尿融合细胞内病毒G区基因的原位杂交
作者：邵丽华 马立宪 王刚 辛崇尚 徐皖苏
单位：邵丽华 马立宪 王刚 辛崇尚(山东医科大学公共卫生学院 济南，250012)；徐皖苏(济南市传染病医院)
关键词：
中华检验医学杂志000616 有研究发现，肾综合征出血热(HFRS)患者尿液中融合细胞(FC)与汉坦病毒(HFRS，HV)感染有关，但细胞融合的确切机制尚不完全清楚。日本学者体外研究提示，G1、G2具有血凝活性和低pH 依赖性致细胞融合特性。这为HFRS病毒导致患者尿细胞融合提供了依据。我们设计针对病毒M片段G基因区的探针，地高辛素标记，运用核酸原位杂交技术检测靶基因RNA 和mRNA在尿融合细胞中的定位，研究其与病毒糖蛋白表达的对应关系。
一、材料
1.单克隆抗体(单抗)-LV48A为抗G2抗体，单抗-3D8为特异性抗HFRS病毒血凝素抗体。
, 百拇医药
2.生物素标记马抗鼠IgG、正常马血清、辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素蛋白、血清白蛋白(BSA)和胎牛血清。
3.HFRS患者恢复期血清采自住院HFRS患者。
4.核糖核酸酶(RNase)，为Calbiochem产品。
5.探针合成，参照文献[2]中的病毒M片段G1基因区核苷酸序列，采用5′-端标记地高辛素(Dig-)，吸光度(A)值为0.7。由于HFRS病毒属于负性单链RNA病毒，因而探针A8(5′-GTGAGGGGCAAGGCAGCCAGAATCATTTGAAGCAGTGT-CTGCTGAAGTTGA-3′ 51mers)为正链，主要针对G区靶RNA；A9(5′-GGACACTTTGGTCTGGACCAAACATTTTCCTTCGATCA-GACCCCTGTCATCA-3′ 52mers)为负链，针对G区靶mRNA。
, 百拇医药
二、方法
1.HFRS患者按1986年全国专题学术会议制订的诊断标准确诊。 融合细胞检查见参考文献[3]。器皿、试剂按常规去RNA酶处理及玻片镀膜，见参考文献[4]。链霉抗生物素蛋白免疫组化(SABC)按常规进行。
2.病毒RNA核酸原位杂交[4]：取标本20 μl，涂于经粘片剂(APES)处理的玻片上，分别标记D、E、F区域。D区探针A8；E区探针A9；F区作阴性对照，用预杂交液(不用探针)。杂交并显色。
3.对照设计：细胞对照：正常Vero E6细胞片2张，为乙型肝炎病人外周血单核细胞。探针对照：预杂交液替代探针。RNase预处理：标本经RNase 100 μg/L 37℃作用4 h，消化掉细胞内的RNA。血清对照：正常BALB/c小鼠血清替代单抗作为第一抗体。封闭试验：先用HFRS患者恢复期血清与样本滴片37℃作用1 h，用PBS洗3次后加酶标多价单抗。上述对照与实验样本同时用同样方法检测。
, http://www.100md.com
三、结果
1.HFRS病毒结构蛋白在患者尿融合细胞中的表达定位：融合细胞大多由4～10个细胞融合而成，多者可达数10个。细胞间隙不清，界限消失，彼此融合在一起形成多核的巨细胞体。用LV48A定位发现HFRS病毒 G2蛋白表达在宿主细胞膜处更为明显，可见浓密的棕色颗粒。3D8定位发现血凝素的表达也是主要在宿主细胞膜上。
2.HFRS患者尿液pH平均值：HFRS患者尿液检测437例次，pH5.7±0.7(均数±标准差)。有认为这种偏酸性环境正是促使融合蛋白构象变化的最佳pH范围。
3.病毒核酸原位杂交结果：融合细胞内HFRS病毒核酸RNA靶基因经原位杂交发现，阳性产物呈棕黄色颗粒状，存在于细胞核或胞浆内。根据定位，可分为核型、核浆混合型。核酸原位杂交(ISH)10例阳性者中，有9例属于核型，1例为核浆混合型。15例患者尿融合细胞内病毒核酸原位杂交阳性者10例；链蛋白抗生物素复合物免疫组化检测阳性者11例。两者均阳性者10例；均阴性者4例。
, 百拇医药
4.A8探针与A9探针的检测结果: 15例患者中，A8探针与A9探针共有10例阳性，两者均阳性者9例；均阴性者5例。A8有8例核型，1例核浆混合型；A9有9例核型，1例浆型。其靶基因定位无明显差别。
5.对照检查：对照组检测结果均阴性。
四、讨论
我们观察到HFRS病毒结构蛋白表达定位与病毒编码该蛋白的RNA、mRNA细胞内定位相一致的情况，提示靶细胞融合与HFRS病毒糖蛋白基因及其表达密切相关。经437例次HFRS患者尿液pH检查，发现pH均数±标准差是5.7±0.7，有学者认为，这种偏酸性环境为病毒导致细胞融合提供了合适的条件。
基金项目：山东省医药卫生九五重点科技攻关项目(编号：9503)资助
参考文献
1，孙永涛，白雪帆，杨为松，等. 汉坦病毒的基因分型及其序列分析. 中国病毒学，1996, 11:319-324.
2，马立宪, 邵丽华，赵丽，等. 肾综合征出血热病毒结构蛋白在患者尿液中融合细胞上的表达及其意义. 中华微生物学和免疫学杂志，1997，17:99-101.
3，路建平,主编. 非放射性杂交技术. 海口：南海出版公司， 1996.66-73.
(收稿日期：2000-03-17), 百拇医药
单位：邵丽华 马立宪 王刚 辛崇尚(山东医科大学公共卫生学院 济南，250012)；徐皖苏(济南市传染病医院)
关键词：
中华检验医学杂志000616 有研究发现，肾综合征出血热(HFRS)患者尿液中融合细胞(FC)与汉坦病毒(HFRS，HV)感染有关，但细胞融合的确切机制尚不完全清楚。日本学者体外研究提示，G1、G2具有血凝活性和低pH 依赖性致细胞融合特性。这为HFRS病毒导致患者尿细胞融合提供了依据。我们设计针对病毒M片段G基因区的探针，地高辛素标记，运用核酸原位杂交技术检测靶基因RNA 和mRNA在尿融合细胞中的定位，研究其与病毒糖蛋白表达的对应关系。
一、材料
1.单克隆抗体(单抗)-LV48A为抗G2抗体，单抗-3D8为特异性抗HFRS病毒血凝素抗体。
, 百拇医药
2.生物素标记马抗鼠IgG、正常马血清、辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素蛋白、血清白蛋白(BSA)和胎牛血清。
3.HFRS患者恢复期血清采自住院HFRS患者。
4.核糖核酸酶(RNase)，为Calbiochem产品。
5.探针合成，参照文献[2]中的病毒M片段G1基因区核苷酸序列，采用5′-端标记地高辛素(Dig-)，吸光度(A)值为0.7。由于HFRS病毒属于负性单链RNA病毒，因而探针A8(5′-GTGAGGGGCAAGGCAGCCAGAATCATTTGAAGCAGTGT-CTGCTGAAGTTGA-3′ 51mers)为正链，主要针对G区靶RNA；A9(5′-GGACACTTTGGTCTGGACCAAACATTTTCCTTCGATCA-GACCCCTGTCATCA-3′ 52mers)为负链，针对G区靶mRNA。
, 百拇医药
二、方法
1.HFRS患者按1986年全国专题学术会议制订的诊断标准确诊。 融合细胞检查见参考文献[3]。器皿、试剂按常规去RNA酶处理及玻片镀膜，见参考文献[4]。链霉抗生物素蛋白免疫组化(SABC)按常规进行。
2.病毒RNA核酸原位杂交[4]：取标本20 μl，涂于经粘片剂(APES)处理的玻片上，分别标记D、E、F区域。D区探针A8；E区探针A9；F区作阴性对照，用预杂交液(不用探针)。杂交并显色。
3.对照设计：细胞对照：正常Vero E6细胞片2张，为乙型肝炎病人外周血单核细胞。探针对照：预杂交液替代探针。RNase预处理：标本经RNase 100 μg/L 37℃作用4 h，消化掉细胞内的RNA。血清对照：正常BALB/c小鼠血清替代单抗作为第一抗体。封闭试验：先用HFRS患者恢复期血清与样本滴片37℃作用1 h，用PBS洗3次后加酶标多价单抗。上述对照与实验样本同时用同样方法检测。
, http://www.100md.com
三、结果
1.HFRS病毒结构蛋白在患者尿融合细胞中的表达定位：融合细胞大多由4～10个细胞融合而成，多者可达数10个。细胞间隙不清，界限消失，彼此融合在一起形成多核的巨细胞体。用LV48A定位发现HFRS病毒 G2蛋白表达在宿主细胞膜处更为明显，可见浓密的棕色颗粒。3D8定位发现血凝素的表达也是主要在宿主细胞膜上。
2.HFRS患者尿液pH平均值：HFRS患者尿液检测437例次，pH5.7±0.7(均数±标准差)。有认为这种偏酸性环境正是促使融合蛋白构象变化的最佳pH范围。
3.病毒核酸原位杂交结果：融合细胞内HFRS病毒核酸RNA靶基因经原位杂交发现，阳性产物呈棕黄色颗粒状，存在于细胞核或胞浆内。根据定位，可分为核型、核浆混合型。核酸原位杂交(ISH)10例阳性者中，有9例属于核型，1例为核浆混合型。15例患者尿融合细胞内病毒核酸原位杂交阳性者10例；链蛋白抗生物素复合物免疫组化检测阳性者11例。两者均阳性者10例；均阴性者4例。
, 百拇医药
4.A8探针与A9探针的检测结果: 15例患者中，A8探针与A9探针共有10例阳性，两者均阳性者9例；均阴性者5例。A8有8例核型，1例核浆混合型；A9有9例核型，1例浆型。其靶基因定位无明显差别。
5.对照检查：对照组检测结果均阴性。
四、讨论
我们观察到HFRS病毒结构蛋白表达定位与病毒编码该蛋白的RNA、mRNA细胞内定位相一致的情况，提示靶细胞融合与HFRS病毒糖蛋白基因及其表达密切相关。经437例次HFRS患者尿液pH检查，发现pH均数±标准差是5.7±0.7，有学者认为，这种偏酸性环境为病毒导致细胞融合提供了合适的条件。
基金项目：山东省医药卫生九五重点科技攻关项目(编号：9503)资助
参考文献
1，孙永涛，白雪帆，杨为松，等. 汉坦病毒的基因分型及其序列分析. 中国病毒学，1996, 11:319-324.
2，马立宪, 邵丽华，赵丽，等. 肾综合征出血热病毒结构蛋白在患者尿液中融合细胞上的表达及其意义. 中华微生物学和免疫学杂志，1997，17:99-101.
3，路建平,主编. 非放射性杂交技术. 海口：南海出版公司， 1996.66-73.
(收稿日期：2000-03-17), 百拇医药