聚合酶链反应微孔板杂交法检测解脲脲原体及药敏分析
作者：赵晓涛 张正
单位：北京大学人民医院检验科 100044
关键词：解脲脲原体；聚合酶链反应；抗药性；微生物
中华检验医学杂志000610 【摘要】 目的 建立敏感、特异的聚合酶链反应-微孔板杂交法(PCR-MPH)检测解脲脲原体(Uu)的感染，并分析药敏情况。方法 将带有生物素标记的Uu的聚合酶链反应产物结合在链霉亲和素包被的微孔板上，与标记地高辛的探针进行杂交后，通过标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)与杂交分子进行反应，最终经底物显色后读数；同时应用生物梅里埃公司支原体培养试剂盒(IST)进行了Uu的培养及药敏试验。结果 通过优化多种试验条件建立了PCR-MPH法检测Uu，并分析了不同人群158份标本，其中微孔板杂交法阳性65份，培养法阳性56份；药敏结果显示，敏感率原始霉素100%、交沙霉素96.6%、强力霉素89.7%、四环素79.3%、氧氟沙星34.5%、红霉素6.9%。结论PCR-MPH法采用非放射性标记，具有无污染、经济、自动读数等优点，可以敏感、特异地检测Uu的感染；Uu对原始霉素、交沙霉素、强力霉素较敏感，对红霉素耐药。
, 百拇医药
Detection of ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction-microplate hybridization and anti-Uu susceptibility test
ZHAO Xiaotao ZHANG Zheng
(Department of Clinical Laboratory, People′s Hospital, Peking University, Beijing 100044, China)
【Abstract】 Objectives To establish a sensitive and special method for the detection of Ureaplasma urealyticum(Uu) using PCR-microplate hybridization (PCR-MPH). Methods A primer of ureasea gene was labeled by biotin. The amplification product was captured on streptavidin-coated microplates, then products were quantified by hybridization with a digoxigenin-labeled internal oligonucleotide probe. After revelation with an anti-digoxigenin alkaline phosphatase coupled antibody(anti-DIG-AP), the amount was determined by optical reading. At the same time, PCR-MPH was compared with Bio-Merieux Mycosplasma-IST. Results A method of PCR-MPH for detecting Uu DNA was established. The morbidity among three groups for detecting 158 clinical samples was analysed. 65 were detected by PCR-MPH and 56 by culture.Conclusion The results showed that this assay is rapid, sensitive, specific, and accurate, and is of value in clinical therapy.
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【Key words】 Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction; Drug resistance, microbial
解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，Uu)作为人类致病微生物，可引起一系列泌尿生殖道感染、性传播疾病，并日益受到人们的重视，尤其他与不育症、孕妇感染及其导致的母婴传播有密切相关性[1]。目前实验诊断方法各具优缺点，传统的分离培养法对标本采集、培养条件均要求较高；血清学诊断方法不能作为现症感染的主要依据；经典的分子杂交法操作繁琐、有放射性污染；聚合酶链反应(PCR)操作简便，但常规的电泳法判断结果主观性强、敏感性低，存在溴化乙啶污染、非特异条带的影响。为此我们建立了PCR-微孔板杂交法(PCR-MPH)。
材料和方法
一、材料
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1.标本来源：48份阴性对照标本取自北京市海淀区妇幼保健医院婚检中心；40份孕妇宫颈拭子取自本院产科门诊；118份患者标本(包括泌尿生殖系统感染88份及男性不育症者精液标本30份)取自北京市东直门外医院性生殖专科门诊及本院泌尿科门诊。
2.标准株来源：Uu1～14血清型标准株由军事医学科学院微生物研究室提供；UuT 960标准株、肺炎支原体标准株、人型支原体标准株、生殖支原体标准株由首都儿科研究所提供。
3.引物及寡核苷酸探针：上游引物U5：5′-CAATCTGCT-CGTGAAGTATTAC- 3′(328～349)；下游引物U4：5′- ACGACGTCCATAAGCAACT -3′(739～757)，5′端标记生物素；探针U9：5′-GAGATAATG-ATTATATGTC AGGATCA- 3′(500～525)，3′端标记地高辛。序列均经Gene Bank验证，由CyberSyn公司合成。
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4.主要试剂及仪器：Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，dNTPs法玛西亚公司产品，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)购自宝灵曼公司。支原体培养试剂盒(IST)为生物-梅里埃公司产品。DNA扩增仪为PE公司产品，酶标板为丹麦Nunc公司产品。
二、方法
1.标本的采集与保存：宫颈拭子、男性尿道拭子，均取2份标本，1份于生物-梅里埃支原体IST培养，另1份置于1.5 ml无菌生理盐水中，充分挤压、振荡后弃去，-20℃保存。精液、前列腺液标本直接留取后取200 μl培养，其余-20℃保存。
2.支原体培养及药敏试验：按试剂盒操作说明进行，置35～37℃培养。24～48 h观察颜色变化，24 h相应的小孔由黄变红或橙色提示Uu生长，48 h相应的小孔由黄变红或橙色提示生殖支原体(Mh)生长；72 h仍不变色者为阴性，变混浊可能为杂菌污染。同时观察药敏结果，有强力霉素、交沙霉素、氧氟沙星、红霉素、四环素、原始霉素6种抗生素共11个药敏孔(除原始霉素为1个浓度外其余均为高低2个不同浓度)，相应的药敏孔由黄变红提示耐药，变为橙色提示中介度，仍为黄色提示敏感。
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3.DNA模板制备：用蛋白酶K消化后用经典的酚、氯仿抽提。
4.PCR扩增：扩增总体系为25 μl，其中模板5 μl，引物均为0.4 μmol/L，dNTP均为0.2 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L pH8.3，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1.5 U。循环条件为95℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环。分别取PCR产物进行2%琼脂糖电泳及微孔板杂交检测。扩增片段为429 bp。
5.微孔板杂交法检测PCR产物：(1)包被微孔板：将链酶亲和素以5 mg/L的浓度100 μl/孔包被微孔板，4℃过夜。加入封闭剂(0.01 mol/L PBS pH7.4，3% BSA)200 μl/孔，4℃过夜。(2)产物的捕获及变性：取PCR产物1∶10稀释后以100 μl/孔加入微孔板中，37℃ 1 h后用洗液(10 mmol/L Tris-HCl pH7.5、0.05%吐温-20)洗板，加入150 mmol/L的NaOH溶液100 μl，室温15 min，洗板。(3)杂交反应：加入含地高辛标记探针10 pmol/孔的杂交液(50%去离子甲酰胺、5×SSC、1×FPG、25 mmol/L磷酸盐、2 g/L SDS、50 g/L硫酸葡聚糖)100 μl/孔进行杂交反应,37℃ 45 min。(4)酶显色：洗板后加入1∶2 000稀释的Anti-DIG-AP 100 μl/孔(酶稀释液为100 mmol/L Tris-HCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、10 g/L BSA)，37℃ 45 min。充分洗板后加入底物(PNPP 10 g溶于10 ml蒸馏水、87 μl二乙醇胺、加入5 μl 1 mol/L MgCl2使终浓度为0.5 mmol/L)100 μl/孔，37℃避光显色，2 mol/L NaOH 50 μl终止反应，酶标仪405 nm波长测吸光度A值。
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结果
1.杂交特异性试验：Uu14个血清型的扩增产物均与U9探针发生特异性杂交，而肺炎支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体及淋病奈瑟菌均为阴性。
2.杂交敏感性试验：分别取相当于0、1、1×101、5×101、1×102、5×102、1×103、1×104 CCU/ml(CCU，颜色改变单位)的Uu菌液为模板PCR后进行MPH，与2%琼脂糖电泳比较两者的敏感性(表1)。
表1 不同模板浓度的杂交及电泳结果比较 模板浓度
(CCU/ml)
A值
, 百拇医药 结果
模板浓度
(CCU/ml)
A值
结果
1×104
0.725
++
5×10
0.313
±
1×103
0.614
, 百拇医药
++
1×10
0.111
-
5×102
0.543
+
1
0.058
-
1×102
0.431
+
, 百拇医药
0
0.012
-
3.对照人群Uu的PCR-MPH测定：取经婚检筛查无泌尿生殖道炎症的健康未婚的男性尿道拭子、女性分泌物共48份标本进行PCR-MPH，结果显示，其A值均值为0.056，标准差(s)为0.0172，因而依照阴性对照+4s确定MPH试验的cut off值为阴性对照+0.07。
4.批内与批间重复性分析：阳性对照批内CV值为5.4%，批间CV值为13.9%，阴性对照批内CV值为4.4%，批间CV值为10.4%。
5.利用PCR-MPH法与培养法对临床158份标本进行Uu检测(表2)。
6.分析孕妇、泌尿生殖道感染及男性不育症3组人群的Uu阳性结果(表3)。
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7.药敏结果：原始霉素、交沙霉素、强力霉素、四环素、氧氟沙星、红霉素，敏感率分别为100%、96.6%、89.7%、79.3%、34.5%及6.9%。表2 PCR-MPH阳性结果与培养的比较(份数) 培养
PCR-MPH
合计
阳性
阴性
阳性
51
5
56
阴性
14
, 百拇医药
88
102
合计
65
93
158
表3 不同人群Uu阳性率(%) 人群
例数
Uu阳性例数
Uu阳性率
培养法
PCR-MPH
培养法
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PCR-MPH
孕妇
40
12
16
30.0
40.0
泌尿生殖系统
感染者
88
35
41
39.8
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46.6
男性不育症
30
9
8
30.0
26.7
讨论
自1954年由Shepard首次从非淋菌性尿道炎(NGU)患者标本中分离出Uu至今，Uu感染日益受到人们的重视[1]。我们选用了Uu脲酶基因序列引物可对Uu的14个血清型进行扩增，选用其内部寡核苷酸序列作为特异性探针与之杂交。PCR-MPH的前提条件是较好的PCR扩增效果，所以在试验过程中，首先优化了多种PCR试验条件，然后又对杂交过程进行优化。采用地高辛标记的探针进行特异性杂交，避免了非特异条带对判断电泳结果的影响[2]。同时其敏感性可达10CFU/ml，而电泳只能观察到50～100CFU/ml，敏感性提高5～10倍。与文献报道PCR-MPH较PCR电泳法敏感10倍基本一致。
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对158份临床标本的检测结果显示，PCR-MPH与传统的培养法相比，两者有较好的符合率。对于5份培养为阳性而PCR-MPH为阴性的标本，其中2份用生物梅里埃培养基鉴定为人型支原体，考虑人型支原体生长造成对Uu培养结果判断的干扰；另外3份用培养液重复PCR-MPH后，其结果为阳性，考虑是否标本中存在扩增的抑制物。对14份培养为阴性而PCR-MPH为阳性的标本，重复3次试验仍为阳性。考虑由于培养法的敏感性低，仅可检测出大于103～104 CCU/ml的菌液，或由于标本运送、保存的影响使培养结果为阴性。但结合患者病史、临床症状以及形态学检查仍考虑为Uu感染。
由于PCR-MPH法结合了PCR的高敏感性、杂交的特异性、酶标仪读取结果的客观性等优点，而被逐步应用，并可提高检出率、增强特异性，同时能一次检测大量标本。由于标记方法、物质、酶的不同，而相继建立多种方式的PCR-MPH法。我们采用将带有生物素标记的PCR产物包被在包有链霉亲和素的微孔板上，由于生物素-链霉亲和素的强大的、稳定的亲和能力以及PCR的高度扩增效率，可以尽可能多的将目的DNA结合在微孔板上。
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分析3组人群Uu阳性率显示泌尿生殖系统感染组最高(46.6%)，与文献报道一致。在孕妇中Uu的阳性率，国外报道为50%～70%，国内报道达73.2%。由于Uu携带率与多种因素有关，并且受检测方法影响，所以检出率会有所不同，即使在“同一”人群中。我们将继续追踪其对胎儿、新生儿的影响。
药敏结果显示，Uu对所列抗生素的敏感程度与国内报道相似[3，4]。Uu对目前临床治疗常用的红霉素显示了很高的耐药性(可能与耐药基因tetM相关)[5]，同时在反复Uu感染的病例中，出现了多种抗生素同时耐药的情况，应该引起临床治疗方面的关注。
大量的临床检测结果对目前临床诊断、治疗提供了一定的参考价值。这一方法能够反映现症感染情况，将来可进一步控制多种实验条件实现真正意义上的定量检测[6]。
志谢 东直门外医院曹兴午、杨文质、姜梅等老师对收集标本工作的大力协助
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参考文献
1，Yoon BH, Chang JW, Romero R. Isolation of Ureaplasma urealyticum from the amniotic cavity and adverse outcome in preterm labor. Obstet Gynecol, 1998, 92:77-82.
2，张正. 聚合酶链式反应定量技术在微生物检测中的应用. 中华医学检验杂志，1999，22:22-24.
3，楮云卓，年华，贾桂英，等. 解脲脲原体药敏试验结果分析. 中华检验医学杂志，2000，23:43.
4，Clegg A, Passey M, Yoannes M, et al. High rates of genital mycoplasma infection in the highlands of papua New Guinea determined both by culture and by a commercial detection kit. J Clin Microbiol， 1997,35:197-200.
, 百拇医药
5，de Barbeyrac B, Dupon M, Rodriguez P, et al. A Tn1545-like transposon carries the tet (M) gene in tetracycline resistant strains of Bacteroides ureolyticus as well as Ureaplasma urealyticum but not Neisseria gonorrhoeae. J Antimicrob Chemother, 1996,37:223-232.
6，何蕴韶. 聚合酶链式反应技术在医学检验中的应用和展望. 中华医学检验杂志，1999，22:133-134.
(收稿日期：2000-04-26), 百拇医药
单位：北京大学人民医院检验科 100044
关键词：解脲脲原体；聚合酶链反应；抗药性；微生物
中华检验医学杂志000610 【摘要】 目的 建立敏感、特异的聚合酶链反应-微孔板杂交法(PCR-MPH)检测解脲脲原体(Uu)的感染，并分析药敏情况。方法 将带有生物素标记的Uu的聚合酶链反应产物结合在链霉亲和素包被的微孔板上，与标记地高辛的探针进行杂交后，通过标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)与杂交分子进行反应，最终经底物显色后读数；同时应用生物梅里埃公司支原体培养试剂盒(IST)进行了Uu的培养及药敏试验。结果 通过优化多种试验条件建立了PCR-MPH法检测Uu，并分析了不同人群158份标本，其中微孔板杂交法阳性65份，培养法阳性56份；药敏结果显示，敏感率原始霉素100%、交沙霉素96.6%、强力霉素89.7%、四环素79.3%、氧氟沙星34.5%、红霉素6.9%。结论PCR-MPH法采用非放射性标记，具有无污染、经济、自动读数等优点，可以敏感、特异地检测Uu的感染；Uu对原始霉素、交沙霉素、强力霉素较敏感，对红霉素耐药。
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Detection of ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction-microplate hybridization and anti-Uu susceptibility test
ZHAO Xiaotao ZHANG Zheng
(Department of Clinical Laboratory, People′s Hospital, Peking University, Beijing 100044, China)
【Abstract】 Objectives To establish a sensitive and special method for the detection of Ureaplasma urealyticum(Uu) using PCR-microplate hybridization (PCR-MPH). Methods A primer of ureasea gene was labeled by biotin. The amplification product was captured on streptavidin-coated microplates, then products were quantified by hybridization with a digoxigenin-labeled internal oligonucleotide probe. After revelation with an anti-digoxigenin alkaline phosphatase coupled antibody(anti-DIG-AP), the amount was determined by optical reading. At the same time, PCR-MPH was compared with Bio-Merieux Mycosplasma-IST. Results A method of PCR-MPH for detecting Uu DNA was established. The morbidity among three groups for detecting 158 clinical samples was analysed. 65 were detected by PCR-MPH and 56 by culture.Conclusion The results showed that this assay is rapid, sensitive, specific, and accurate, and is of value in clinical therapy.
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【Key words】 Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction; Drug resistance, microbial
解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，Uu)作为人类致病微生物，可引起一系列泌尿生殖道感染、性传播疾病，并日益受到人们的重视，尤其他与不育症、孕妇感染及其导致的母婴传播有密切相关性[1]。目前实验诊断方法各具优缺点，传统的分离培养法对标本采集、培养条件均要求较高；血清学诊断方法不能作为现症感染的主要依据；经典的分子杂交法操作繁琐、有放射性污染；聚合酶链反应(PCR)操作简便，但常规的电泳法判断结果主观性强、敏感性低，存在溴化乙啶污染、非特异条带的影响。为此我们建立了PCR-微孔板杂交法(PCR-MPH)。
材料和方法
一、材料
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1.标本来源：48份阴性对照标本取自北京市海淀区妇幼保健医院婚检中心；40份孕妇宫颈拭子取自本院产科门诊；118份患者标本(包括泌尿生殖系统感染88份及男性不育症者精液标本30份)取自北京市东直门外医院性生殖专科门诊及本院泌尿科门诊。
2.标准株来源：Uu1～14血清型标准株由军事医学科学院微生物研究室提供；UuT 960标准株、肺炎支原体标准株、人型支原体标准株、生殖支原体标准株由首都儿科研究所提供。
3.引物及寡核苷酸探针：上游引物U5：5′-CAATCTGCT-CGTGAAGTATTAC- 3′(328～349)；下游引物U4：5′- ACGACGTCCATAAGCAACT -3′(739～757)，5′端标记生物素；探针U9：5′-GAGATAATG-ATTATATGTC AGGATCA- 3′(500～525)，3′端标记地高辛。序列均经Gene Bank验证，由CyberSyn公司合成。
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4.主要试剂及仪器：Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，dNTPs法玛西亚公司产品，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)购自宝灵曼公司。支原体培养试剂盒(IST)为生物-梅里埃公司产品。DNA扩增仪为PE公司产品，酶标板为丹麦Nunc公司产品。
二、方法
1.标本的采集与保存：宫颈拭子、男性尿道拭子，均取2份标本，1份于生物-梅里埃支原体IST培养，另1份置于1.5 ml无菌生理盐水中，充分挤压、振荡后弃去，-20℃保存。精液、前列腺液标本直接留取后取200 μl培养，其余-20℃保存。
2.支原体培养及药敏试验：按试剂盒操作说明进行，置35～37℃培养。24～48 h观察颜色变化，24 h相应的小孔由黄变红或橙色提示Uu生长，48 h相应的小孔由黄变红或橙色提示生殖支原体(Mh)生长；72 h仍不变色者为阴性，变混浊可能为杂菌污染。同时观察药敏结果，有强力霉素、交沙霉素、氧氟沙星、红霉素、四环素、原始霉素6种抗生素共11个药敏孔(除原始霉素为1个浓度外其余均为高低2个不同浓度)，相应的药敏孔由黄变红提示耐药，变为橙色提示中介度，仍为黄色提示敏感。
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3.DNA模板制备：用蛋白酶K消化后用经典的酚、氯仿抽提。
4.PCR扩增：扩增总体系为25 μl，其中模板5 μl，引物均为0.4 μmol/L，dNTP均为0.2 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L pH8.3，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1.5 U。循环条件为95℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环。分别取PCR产物进行2%琼脂糖电泳及微孔板杂交检测。扩增片段为429 bp。
5.微孔板杂交法检测PCR产物：(1)包被微孔板：将链酶亲和素以5 mg/L的浓度100 μl/孔包被微孔板，4℃过夜。加入封闭剂(0.01 mol/L PBS pH7.4，3% BSA)200 μl/孔，4℃过夜。(2)产物的捕获及变性：取PCR产物1∶10稀释后以100 μl/孔加入微孔板中，37℃ 1 h后用洗液(10 mmol/L Tris-HCl pH7.5、0.05%吐温-20)洗板，加入150 mmol/L的NaOH溶液100 μl，室温15 min，洗板。(3)杂交反应：加入含地高辛标记探针10 pmol/孔的杂交液(50%去离子甲酰胺、5×SSC、1×FPG、25 mmol/L磷酸盐、2 g/L SDS、50 g/L硫酸葡聚糖)100 μl/孔进行杂交反应,37℃ 45 min。(4)酶显色：洗板后加入1∶2 000稀释的Anti-DIG-AP 100 μl/孔(酶稀释液为100 mmol/L Tris-HCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、10 g/L BSA)，37℃ 45 min。充分洗板后加入底物(PNPP 10 g溶于10 ml蒸馏水、87 μl二乙醇胺、加入5 μl 1 mol/L MgCl2使终浓度为0.5 mmol/L)100 μl/孔，37℃避光显色，2 mol/L NaOH 50 μl终止反应，酶标仪405 nm波长测吸光度A值。
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结果
1.杂交特异性试验：Uu14个血清型的扩增产物均与U9探针发生特异性杂交，而肺炎支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体及淋病奈瑟菌均为阴性。
2.杂交敏感性试验：分别取相当于0、1、1×101、5×101、1×102、5×102、1×103、1×104 CCU/ml(CCU，颜色改变单位)的Uu菌液为模板PCR后进行MPH，与2%琼脂糖电泳比较两者的敏感性(表1)。
表1 不同模板浓度的杂交及电泳结果比较 模板浓度
(CCU/ml)
A值
, 百拇医药 结果
模板浓度
(CCU/ml)
A值
结果
1×104
0.725
++
5×10
0.313
±
1×103
0.614
, 百拇医药
++
1×10
0.111
-
5×102
0.543
+
1
0.058
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0.431
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0
0.012
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3.对照人群Uu的PCR-MPH测定：取经婚检筛查无泌尿生殖道炎症的健康未婚的男性尿道拭子、女性分泌物共48份标本进行PCR-MPH，结果显示，其A值均值为0.056，标准差(s)为0.0172，因而依照阴性对照+4s确定MPH试验的cut off值为阴性对照+0.07。
4.批内与批间重复性分析：阳性对照批内CV值为5.4%，批间CV值为13.9%，阴性对照批内CV值为4.4%，批间CV值为10.4%。
5.利用PCR-MPH法与培养法对临床158份标本进行Uu检测(表2)。
6.分析孕妇、泌尿生殖道感染及男性不育症3组人群的Uu阳性结果(表3)。
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7.药敏结果：原始霉素、交沙霉素、强力霉素、四环素、氧氟沙星、红霉素，敏感率分别为100%、96.6%、89.7%、79.3%、34.5%及6.9%。表2 PCR-MPH阳性结果与培养的比较(份数) 培养
PCR-MPH
合计
阳性
阴性
阳性
51
5
56
阴性
14
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88
102
合计
65
93
158
表3 不同人群Uu阳性率(%) 人群
例数
Uu阳性例数
Uu阳性率
培养法
PCR-MPH
培养法
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PCR-MPH
孕妇
40
12
16
30.0
40.0
泌尿生殖系统
感染者
88
35
41
39.8
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男性不育症
30
9
8
30.0
26.7
讨论
自1954年由Shepard首次从非淋菌性尿道炎(NGU)患者标本中分离出Uu至今，Uu感染日益受到人们的重视[1]。我们选用了Uu脲酶基因序列引物可对Uu的14个血清型进行扩增，选用其内部寡核苷酸序列作为特异性探针与之杂交。PCR-MPH的前提条件是较好的PCR扩增效果，所以在试验过程中，首先优化了多种PCR试验条件，然后又对杂交过程进行优化。采用地高辛标记的探针进行特异性杂交，避免了非特异条带对判断电泳结果的影响[2]。同时其敏感性可达10CFU/ml，而电泳只能观察到50～100CFU/ml，敏感性提高5～10倍。与文献报道PCR-MPH较PCR电泳法敏感10倍基本一致。
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对158份临床标本的检测结果显示，PCR-MPH与传统的培养法相比，两者有较好的符合率。对于5份培养为阳性而PCR-MPH为阴性的标本，其中2份用生物梅里埃培养基鉴定为人型支原体，考虑人型支原体生长造成对Uu培养结果判断的干扰；另外3份用培养液重复PCR-MPH后，其结果为阳性，考虑是否标本中存在扩增的抑制物。对14份培养为阴性而PCR-MPH为阳性的标本，重复3次试验仍为阳性。考虑由于培养法的敏感性低，仅可检测出大于103～104 CCU/ml的菌液，或由于标本运送、保存的影响使培养结果为阴性。但结合患者病史、临床症状以及形态学检查仍考虑为Uu感染。
由于PCR-MPH法结合了PCR的高敏感性、杂交的特异性、酶标仪读取结果的客观性等优点，而被逐步应用，并可提高检出率、增强特异性，同时能一次检测大量标本。由于标记方法、物质、酶的不同，而相继建立多种方式的PCR-MPH法。我们采用将带有生物素标记的PCR产物包被在包有链霉亲和素的微孔板上，由于生物素-链霉亲和素的强大的、稳定的亲和能力以及PCR的高度扩增效率，可以尽可能多的将目的DNA结合在微孔板上。
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分析3组人群Uu阳性率显示泌尿生殖系统感染组最高(46.6%)，与文献报道一致。在孕妇中Uu的阳性率，国外报道为50%～70%，国内报道达73.2%。由于Uu携带率与多种因素有关，并且受检测方法影响，所以检出率会有所不同，即使在“同一”人群中。我们将继续追踪其对胎儿、新生儿的影响。
药敏结果显示，Uu对所列抗生素的敏感程度与国内报道相似[3，4]。Uu对目前临床治疗常用的红霉素显示了很高的耐药性(可能与耐药基因tetM相关)[5]，同时在反复Uu感染的病例中，出现了多种抗生素同时耐药的情况，应该引起临床治疗方面的关注。
大量的临床检测结果对目前临床诊断、治疗提供了一定的参考价值。这一方法能够反映现症感染情况，将来可进一步控制多种实验条件实现真正意义上的定量检测[6]。
志谢 东直门外医院曹兴午、杨文质、姜梅等老师对收集标本工作的大力协助
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参考文献
1，Yoon BH, Chang JW, Romero R. Isolation of Ureaplasma urealyticum from the amniotic cavity and adverse outcome in preterm labor. Obstet Gynecol, 1998, 92:77-82.
2，张正. 聚合酶链式反应定量技术在微生物检测中的应用. 中华医学检验杂志，1999，22:22-24.
3，楮云卓，年华，贾桂英，等. 解脲脲原体药敏试验结果分析. 中华检验医学杂志，2000，23:43.
4，Clegg A, Passey M, Yoannes M, et al. High rates of genital mycoplasma infection in the highlands of papua New Guinea determined both by culture and by a commercial detection kit. J Clin Microbiol， 1997,35:197-200.
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5，de Barbeyrac B, Dupon M, Rodriguez P, et al. A Tn1545-like transposon carries the tet (M) gene in tetracycline resistant strains of Bacteroides ureolyticus as well as Ureaplasma urealyticum but not Neisseria gonorrhoeae. J Antimicrob Chemother, 1996,37:223-232.
6，何蕴韶. 聚合酶链式反应技术在医学检验中的应用和展望. 中华医学检验杂志，1999，22:133-134.
(收稿日期：2000-04-26), 百拇医药