免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶
作者：李艳 张平安 邹力 何其敏
单位：李艳 张平安(湖北医科大学附属第一医院检验科 武汉，430060)；邹力(普外科)；何其敏(Karolinska institute,Sweden)
关键词：胸苷激酶；免疫印迹法；乳腺肿瘤
中华检验医学杂志000604 【摘要】 目的 探讨用免疫印迹发光法，检测乳腺肿瘤患者血清细胞质胸苷激酶(TK1)的研究及临床应用。方法 利用抗胸苷激酶单克隆抗体(anti-TK1mAb)建立点免疫印迹发光法，分析乳腺肿瘤患者、非肿瘤患者和体检健康者血清TK1的水平。结果 术前的乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者、非肿瘤患者和体检健康者血清TK1的水平分别为(39.3±33.9)，(3.7±3.9)，(1.7±0.5)和(1.4±0.5) pmol/L。淋巴结转移的术前和术后乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者血清TK1与体检健康者差异有显著意义(P<0.001，P<0.001，P<0.05)；而淋巴结未转移的术后乳腺癌患者、非肿瘤患者血清TK1与体检健康者差异无显著意义(P>0.10，P>0.05)。通过对术后乳腺癌患者血清TK1检测发现，淋巴结未转移患者TK1水平明显低于淋巴结转移患者(P<0.001)。结论 该方法有较好的敏感性与特异性，用于血清TK1的检测可作为乳腺癌的辅助诊断、术后疗效观察和预后判断的方法之一。
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Anti-TK1 antibody in detecting thymidine kinase 1 in serum of breast tumor patients
LI Yan ZHANG Pingan ZOU Li
(Department of Laboratory, First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the value of immunoblotting in the detection of serum thymidine kinase 1 (TK1) in breast tumor patients. Methods TK1 in sera from breast tumor patients, non-tumor patients and healthy volunteers were determined with immunoblotting assay.Results The levels of TK1 in breast cancer patients before operation, patients with benign breast tumor, non-tumor patients, and healthy volunteers were (39.3±33.9), (3.7±3.9), (1.7±0.5) and (1.4±0.5) pmol/L respectively. The value of TK1 was higher in malignant and benign breast neoplasms patients than in healthy volunteers. However, no significant difference in the TK1 level was found between breast cancer patients without metastasis after operation, non-tumor patients, and healthy volunteers.Conclusions The immunoblotting of TK1 by anti-TK1 antibody is a sensitive and specific assay. It can be used to monitor and predict the efficiency of the therapy as well as the breast neoplasms progression during clinical course.
, 百拇医药
【Key words】 Thymidine kinase;Immunoblotting;Breast neoplasms
1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶，随后的研究表明[1]，TK有两种同工酶，为细胞质TK(TK1)和线粒体TK(TK2)，其中TK1与细胞分裂密切相关，在细胞分裂G1期含量比较低，到S期后逐渐升高，至G2期达到最高，因此，编码TK1的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。
目前，实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性，由于125I标记脱氧尿嘧啶半衰期短，且具有放射性污染，难于在临床上推广。1996年He等[2]报道利用抗-TK1多克隆抗体，建立 western blotting 检测人TK1。在此基础上，我们利用抗-TK1单克隆抗体，建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1，可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究，在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果，现初步报告如下。
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材料和方法
一、材料
1.研究对象：共检测118例患者，其中乳腺肿瘤患者75例，来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院，经病理学确诊，乳腺癌61例(手术前患者14例，淋巴结未转移的手术后患者37例，淋
表1 乳腺肿瘤患者与对照人群血清TK1的含量(pmol/L) 组别
例数
±s
t
P
体检健康者
11
, 百拇医药
1.4± 0.5
非肿瘤病人
32
1.7± 0.5
1.60*
>0.05
术前乳腺癌患者
14
39.3±33.9
3.69*
<0.001
淋巴结未转移的术后乳腺癌
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37
2.3± 2.3
1.28*，6.71**
>0.1，<0.001**
患者
淋巴结转移的术后乳腺癌患者
10
24.4±18.3
4.18*，7.34***
<0.001，<0.001***
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乳腺良性肿瘤患者
14
3.7± 3.9
1.93*，3.62**
<0.05，<0.001**
注：*与体检健康者比较，与术前乳腺癌患者比较，与淋巴结未转移的术后乳腺癌患者比较巴结转移的手术后患者10例)，乳腺良性肿瘤14例；对照组43例，其中11名为本院体检健康者，32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例，乙型肝炎12例，肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血，分离血清，贮存于-20℃备用。
2.硝酸纤维素薄膜(NCM)，孔径0.45 μm，规格10 cm×8 cm，浙江黄岩四青生化材料厂生产。
, 百拇医药
3.主要试剂和仪器：TK1单克隆抗体，生物素标记的羊抗鼠抗体(bio-anti-M)，辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin-HRP)，TK1标准品(0、5、10、20、40、80、160 pmol/L)，鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS-700图像扫描仪为美国Bio-Rad公司产品。
二、方法
1.点样，在NCM上每点加血清5 μl，同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品)，室温晾干，洗涤3次，每次5 min。将NCM 37℃振荡封闭2 h，加入适量的TK1单抗于封闭液中，4℃振荡过夜，漂洗3次，将NCM放于bio-anti-M液中，室温振荡作用1 h，洗涤同前。加入适当浓度的avidin-HRP 于NCM容器中，室温1 h，洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中，室温1 min，用塑料膜将NCM封好，排除气泡，装于密封夹内，暗室中放入X线片，曝光3 min(30 min内完成)，取片冲洗。
, 百拇医药
2.结果分析，用GS-700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A)，以标准品的含量对应A值作图进行定量分析，凡是TK1浓度大于5 pmol/L可判定为异常；也可通过肉眼观察定性分析，斑点颜色深于5 pmol/L标准品，即为TK1阳性。
三、Western Immunoblotting检测血清TK1
详细操作方法参见有关文献[2]。
结果
一、特异性
1.对照实验：取1份TK1阳性血清，分别设立TK1单抗、 bio-anti-M及avidin-HRP空白对照，经点免疫印迹发光法测定，发现三者对照点均不显色。
2.TK1分子量验证：取10份TK1阳性和5份TK1阴性血清，40%硫酸铵沉淀，取上清液透析，再进行Western Immunoblotting，结果TK1阳性血清在分子量25 000处均有显色条带，TK1阴性血清无显色。
, 百拇医药
二、标准曲线的制作
不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160 pmol/L)，经过点免疫印迹发光法测定后，用GS-700图像扫描仪测定各斑点的A值，以标准品浓度值为横坐标，A值为纵坐标制作标准曲线(图1)。
图1 TK1测定的标准曲线 三、重复性试验
两份乳腺肿瘤患者血清，应用点免疫印迹发光法在同一NCM上重复测定20次，结果：病例1的TK1含量为194 pmol/L，标准差为12；病例2血清的TK1含量为49 pmol/L，标准差为2.1，两者的批内CV分别为0.062和0.043。
四、标本检测
各组人群血清TK1的含量比较见表1；用点免疫印迹发光法检测血清的X线片结果见图2。
, 百拇医药
五、乳腺肿瘤患者术后TK1的动态变化
对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37 d的血清进行检测，TK1分别为9.1、2.5、4.9 pmol/L；而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92 d的血清TK1分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8 poml/L。结果表明，当患者完全康复时，TK1呈明显下降趋势。
图2 点免疫印迹发光法检测血清TK1的X线片结果
讨论
正常人细胞中TK1的含量极低，只是在细胞过度增生的情况下，才出现高的水平，Ellime等[3]报道，恶性贫血患者血清中TK的含量是正常人的40倍，且能作为一些癌症发生、发展和预后的重要指标。我们利用抗TK1mAb，建立点免疫印发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1，通过对方法特异性、重复性的考查，以及经Western Immunoblotting的验证，表明该方法简便易行，可用于血清TK1的检测。
, 百拇医药
从本研究结果看，乳腺癌患者血清TK1水平明显高于乳腺良性肿瘤患者，而后者与体检健康者TK1无明显差别(P>0.05)，对于淋巴结未转移的乳腺癌患者，手术后TK1水平呈明显下降的趋势。因此，血清TK1不仅可以作为乳腺癌诊断的一个敏感性指标，而且也有利于乳腺癌的疗效观察。虽然乳腺癌患者血清TK1水平明显高于对照人群，但是乳腺癌患者间TK1水平也有差别，可能与肿瘤细胞分化程度和所处细胞周期及肿瘤是否转移有关，有待进一步研究。
血清TK1的来源仍不十分清楚，而且它比细胞内提取的TK1更稳定，同时，血清TK1的水平与肿瘤的性质有关，因此，有学者[4]推测，血清TK1可能是肿瘤细胞分泌或溶解释放胸苷激酶的聚合体。
国外已有报道，应用酶法[3]和Western Blotting[2]检测血清中TK1，且能进行定量分析。但因这些方法操作繁琐，难以用于临床。我们认为点免疫印迹发光法容易操作，而且利用了发光技术的高灵敏性，通过X线片曝光，避免了使用发光检测仪，且可长期保存实验结果；通过设立标准品对照，根据斑点的深浅进行定量分析。因此，点免疫印迹发光法检测血清TK1可作为乳腺肿瘤诊断方法之一，尤其判断良恶性乳腺肿瘤具有很好的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
1，Aner ES, Eriksson S. Mammalian deoxynucleoside kinase. Pharmac Ther,1995,67:155-186.
2，He Q, Skog S, Wang N, et al. Characterization of a peptide antibody against a C-terminal part of human and mouse cytosolic thymidine kinase, which is marker for cell proliferation. Eur J Cell Biol, 1996,70:117-124.
3，Hallek M, Touiton Y, Levi F, et al. Serum thymi dine kinase levels are elevated and exhibit diurnal variations in patients with advanced ovarian cancer. Clin Chim Acta, 1997,267:155-166.
, http://www.100md.com
4，He Q, Lewin N, Skog S, et al. Thymidine kinase 1 is expressed differently in EBV carrying cell line from Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia patients as compared to non-EBV infected and EBV infected normal B cells. 3rd Hong Kong International Cancer Congress& 7th International EBV Symposium, 1996, 52:13-16.
(收稿日期：2000-03-13), 百拇医药
单位：李艳 张平安(湖北医科大学附属第一医院检验科 武汉，430060)；邹力(普外科)；何其敏(Karolinska institute,Sweden)
关键词：胸苷激酶；免疫印迹法；乳腺肿瘤
中华检验医学杂志000604 【摘要】 目的 探讨用免疫印迹发光法，检测乳腺肿瘤患者血清细胞质胸苷激酶(TK1)的研究及临床应用。方法 利用抗胸苷激酶单克隆抗体(anti-TK1mAb)建立点免疫印迹发光法，分析乳腺肿瘤患者、非肿瘤患者和体检健康者血清TK1的水平。结果 术前的乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者、非肿瘤患者和体检健康者血清TK1的水平分别为(39.3±33.9)，(3.7±3.9)，(1.7±0.5)和(1.4±0.5) pmol/L。淋巴结转移的术前和术后乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者血清TK1与体检健康者差异有显著意义(P<0.001，P<0.001，P<0.05)；而淋巴结未转移的术后乳腺癌患者、非肿瘤患者血清TK1与体检健康者差异无显著意义(P>0.10，P>0.05)。通过对术后乳腺癌患者血清TK1检测发现，淋巴结未转移患者TK1水平明显低于淋巴结转移患者(P<0.001)。结论 该方法有较好的敏感性与特异性，用于血清TK1的检测可作为乳腺癌的辅助诊断、术后疗效观察和预后判断的方法之一。
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Anti-TK1 antibody in detecting thymidine kinase 1 in serum of breast tumor patients
LI Yan ZHANG Pingan ZOU Li
(Department of Laboratory, First Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430060, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the value of immunoblotting in the detection of serum thymidine kinase 1 (TK1) in breast tumor patients. Methods TK1 in sera from breast tumor patients, non-tumor patients and healthy volunteers were determined with immunoblotting assay.Results The levels of TK1 in breast cancer patients before operation, patients with benign breast tumor, non-tumor patients, and healthy volunteers were (39.3±33.9), (3.7±3.9), (1.7±0.5) and (1.4±0.5) pmol/L respectively. The value of TK1 was higher in malignant and benign breast neoplasms patients than in healthy volunteers. However, no significant difference in the TK1 level was found between breast cancer patients without metastasis after operation, non-tumor patients, and healthy volunteers.Conclusions The immunoblotting of TK1 by anti-TK1 antibody is a sensitive and specific assay. It can be used to monitor and predict the efficiency of the therapy as well as the breast neoplasms progression during clinical course.
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【Key words】 Thymidine kinase;Immunoblotting;Breast neoplasms
1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶，随后的研究表明[1]，TK有两种同工酶，为细胞质TK(TK1)和线粒体TK(TK2)，其中TK1与细胞分裂密切相关，在细胞分裂G1期含量比较低，到S期后逐渐升高，至G2期达到最高，因此，编码TK1的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。
目前，实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性，由于125I标记脱氧尿嘧啶半衰期短，且具有放射性污染，难于在临床上推广。1996年He等[2]报道利用抗-TK1多克隆抗体，建立 western blotting 检测人TK1。在此基础上，我们利用抗-TK1单克隆抗体，建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1，可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究，在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果，现初步报告如下。
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材料和方法
一、材料
1.研究对象：共检测118例患者，其中乳腺肿瘤患者75例，来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院，经病理学确诊，乳腺癌61例(手术前患者14例，淋巴结未转移的手术后患者37例，淋
表1 乳腺肿瘤患者与对照人群血清TK1的含量(pmol/L) 组别
例数
±st
P
体检健康者
11
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1.4± 0.5
非肿瘤病人
32
1.7± 0.5
1.60*
>0.05
术前乳腺癌患者
14
39.3±33.9
3.69*
<0.001
淋巴结未转移的术后乳腺癌
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37
2.3± 2.3
1.28*，6.71**
>0.1，<0.001**
患者
淋巴结转移的术后乳腺癌患者
10
24.4±18.3
4.18*，7.34***
<0.001，<0.001***
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乳腺良性肿瘤患者
14
3.7± 3.9
1.93*，3.62**
<0.05，<0.001**
注：*与体检健康者比较，与术前乳腺癌患者比较，与淋巴结未转移的术后乳腺癌患者比较巴结转移的手术后患者10例)，乳腺良性肿瘤14例；对照组43例，其中11名为本院体检健康者，32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例，乙型肝炎12例，肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血，分离血清，贮存于-20℃备用。
2.硝酸纤维素薄膜(NCM)，孔径0.45 μm，规格10 cm×8 cm，浙江黄岩四青生化材料厂生产。
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3.主要试剂和仪器：TK1单克隆抗体，生物素标记的羊抗鼠抗体(bio-anti-M)，辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin-HRP)，TK1标准品(0、5、10、20、40、80、160 pmol/L)，鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS-700图像扫描仪为美国Bio-Rad公司产品。
二、方法
1.点样，在NCM上每点加血清5 μl，同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品)，室温晾干，洗涤3次，每次5 min。将NCM 37℃振荡封闭2 h，加入适量的TK1单抗于封闭液中，4℃振荡过夜，漂洗3次，将NCM放于bio-anti-M液中，室温振荡作用1 h，洗涤同前。加入适当浓度的avidin-HRP 于NCM容器中，室温1 h，洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中，室温1 min，用塑料膜将NCM封好，排除气泡，装于密封夹内，暗室中放入X线片，曝光3 min(30 min内完成)，取片冲洗。
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2.结果分析，用GS-700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A)，以标准品的含量对应A值作图进行定量分析，凡是TK1浓度大于5 pmol/L可判定为异常；也可通过肉眼观察定性分析，斑点颜色深于5 pmol/L标准品，即为TK1阳性。
三、Western Immunoblotting检测血清TK1
详细操作方法参见有关文献[2]。
结果
一、特异性
1.对照实验：取1份TK1阳性血清，分别设立TK1单抗、 bio-anti-M及avidin-HRP空白对照，经点免疫印迹发光法测定，发现三者对照点均不显色。
2.TK1分子量验证：取10份TK1阳性和5份TK1阴性血清，40%硫酸铵沉淀，取上清液透析，再进行Western Immunoblotting，结果TK1阳性血清在分子量25 000处均有显色条带，TK1阴性血清无显色。
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二、标准曲线的制作
不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160 pmol/L)，经过点免疫印迹发光法测定后，用GS-700图像扫描仪测定各斑点的A值，以标准品浓度值为横坐标，A值为纵坐标制作标准曲线(图1)。
图1 TK1测定的标准曲线 三、重复性试验
两份乳腺肿瘤患者血清，应用点免疫印迹发光法在同一NCM上重复测定20次，结果：病例1的TK1含量为194 pmol/L，标准差为12；病例2血清的TK1含量为49 pmol/L，标准差为2.1，两者的批内CV分别为0.062和0.043。
四、标本检测
各组人群血清TK1的含量比较见表1；用点免疫印迹发光法检测血清的X线片结果见图2。
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五、乳腺肿瘤患者术后TK1的动态变化
对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37 d的血清进行检测，TK1分别为9.1、2.5、4.9 pmol/L；而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92 d的血清TK1分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8 poml/L。结果表明，当患者完全康复时，TK1呈明显下降趋势。
图2 点免疫印迹发光法检测血清TK1的X线片结果
讨论
正常人细胞中TK1的含量极低，只是在细胞过度增生的情况下，才出现高的水平，Ellime等[3]报道，恶性贫血患者血清中TK的含量是正常人的40倍，且能作为一些癌症发生、发展和预后的重要指标。我们利用抗TK1mAb，建立点免疫印发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK1，通过对方法特异性、重复性的考查，以及经Western Immunoblotting的验证，表明该方法简便易行，可用于血清TK1的检测。
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从本研究结果看，乳腺癌患者血清TK1水平明显高于乳腺良性肿瘤患者，而后者与体检健康者TK1无明显差别(P>0.05)，对于淋巴结未转移的乳腺癌患者，手术后TK1水平呈明显下降的趋势。因此，血清TK1不仅可以作为乳腺癌诊断的一个敏感性指标，而且也有利于乳腺癌的疗效观察。虽然乳腺癌患者血清TK1水平明显高于对照人群，但是乳腺癌患者间TK1水平也有差别，可能与肿瘤细胞分化程度和所处细胞周期及肿瘤是否转移有关，有待进一步研究。
血清TK1的来源仍不十分清楚，而且它比细胞内提取的TK1更稳定，同时，血清TK1的水平与肿瘤的性质有关，因此，有学者[4]推测，血清TK1可能是肿瘤细胞分泌或溶解释放胸苷激酶的聚合体。
国外已有报道，应用酶法[3]和Western Blotting[2]检测血清中TK1，且能进行定量分析。但因这些方法操作繁琐，难以用于临床。我们认为点免疫印迹发光法容易操作，而且利用了发光技术的高灵敏性，通过X线片曝光，避免了使用发光检测仪，且可长期保存实验结果；通过设立标准品对照，根据斑点的深浅进行定量分析。因此，点免疫印迹发光法检测血清TK1可作为乳腺肿瘤诊断方法之一，尤其判断良恶性乳腺肿瘤具有很好的应用前景。
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参考文献
1，Aner ES, Eriksson S. Mammalian deoxynucleoside kinase. Pharmac Ther,1995,67:155-186.
2，He Q, Skog S, Wang N, et al. Characterization of a peptide antibody against a C-terminal part of human and mouse cytosolic thymidine kinase, which is marker for cell proliferation. Eur J Cell Biol, 1996,70:117-124.
3，Hallek M, Touiton Y, Levi F, et al. Serum thymi dine kinase levels are elevated and exhibit diurnal variations in patients with advanced ovarian cancer. Clin Chim Acta, 1997,267:155-166.
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4，He Q, Lewin N, Skog S, et al. Thymidine kinase 1 is expressed differently in EBV carrying cell line from Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia patients as compared to non-EBV infected and EBV infected normal B cells. 3rd Hong Kong International Cancer Congress& 7th International EBV Symposium, 1996, 52:13-16.
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