核酸杂交及聚合酶链反应检测人微小病毒B19感染
作者：张文卿 于红 丁守怡 王笑峰 杨帆 邵济钧 祁秀娟
单位：张文卿 于红 丁守怡 王笑峰 杨帆 邵济钧(青岛大学医学院分子病毒学实验室266021)；杨帆(青岛大学医学院第二附属医院)；祁秀娟(青岛大学医学院附属医院)
关键词：
中华检验医学杂志000617 检测人微小病毒B19(HPV B19)采用聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交等基因诊断技术仍是目前最常用的方法，本研究对两种方法进行了比较。
一、材料与方法
1.标本来源：于青岛大学医学院附属医院及第二附属医院采集26例不明原因自然流产患者的血、宫颈分泌物及流产胎块组织；同期采集20名健康人工流产者的上述标本。
2.试剂：PCR引物参考HPV19全基因序列设计[1]，中国科学院微生物所合成，(K1：ATAAATCCATATACTCATT 2936-2954，K2：CTAAAGTATCCTGACCTTG 3617-3635 699 bp；K3：TTCTTTTCAGCTTTTAGG 3775-3792，K4：TGAATTGCATGGTCTTCATG 3956-3975 200 bp) 。地高辛标记和检测试剂盒为宝灵曼公司产品；PstⅠ及WIZARD PCR产物回收试剂盒等为Promega产品。上海中亚生物试剂公司HPV B19 PCR诊断试剂盒筛选的临床标本作为阳性对照。
, 百拇医药
3.试验方法：(1)PCR方法： 常规酚、氯仿、异戊醇方法抽提组织DNA；血清56℃ 30 min灭活后直接扩增； 宫颈分泌物离心后弃上清液，加裂解液煮沸10 min后，离心取上清液。PCR循环参数为94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃延伸7 min。 (2)核酸杂交：200 bp PCR 产物为模板，按试剂盒说明书标记探针。蜡块切片，脱蜡并多聚甲醛固定，常规方法进行原位杂交。提取的组织DNA点硝酸纤维素膜，常规方法进行斑点杂交。
二、结果
1.分别用引物K1、K2 及K3、K4对46份胎块组织提取的DNA进行PCR扩增，K1、K2 有9份阳性，而K3、K4有10份阳性。经配对χ2检验(χ2=0.33，P>0.05)，差异无显著性，即两对引物检测结果只要1对阳性，即可判断为阳性。
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2.用引物K1、K2对18份配对标本(血清、宫颈分泌物及胎块组织)进行PCR检测，血清阳性5份，分泌物阳性2份，组织阳性9份，仅1份自然流产患者3种标本均为阳性。经配对χ2检验(χ2=9.75，P<0.01)，差异有显著性，组织中检出率最高。
3.组织配对标本16份，分别用斑点杂交(提取DNA )及原位杂交检测，斑点杂交阳性3份，原位杂交阳性4份。原位杂交显示在胎块组织的血管内皮细胞及血管内红细胞上有清晰的杂交信号。同时用风疹病毒感染的BHK-21及巨细胞病毒感染的人胚肺二倍体细胞涂片作对照，均未发现杂交信号，表明此探针具有较高的特异性。
4.46份组织标本PCR检测10份阳性(两对引物)，杂交检测(斑点及原位)4份阳性，其中有6份PCR检测呈阳性，而核酸杂交为阴性，经配对χ2检验(χ2=4.17，P<0.05)，差异有显著性。
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三、讨论
在孕期HPV B19的感染中，病毒血症持续的时间较短，文献报道大约为2个月，但可使胎儿发生先天性感染，垂直传播的机率为30%[2]，病毒在胎儿组织持续的时间可能长于母亲的病毒血症时间，从而导致血清及宫颈分泌物检出率低于胎块组织，因此，在临床诊断中若仅用血清标本，会造成一定程度的漏检。
斑点杂交与组织原位杂交敏感性相近(因例数过少，未作统计)。斑点杂交方法简便、节省试剂、一次可做大量标本。原位杂交操作较复杂，试剂需要量大，但可进行组织内定位，并且阳性及阴性标本反差大，结果易于判断。文献报道， B19 DNA仅存在于胎儿各器官血管内的红系前体细胞核内，而在其他细胞内没有检测到病毒，并据此认为，红系前体细胞是B19病毒复制增殖的宿主细胞， 因此前期大量的体外分离培养研究是在骨髓及胎肝红细胞上进行[3]。本研究表明，在其血管内皮细胞上也可见清晰的杂交信号，提示血管内皮细胞可作为其宿主细胞。由于血管内皮细胞可体外培养传代，为分离培养该病毒提供了一条新的探索途径。
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基金项目：本课题受青岛市科委基金资助(9485G170117)
参考文献
1，Shade RO, Blundell MC, Cotmore SF, et al. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of a child during aplastic crisis. J Virol, 1986, 58:921-936.
2，van Gessel PH, Wildschut HI, Cohen-Overbeek TE, et al. [Parvovirus B19 infection in pregnancy: a cause of non-immune hydrops fetalis]. Ned Tijdschr Geneeskd, 1999, 143: 3-7.
3，Hassam S, Briner J, Tratschin JD, et al. In situ hybridization for detection of human parvovirus B19 nucleic acid sequences in paraffin-embedded specimens. Virchows Arch B Cell Psthol Ind Mol Pathol, 1990, 59:257-261.
(收稿日期：2000-01-31), http://www.100md.com
单位：张文卿 于红 丁守怡 王笑峰 杨帆 邵济钧(青岛大学医学院分子病毒学实验室266021)；杨帆(青岛大学医学院第二附属医院)；祁秀娟(青岛大学医学院附属医院)
关键词：
中华检验医学杂志000617 检测人微小病毒B19(HPV B19)采用聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交等基因诊断技术仍是目前最常用的方法，本研究对两种方法进行了比较。
一、材料与方法
1.标本来源：于青岛大学医学院附属医院及第二附属医院采集26例不明原因自然流产患者的血、宫颈分泌物及流产胎块组织；同期采集20名健康人工流产者的上述标本。
2.试剂：PCR引物参考HPV19全基因序列设计[1]，中国科学院微生物所合成，(K1：ATAAATCCATATACTCATT 2936-2954，K2：CTAAAGTATCCTGACCTTG 3617-3635 699 bp；K3：TTCTTTTCAGCTTTTAGG 3775-3792，K4：TGAATTGCATGGTCTTCATG 3956-3975 200 bp) 。地高辛标记和检测试剂盒为宝灵曼公司产品；PstⅠ及WIZARD PCR产物回收试剂盒等为Promega产品。上海中亚生物试剂公司HPV B19 PCR诊断试剂盒筛选的临床标本作为阳性对照。
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3.试验方法：(1)PCR方法： 常规酚、氯仿、异戊醇方法抽提组织DNA；血清56℃ 30 min灭活后直接扩增； 宫颈分泌物离心后弃上清液，加裂解液煮沸10 min后，离心取上清液。PCR循环参数为94℃ 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃延伸7 min。 (2)核酸杂交：200 bp PCR 产物为模板，按试剂盒说明书标记探针。蜡块切片，脱蜡并多聚甲醛固定，常规方法进行原位杂交。提取的组织DNA点硝酸纤维素膜，常规方法进行斑点杂交。
二、结果
1.分别用引物K1、K2 及K3、K4对46份胎块组织提取的DNA进行PCR扩增，K1、K2 有9份阳性，而K3、K4有10份阳性。经配对χ2检验(χ2=0.33，P>0.05)，差异无显著性，即两对引物检测结果只要1对阳性，即可判断为阳性。
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2.用引物K1、K2对18份配对标本(血清、宫颈分泌物及胎块组织)进行PCR检测，血清阳性5份，分泌物阳性2份，组织阳性9份，仅1份自然流产患者3种标本均为阳性。经配对χ2检验(χ2=9.75，P<0.01)，差异有显著性，组织中检出率最高。
3.组织配对标本16份，分别用斑点杂交(提取DNA )及原位杂交检测，斑点杂交阳性3份，原位杂交阳性4份。原位杂交显示在胎块组织的血管内皮细胞及血管内红细胞上有清晰的杂交信号。同时用风疹病毒感染的BHK-21及巨细胞病毒感染的人胚肺二倍体细胞涂片作对照，均未发现杂交信号，表明此探针具有较高的特异性。
4.46份组织标本PCR检测10份阳性(两对引物)，杂交检测(斑点及原位)4份阳性，其中有6份PCR检测呈阳性，而核酸杂交为阴性，经配对χ2检验(χ2=4.17，P<0.05)，差异有显著性。
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三、讨论
在孕期HPV B19的感染中，病毒血症持续的时间较短，文献报道大约为2个月，但可使胎儿发生先天性感染，垂直传播的机率为30%[2]，病毒在胎儿组织持续的时间可能长于母亲的病毒血症时间，从而导致血清及宫颈分泌物检出率低于胎块组织，因此，在临床诊断中若仅用血清标本，会造成一定程度的漏检。
斑点杂交与组织原位杂交敏感性相近(因例数过少，未作统计)。斑点杂交方法简便、节省试剂、一次可做大量标本。原位杂交操作较复杂，试剂需要量大，但可进行组织内定位，并且阳性及阴性标本反差大，结果易于判断。文献报道， B19 DNA仅存在于胎儿各器官血管内的红系前体细胞核内，而在其他细胞内没有检测到病毒，并据此认为，红系前体细胞是B19病毒复制增殖的宿主细胞， 因此前期大量的体外分离培养研究是在骨髓及胎肝红细胞上进行[3]。本研究表明，在其血管内皮细胞上也可见清晰的杂交信号，提示血管内皮细胞可作为其宿主细胞。由于血管内皮细胞可体外培养传代，为分离培养该病毒提供了一条新的探索途径。
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基金项目：本课题受青岛市科委基金资助(9485G170117)
参考文献
1，Shade RO, Blundell MC, Cotmore SF, et al. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of a child during aplastic crisis. J Virol, 1986, 58:921-936.
2，van Gessel PH, Wildschut HI, Cohen-Overbeek TE, et al. [Parvovirus B19 infection in pregnancy: a cause of non-immune hydrops fetalis]. Ned Tijdschr Geneeskd, 1999, 143: 3-7.
3，Hassam S, Briner J, Tratschin JD, et al. In situ hybridization for detection of human parvovirus B19 nucleic acid sequences in paraffin-embedded specimens. Virchows Arch B Cell Psthol Ind Mol Pathol, 1990, 59:257-261.
(收稿日期：2000-01-31), http://www.100md.com