB-52) against hPR-A and hPR-B.(Original magnification ×200)
2.2 孕激素受体亚型在子宫肌瘤及正常肌层表达的定量研究
hPR-(A+B)和hPR-A在子宫肌瘤表达均高于正常肌层 (P=0.0415,P=0.000563)，hPR-B表达在肌瘤和正常肌层差异无显著性(P=0.402；表1，图3、4)。应用识别hPR-A和hPR-B的单抗AB-52时，子宫肌瘤和正常子宫肌层中，hPR-B表达均明显高于hPR-A(P=2.97×10-12,P=1.19×10-15)。换用抗体1A6和JZB39重复实验，与上述结果相似。hPR-A/hPR-B在子宫肌瘤组织中明显高于正常肌层(P=5.85×10-6)。
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图2 子宫肌瘤组织(a)和正常肌层(b)的hPR-B
(抗体B-30)免疫组化 ×200
Figure 2 Immunohistochemistry of leiomyoma (a) and normal
myometrial (b) tissues from one patient,using monoclonal
antibody (B-30) against hPR-B.(Original magnification ×200)
2.3 RT-PCR半定量研究孕激素受体A、B亚型的mRNA水平
hPR-A、hPR-B、hPR-(A+B)的mRNA表达量在肌瘤高于周围正常肌层(P=0.00228;P=0.0175;P=0.00113)。mRNA表达量的比值hPR-A/hPR-B在肌瘤与正常肌层差异无显著性(P=0.837；表2，图5)。在子宫肌瘤组织中hPR-A与hPR-B的mRNA表达量差异无显著性(P=0.230)；在周围正常肌层组织中，hPR-A与hPR-B的mRNA表达量亦差异无显著性(P=0.138)。
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表1 Western印迹试验条带密度值(单抗AB-52,n=30)
Table 1 Immunoreactive bands density of Western blotting(monoclonal antibody AB-52,n=30)
Leiomyoma
Myometrium
Difference
P value
hPR-A
67018±15858
31131±11988
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35887±5447
0.000563
hPR-B
228778±72897
225143±61078
3635±796
0.402
hPR-(A+B)
295796±90856
256275±98560
39521±1205
0.0415
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hPR-A/hPR-B
0.29±0.09
0.12±0.05
0.17±0.08
0.00000585
P(hPR-A vs hPR-B)
2.97×10-12
1.19×10-15
2.4 基因表达的调控问题
同一组配对样本中，转录自同一基因的孕激素受体A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤的含量较正常肌层为多(表2)，提示子宫肌瘤的发生可能与基因水平或转录水平的异常调控有关。同一组织中，孕激素受体亚型A、B的mRNA和蛋白的比例不平行，表明其转录后水平的调控有差异。
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3 讨论
3.1 孕激素受体亚型与子宫肌瘤的关系
hPR是结构复杂的蛋白质，由多个结构功能域组成，至少存在两种不同亚型，A亚型(hPR-A)相对分子质量94×103，由769个氨基酸组成，B亚型(hPR-B)相对分子质量116×103，由933个氨基酸组成，在氨基端比A亚型长164个氨基酸[1]。
以往认为雌激素是肌瘤发生、发展的主要促进因素，近年愈来愈多的研究表明孕激素对子宫肌瘤的生长有重要作用[9]。孕激素通过其受体发生生物学效应。而孕激素受体两种亚型有结构和功能的差异，其分布及比例对孕激素靶器官的生理、病理变化产生不同影响。
3.2 孕激素受体亚型在子宫肌瘤的高表达
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本研究证实hPR在人子宫肌瘤的分布明显高于周围正常肌组织，与文献报道一致[10，11]，支持孕激素在子宫肌瘤发病机制中有重要作用的理论。应用蛋白免疫印迹法，虽然上样时总蛋白量一致，但是化学发光显示的孕激素受体亚型条带的密度在不同患者差别很大，可达1～2个数量级，说明hPR的蛋白表达个体差异很大，本研究将来自同一子宫的肌瘤和正常肌层组织配对比较，排除了个体差异对结果的影响，同时排除了不同激素环境对子宫肌瘤发生、发展的影响，试验结果直接反映肌瘤局部与正常肌层之间的差别。hPR在子宫肌瘤含量较高，说明孕激素对肌瘤局部的生物学效应较对周围正常肌层的作用强，细胞内转录活化作用增强，肌瘤局部增生活跃[10]，可能是子宫肌瘤形成的原因之一。
表2 子宫肌瘤与正常肌层孕激素受体亚型RT-PCR扩增条带密度值(n=22)
Table 2 RT-PCR bands density of hPR isoforms in myoma and normal myometrium(n=22)
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Leiomyoma
Myometrium
Difference
P value
hPR-A
0.863±0.387
0.429±0.302
0.433±0.285
0.00228
hPR-B
0.760±0.303
0.556±0.309
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0.204±0.170
0.0175
hPR-(A+B)
1.622±0.574
0.985±0.473
0.637±0.393
0.00113
hPR-A/hPR-B
1.316±1.059
1.229±1.627
0.787±0.426
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0.837
P(hPR-A vs hPR-B)
0.230
0.138
图3 抗体AB-52的Western印迹
Figure 3 Western blot with monoclonal antibody AB-52 of 100μg
total protein from leiomyoma (3,5,7,9,11) and corresponding
normalmyometrium (4,6,8,10,12),in pairs,from 5 patients
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图4 抗体B-30的Western印迹
Figure 4 Western blot with monoclonal antibody B-30 of 100μg
total protein from leiomyoma (3,5,7,9,11) and corresponding
normal myometrium (4,6,8,10,12),in pairs,from 5 patients
孕激素受体A、B亚型的功能，与孕激素或其类似物结合时，hPR-B比hPR-A转录活化作用强[3，4]；hPR-A对hPR-B介导的类似物转录活化有抑制作用[3]。hPR-A可通过非PR结合DNA的机制，抑制雌激素受体[5]、雄激素受体、糖皮质激素受体和盐皮质激素受体[3]介导的转录作用；hPR-B无此作用[5]。两种孕激素受体亚型可能通过不同机制影响其他转录因子的活性[6]。孕激素受体作为整体，各结构域在执行功能时或协同或抑制[7]。
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雌激素在体内和体外均能引起PR表达增加[8]。雌二醇通过诱导启动子A和启动子B，在转录水平增加hPR两亚型mRNA的数量[1]。另外，雌激素调控具有细胞特异性。雌二醇上调子宫内膜间质细胞A、B亚型的mRNA的表达，并呈剂量依赖性[8]。孕激素上调子宫内膜间质细胞PR蛋白和PR的mRNA的水平(A、B亚型)，并与配体受体结合相关[8]。孕激素下调子宫内膜腺上皮细胞PR和PR的mRNA的水平(A、B亚型)[8]。
图5 组织RNA的RT-PCR产物凝胶电泳
Figure 5 RT-PCR of total RNA extracted from tissues of
leiomyoma (lane 1-4) and corresponding normal myometrium (lane 6-9)
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from one uterus.Lane 5 represents PCR markers
本研究蛋白印迹显示，hPR-B在子宫肌瘤和正常肌层的表达差异无显著性，hPR-A在子宫肌瘤的表达明显高于正常肌层，导致肌瘤总hPR水平增高及hPR-A/hPR-B升高，与文献[10，11]报道一致。雌激素促瘤作用的机制之一是通过子宫局部雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导的转录活化作用，体外试验hPR-B比hPR-A活化转录的作用强[3]。hPR-A可通过非PR结合DNA的机制，抑制ER和hPR-B介导的转录活化作用[3，5]。hPR-A和配体结合后抑制hPR-B和ER的转录活性，为孕激素拮抗剂治疗子宫肌瘤提供了理论依据。
3.3 孕激素受体亚型的mRNA在子宫肌瘤高表达
本研究结果提示，子宫肌瘤的hPR-A与hPR-B亚型的mRNA表达均较周围正常肌层为高，与蛋白表达的差异平行。文献报道Northern印迹法显示9例子宫肌瘤的hPR的mRNA较正常肌层高2～15倍[10]。RNA酶保护性分析发现，11例中两种亚型mRNA表达在子宫肌瘤与周围正常肌层差异无显著性[11]，这种结果的差异可能与病例数的差别、研究方法不同等因素相关，采取扩大样本量，改进试验方法，应用多种方法对同一样本进行研究等措施，将有助于得到比较客观的结果。
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3.4 孕激素受体亚型表达的调控
子宫肌瘤孕激素受体A、B亚型的蛋白和mRNA表达量均较周围正常肌层为高，其机制目前尚未完全明确，可能涉及多种调控因素。
hPR表达受雌激素调控，故hPR高表达可能与雌激素或雌激素受体在子宫分布的变化有关。研究发现,雌激素在大鼠体内和体外人类子宫肌细胞系均能增加PR的表达[12，13]。子宫肌瘤比正常肌层雌二醇含量为高[10]，同时，子宫肌瘤局部的ER含量较高，雌激素的局部生物学效应因而增强，功能性ER的高表达导致PR水平增高[10]。进一步测定子宫肌瘤中ER的表达情况，可对这一机制深入探讨。
孕激素对hPR的表达亦有调控作用。孕激素可以增加子宫内膜间质细胞PR表达，并与配体受体结合相关[8]；孕激素下调子宫内膜腺上皮细胞PR表达[8]；对人乳癌细胞系(T47D,MD-231,MCF-7)和宫颈癌细胞系(HeLa)的研究显示，孕激素负反馈调节PR的mRNA和受体蛋白的表达，孕激素拮抗剂则没有这种作用[14]。本研究发现分泌期子宫肌瘤和正常肌层的hPR-A蛋白表达均较增生期增加，而其mRNA的含量仅在子宫肌瘤组织中有明显升高，可能提示孕激素对子宫肌瘤中的受体上调作用更明显，其作用可能发生在转录后水平。
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本研究中，同一组配对样本中，转录自同一基因的孕激素受体A、B亚型的mRNA，在子宫肌瘤的含量较正常肌层为多，提示子宫肌瘤的发生可能与基因水平或转录水平的异常调控有关。同一组织中，孕激素受体亚型A、B的mRNA和蛋白的比例不平行，表明其转录后水平的调控不同。根据分子生物学的中心法则，任何蛋白质的表达均受到基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平等多个阶段的调控，具体何种机制通过何种方式造成子宫肌瘤的hPR亚型高表达，是深入探讨子宫肌瘤发病机制的关键，有待进一步的研究。
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收稿日期：2000-06-19, http://www.100md.com