幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因的克隆表达及免疫原性
作者：郭学青 邹全明
单位：郭学青(解放军第二六六医院 承德，067000)；邹全明(第三军医大学临床微生物学教研室)
关键词：
中华检验医学杂志000620 幽门螺杆菌(Hp)与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃淋巴瘤等关系密切。Hp在我国普遍人群的感染率约50%～80%，可经口传播。如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点。免疫疗法有望成为预防和治疗该类感染性疾病的最有效方法之一[1]。在Hp的免疫防治研究方面，应用细菌的超声粉碎抗原、纯化尿素酶(Ure)、细胞空泡毒素和热休克蛋白(Hsp)等作为抗原免疫动物均取得了较好的免疫预防和治疗效果[2-4]。但由于Hp属微需氧菌，培养条件要求高，难以获得大量天然来源的Ure及Hsp等亚单位成分，我们对Hp重要的保护性抗原hspA基因进行了克隆表达并用于临床检测，现将结果报告如下。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.质粒、菌株及血清来源：质粒PinPointTMXa-3购自Promega公司，E.coli JM109及Hp菌株为本室保存菌种。血清采自西南医院因上消化道症状就诊患者40例。其中男性20例，女性20例，年龄20～76岁，平均46岁。正常人血清采自尿素酶法阴性无消化道症状者20名。
2.酶及试剂：EcoRV、 HindⅢ购自宝灵曼公司，T4连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase、PCR Markers、低分子量标准蛋白Markers购自华美生物工程公司。辣根过氧化物标记的链霉亲和素(S-A/HRP)购自中山生物工程公司，SoftLinkTM亲和树脂购自Promega公司，其他常规试剂为分析纯。
3.质粒的制备：DNA片段分离回收，DNA连接，细菌转化，重组菌的培养条件和诱导及表达产物的SDS-PAGE、免疫印迹分析均按常规方法进行。
, 百拇医药
引物1：5′-CCCAAGCTTATGAAGTTTCAACC-3′
HindⅢ
引物2：5′-GACGATATCTAAATGACAGCGAGCTTC-3′
EcoRⅤ
4.亲和层析纯化：表达产物采用PinPointTMXa纯化系统纯化。将1 000 ml LB培养基制备的菌体离心处理后溶于20 ml pH 7.0的PBS洗中，超声粉碎，8 000 g离心15 min缓缓加样(<1 ml/min)，至少用5×柱床体积的PBS液洗柱，用含5 mmol/L生物素的100 mmol/L PBS缓冲液洗脱。收集，透析以除去游离生物素。
5.酶联免疫吸附试验(ELISA)测定表达产物的活性：以抗血清为一抗，加酶标单抗人抗体稀释液为二抗，上样及免疫显色均按常规方法进行。
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二、结果
1.构建HspA的基因片段与载体PinPointTMXa-3融合表达质粒经酶切分析及序列测定为重组质粒。
2.HspA在JM109中的表达及纯化：重组菌经IPTG诱导后，用PinPointTMXa纯化系统亲和层析柱分离纯化得到可溶性表达的HSPA融合蛋白，纯度在90%以上。
3.应用纯化的融合蛋白HspA，采用ELISA方法检测临床标本40例，8例血清与重组蛋白HspA反应阳性，阳性率20%，20例正常人血清与之无交叉反应。
三、讨论
热休克蛋白是幽门螺杆菌共有的抗原成分。HspA诱发机体产生保护性免疫反应已得到证实[5，6]。近年来对HspA抗原成分的研究受到重视。在本研究中，采用基因工程的方法获得了表达HspA特导性抗原的重组菌株，又经亲和层析纯化获得足量的HspA纯品，用ELISA方法检测的8例阳性标本均为胃溃疡或十二指肠溃疡明确病史十年以上，证实了Perez等HspA血清抗体阳性是Hp长期感染的结论[7]。同时检测非Hp感染患者20例，均为阴性，无非特异性交叉反应。此方法操作简便，一次可完成多份标本的检测，具有无创伤和重复性好的优点，可用作Hp感染的初筛。
, 百拇医药
基金项目：国家“九五”重点科技攻关课题(96-901-01-54)；全军“九五”医药卫生科研基金课题(98D044)
参考文献
1，Chen MH.Chen BL.The prospect and actuality on Helicobacter pylori vaccine. Weichangbingxue,1996,2:32.
2，Michetti P, Crothesy-T heulaz I, Davin C, et al.Immunization of BALB/c mice against Helicobacter felis infection with H. elicobacter pylori urease. Gastroenterology, 1994, 107:1002-1011.
3，Manetti R, Massari P, Burroni D, et al. Helicobacter pylori cytotoxin :importance of native conformation for induction of neutralizing antibodies.Infect Immun, 1995, 11:4476-4480.
, http://www.100md.com
4，Ferrero RL, Thiberge JM, Kansau I, et al. The Groes homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6499-6503.
5，Maarta M, Beatrice A, Daniela B, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori ilnfection that mimics human disease. Sciense,1995,23:267.
6，Ferrero RL.Thiberge I.Kansay I.Immunisation with helicobacter pylori heat-shock protein A(HspA) and urease B (UreB) affords total protection against H felis infection of mice. Gut, 1995, 37 Suppl,1 :51.
7，Perez GI, Thiberge JM, Labigne A, et al. Relationship of immune response to Heat-shock protein A and characteriatics of Helicobacter pylori infected patients. J Infect Dis, 1996，174:1.
(收稿日期：1999-11-30), http://www.100md.com
单位：郭学青(解放军第二六六医院 承德，067000)；邹全明(第三军医大学临床微生物学教研室)
关键词：
中华检验医学杂志000620 幽门螺杆菌(Hp)与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃淋巴瘤等关系密切。Hp在我国普遍人群的感染率约50%～80%，可经口传播。如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点。免疫疗法有望成为预防和治疗该类感染性疾病的最有效方法之一[1]。在Hp的免疫防治研究方面，应用细菌的超声粉碎抗原、纯化尿素酶(Ure)、细胞空泡毒素和热休克蛋白(Hsp)等作为抗原免疫动物均取得了较好的免疫预防和治疗效果[2-4]。但由于Hp属微需氧菌，培养条件要求高，难以获得大量天然来源的Ure及Hsp等亚单位成分，我们对Hp重要的保护性抗原hspA基因进行了克隆表达并用于临床检测，现将结果报告如下。
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一、材料与方法
1.质粒、菌株及血清来源：质粒PinPointTMXa-3购自Promega公司，E.coli JM109及Hp菌株为本室保存菌种。血清采自西南医院因上消化道症状就诊患者40例。其中男性20例，女性20例，年龄20～76岁，平均46岁。正常人血清采自尿素酶法阴性无消化道症状者20名。
2.酶及试剂：EcoRV、 HindⅢ购自宝灵曼公司，T4连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase、PCR Markers、低分子量标准蛋白Markers购自华美生物工程公司。辣根过氧化物标记的链霉亲和素(S-A/HRP)购自中山生物工程公司，SoftLinkTM亲和树脂购自Promega公司，其他常规试剂为分析纯。
3.质粒的制备：DNA片段分离回收，DNA连接，细菌转化，重组菌的培养条件和诱导及表达产物的SDS-PAGE、免疫印迹分析均按常规方法进行。
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引物1：5′-CCCAAGCTTATGAAGTTTCAACC-3′
HindⅢ
引物2：5′-GACGATATCTAAATGACAGCGAGCTTC-3′
EcoRⅤ
4.亲和层析纯化：表达产物采用PinPointTMXa纯化系统纯化。将1 000 ml LB培养基制备的菌体离心处理后溶于20 ml pH 7.0的PBS洗中，超声粉碎，8 000 g离心15 min缓缓加样(<1 ml/min)，至少用5×柱床体积的PBS液洗柱，用含5 mmol/L生物素的100 mmol/L PBS缓冲液洗脱。收集，透析以除去游离生物素。
5.酶联免疫吸附试验(ELISA)测定表达产物的活性：以抗血清为一抗，加酶标单抗人抗体稀释液为二抗，上样及免疫显色均按常规方法进行。
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二、结果
1.构建HspA的基因片段与载体PinPointTMXa-3融合表达质粒经酶切分析及序列测定为重组质粒。
2.HspA在JM109中的表达及纯化：重组菌经IPTG诱导后，用PinPointTMXa纯化系统亲和层析柱分离纯化得到可溶性表达的HSPA融合蛋白，纯度在90%以上。
3.应用纯化的融合蛋白HspA，采用ELISA方法检测临床标本40例，8例血清与重组蛋白HspA反应阳性，阳性率20%，20例正常人血清与之无交叉反应。
三、讨论
热休克蛋白是幽门螺杆菌共有的抗原成分。HspA诱发机体产生保护性免疫反应已得到证实[5，6]。近年来对HspA抗原成分的研究受到重视。在本研究中，采用基因工程的方法获得了表达HspA特导性抗原的重组菌株，又经亲和层析纯化获得足量的HspA纯品，用ELISA方法检测的8例阳性标本均为胃溃疡或十二指肠溃疡明确病史十年以上，证实了Perez等HspA血清抗体阳性是Hp长期感染的结论[7]。同时检测非Hp感染患者20例，均为阴性，无非特异性交叉反应。此方法操作简便，一次可完成多份标本的检测，具有无创伤和重复性好的优点，可用作Hp感染的初筛。
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基金项目：国家“九五”重点科技攻关课题(96-901-01-54)；全军“九五”医药卫生科研基金课题(98D044)
参考文献
1，Chen MH.Chen BL.The prospect and actuality on Helicobacter pylori vaccine. Weichangbingxue,1996,2:32.
2，Michetti P, Crothesy-T heulaz I, Davin C, et al.Immunization of BALB/c mice against Helicobacter felis infection with H. elicobacter pylori urease. Gastroenterology, 1994, 107:1002-1011.
3，Manetti R, Massari P, Burroni D, et al. Helicobacter pylori cytotoxin :importance of native conformation for induction of neutralizing antibodies.Infect Immun, 1995, 11:4476-4480.
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4，Ferrero RL, Thiberge JM, Kansau I, et al. The Groes homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6499-6503.
5，Maarta M, Beatrice A, Daniela B, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori ilnfection that mimics human disease. Sciense,1995,23:267.
6，Ferrero RL.Thiberge I.Kansay I.Immunisation with helicobacter pylori heat-shock protein A(HspA) and urease B (UreB) affords total protection against H felis infection of mice. Gut, 1995, 37 Suppl,1 :51.
7，Perez GI, Thiberge JM, Labigne A, et al. Relationship of immune response to Heat-shock protein A and characteriatics of Helicobacter pylori infected patients. J Infect Dis, 1996，174:1.
(收稿日期：1999-11-30), http://www.100md.com