少量突变等位基因的定量检测(摘要)
作者：
单位：
关键词：
中华检验医学杂志000628 Kwok PY [Clinical Chemistry(临床化学)，2000，(46)5：593-594]
在野生型DNA序列的背景中检测出少量的突变等位基因，以及在临床标本中定量检测特异的DNA序列，这两者在DNA诊断学中是最具有挑战性的课题。若获成功将显著提高DNA检测的应用价值。例如，基因疾病的产前诊断能通过创伤性手术，如羊膜穿刺术、绒毛膜取样或胎血取样来完成，或也可通过浓缩取自母循环的胎儿细胞来完成。如果有人能在母亲血循环中的少量胎儿细胞中检测到突变的等位基因，那么许多损害性基因疾病产前诊断的实施只需一种简单的非侵入性的血液试验就能完成， 其对母亲或胎儿的危险性都降低到了最低程度。这种“大海捞针”方法的其他应用，包括用于肿瘤早期诊断和了解肿瘤复发的肿瘤标志物检测，以及在大批人群标本中特定的等位基因的检测。同样，在临床标本中检测特异DNA的技术有助于了解艾滋病毒(HIV)阳性患者体内病毒的存在，检测白血病患者中少量残留的病变细胞，以及监测特定基因的表达。
, 百拇医药
本期一组澳大利亚研究者叙述了与解决这两个问题有关的两种颇具前途的方法。在第一篇报道中，Fuery等描述了限制性核酸内切酶选择性PCR(REMS-PCR)，通过此法能在数量超过其1 000多倍的野生型等位基因里检测出一组突变的等位基因。这个想法十分简单，是他们先前所发表论著的一种延伸。如果这种野生型等位基因是热稳定性限制性核酸内切酶(如BstNI)的一个限制性位点的一部分，那么在某些特定条件下，任何来自野生型序列的扩增产物都将被限制性核酸内切酶切割掉，并且不能再作为下一个扩增过程的模板。这样就抑制了野生型等位基因的扩增，而只允许突变的等位基因在PCR中继续扩增，从而得到一种可以用凝胶电泳检测的产物。在第二篇报告中，Todd等描述了用于定量检测特异DNA序列的一种新的常用策略，其方法是基于一种具有切开含RNA报告探针能力的DNA酶的基础上的，即将一种PCR引物特异地添加到一段10-23DNA酶的反义序列中，这样当PCR扩增时，即形成这种活化的DNA酶。一种DNA与RNA嵌合性的报告底物(在其分裂点的对面含有荧光和淬灭剂染色分子)被加入到反应混合液中，此报告底物在PCR扩增期间被当作DNA酶形式劈开。通过荧光-淬灭剂染色分子的分离所释放的荧光变化来监测在实际时间内PCR产物的累计量。在一系列的稀释实验中，Todd等指出DzyNA-PCR法能够从107～1010拷贝数目中精确地分辨出10倍稀释的K-ras。
, 百拇医药
REMS-PCR法操作简单，且有很大的敏感性和稳定性。由于它是一种一开始就将所有试剂都集合在一起的“封闭管”式反应，大大减少了污染的可能性，而且可自动化进行。REMS-PCR法明显的缺点是必需一种能切开野生型等位基因的热稳定性限制性酶。这也许不能用于所用的检测，正因为如此而限制了REMS-PCR法的广泛应用。作者描述了用于鉴别合适的酶的技术。而有了限制性酶的蛋白生产技术，人们就可以预知这种热稳定变异体的产物。
由于有了特性专一的试剂，及DNA酶的能量-转移DNA-RNA杂交体报告底物能适用于任何方法，因此DzyNA-PCR的DNA定量检测法是新颖诱人的。目标专一的特异性试剂含两个PCR引物，其中一个是用反义序列来修饰的DNA 酶。与其他方法相比，这一特点的最大优势就是具有一种封闭式定量分析测定DNA的能力。例如，5′-核苷酸酶反应(TaqMan法)和分子标记都能检测临床标本中的特异DNA序列，并定量检测DNA，但是DzyNA-PCR的DNA定量检测法使用了加入到反应消耗中的目标特异性TaqMan探针和分子标记。然而，没有明显的理由认为不能构造出一种通用的探针或信号，它能在某种程度上起的作用类似于DzyNA-PCR法：只有当扩增出现时，荧光-淬灭染色对才被分开。换言之，如果把一段合成的序列加入到PCR引物中，而这段引物对一种通用的TaqMan探针是互补的，那么只有在扩增出现时，才会出现TaqMan探针的切开。同样地，也可把一段合成的序列加入到PCR引物中，这段引物同一种通用的分子信号的识别序列一样；只有在扩增出现时，互补的序列才会由于分子信号的退火而形成。
, http://www.100md.com
Ivader法采用从archaea分离出的瓣核酸内切酶来识别和切开在两个重叠寡核苷酸杂交成一个目标DNA链时形成的分支结构。DzyNA-PCR法与之相比毫不逊色。等温的Ivader法能被用来直接从基因组DNA中检测特异的DNA序列，无需扩增模板。解离信号的线性放大允许DNA定量使用一种通用的信号探针。
由于许多用于少量突变基因的快速检测和DNA定量的方法是行之有效的，因此临床医生将可以通过寻找肿瘤细胞的DNA标志物、估计病毒血症程度以及使用易于得到的临床标本来实施产前诊断等手段，在日常工作中了解病人的病情。这一天很快就会到来。当这些筛选实验的费用-效果比逐渐变得更有意义时，对于有肿瘤、感染等疾病风险的人群进行肿瘤和感染的监控就有可能实施了。
(收稿日期：2000-09-14), 百拇医药
单位：
关键词：
中华检验医学杂志000628 Kwok PY [Clinical Chemistry(临床化学)，2000，(46)5：593-594]
在野生型DNA序列的背景中检测出少量的突变等位基因，以及在临床标本中定量检测特异的DNA序列，这两者在DNA诊断学中是最具有挑战性的课题。若获成功将显著提高DNA检测的应用价值。例如，基因疾病的产前诊断能通过创伤性手术，如羊膜穿刺术、绒毛膜取样或胎血取样来完成，或也可通过浓缩取自母循环的胎儿细胞来完成。如果有人能在母亲血循环中的少量胎儿细胞中检测到突变的等位基因，那么许多损害性基因疾病产前诊断的实施只需一种简单的非侵入性的血液试验就能完成， 其对母亲或胎儿的危险性都降低到了最低程度。这种“大海捞针”方法的其他应用，包括用于肿瘤早期诊断和了解肿瘤复发的肿瘤标志物检测，以及在大批人群标本中特定的等位基因的检测。同样，在临床标本中检测特异DNA的技术有助于了解艾滋病毒(HIV)阳性患者体内病毒的存在，检测白血病患者中少量残留的病变细胞，以及监测特定基因的表达。
, 百拇医药
本期一组澳大利亚研究者叙述了与解决这两个问题有关的两种颇具前途的方法。在第一篇报道中，Fuery等描述了限制性核酸内切酶选择性PCR(REMS-PCR)，通过此法能在数量超过其1 000多倍的野生型等位基因里检测出一组突变的等位基因。这个想法十分简单，是他们先前所发表论著的一种延伸。如果这种野生型等位基因是热稳定性限制性核酸内切酶(如BstNI)的一个限制性位点的一部分，那么在某些特定条件下，任何来自野生型序列的扩增产物都将被限制性核酸内切酶切割掉，并且不能再作为下一个扩增过程的模板。这样就抑制了野生型等位基因的扩增，而只允许突变的等位基因在PCR中继续扩增，从而得到一种可以用凝胶电泳检测的产物。在第二篇报告中，Todd等描述了用于定量检测特异DNA序列的一种新的常用策略，其方法是基于一种具有切开含RNA报告探针能力的DNA酶的基础上的，即将一种PCR引物特异地添加到一段10-23DNA酶的反义序列中，这样当PCR扩增时，即形成这种活化的DNA酶。一种DNA与RNA嵌合性的报告底物(在其分裂点的对面含有荧光和淬灭剂染色分子)被加入到反应混合液中，此报告底物在PCR扩增期间被当作DNA酶形式劈开。通过荧光-淬灭剂染色分子的分离所释放的荧光变化来监测在实际时间内PCR产物的累计量。在一系列的稀释实验中，Todd等指出DzyNA-PCR法能够从107～1010拷贝数目中精确地分辨出10倍稀释的K-ras。
, 百拇医药
REMS-PCR法操作简单，且有很大的敏感性和稳定性。由于它是一种一开始就将所有试剂都集合在一起的“封闭管”式反应，大大减少了污染的可能性，而且可自动化进行。REMS-PCR法明显的缺点是必需一种能切开野生型等位基因的热稳定性限制性酶。这也许不能用于所用的检测，正因为如此而限制了REMS-PCR法的广泛应用。作者描述了用于鉴别合适的酶的技术。而有了限制性酶的蛋白生产技术，人们就可以预知这种热稳定变异体的产物。
由于有了特性专一的试剂，及DNA酶的能量-转移DNA-RNA杂交体报告底物能适用于任何方法，因此DzyNA-PCR的DNA定量检测法是新颖诱人的。目标专一的特异性试剂含两个PCR引物，其中一个是用反义序列来修饰的DNA 酶。与其他方法相比，这一特点的最大优势就是具有一种封闭式定量分析测定DNA的能力。例如，5′-核苷酸酶反应(TaqMan法)和分子标记都能检测临床标本中的特异DNA序列，并定量检测DNA，但是DzyNA-PCR的DNA定量检测法使用了加入到反应消耗中的目标特异性TaqMan探针和分子标记。然而，没有明显的理由认为不能构造出一种通用的探针或信号，它能在某种程度上起的作用类似于DzyNA-PCR法：只有当扩增出现时，荧光-淬灭染色对才被分开。换言之，如果把一段合成的序列加入到PCR引物中，而这段引物对一种通用的TaqMan探针是互补的，那么只有在扩增出现时，才会出现TaqMan探针的切开。同样地，也可把一段合成的序列加入到PCR引物中，这段引物同一种通用的分子信号的识别序列一样；只有在扩增出现时，互补的序列才会由于分子信号的退火而形成。
, http://www.100md.com
Ivader法采用从archaea分离出的瓣核酸内切酶来识别和切开在两个重叠寡核苷酸杂交成一个目标DNA链时形成的分支结构。DzyNA-PCR法与之相比毫不逊色。等温的Ivader法能被用来直接从基因组DNA中检测特异的DNA序列，无需扩增模板。解离信号的线性放大允许DNA定量使用一种通用的信号探针。
由于许多用于少量突变基因的快速检测和DNA定量的方法是行之有效的，因此临床医生将可以通过寻找肿瘤细胞的DNA标志物、估计病毒血症程度以及使用易于得到的临床标本来实施产前诊断等手段，在日常工作中了解病人的病情。这一天很快就会到来。当这些筛选实验的费用-效果比逐渐变得更有意义时，对于有肿瘤、感染等疾病风险的人群进行肿瘤和感染的监控就有可能实施了。
(收稿日期：2000-09-14), 百拇医药