尿脱落细胞ras癌基因突变的检测
作者：何晓文 李峻 靳小青 卢建 马小兵 孙民 钮燕 陆翠琴
单位：何晓文 李峻 靳小青 钮燕 陆翠琴(海军医学研究所新药研究中心 上海，200433)；卢建(第二军医大学基础医学部病理生理教研室)；马小兵(海军411医院泌尿外科)；孙民(检验科)
关键词：膀胱肿瘤；基因ras；多态现象；单链构象；上皮细胞
中华检验医学杂志000601 【摘要】 目的 评价尿脱落细胞ras癌基因突变作为肿瘤标记物诊断膀胱移行上皮细胞癌(TCC)的临床价值。方法用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)银染色法检测48例TCC患者晨尿脱落细胞中ras癌基因外显子1突变，同时对其做尿脱落细胞学检查。对所有泳动变位的DNA片段进行Sanger双脱氧链终止法测序。结果 发现健康者尿脱落细胞和非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的尿脱落细胞均无ras癌基因突变，而48例TCC患者尿脱落细胞存在ras癌基因突变。利用PCR-SSCP发现的ras癌基因突变这个指标，对Ⅰ(32份)，Ⅱ(9份)，Ⅲ(7份)级TCC的检出分别为16份，4份，3份，均约占1/2。测序结果证实，所有泳动变位的DNA片段均存在基因点突变，突变的位点：22例位于第12密码子上(G→T)、有1例位于第13密码子上(G→T)。结合临床和病理资料分析，发现该基因突变与临床分期呈明显正相关，而且复发组突变率明显高于原发组。结论 尿脱落细胞ras癌基因突变有望作为一种检测TCC的灵敏的标记物应用于临床诊断。
, 百拇医药
Detection of H-ras mutation in urine exfoliated cells complements cytology in 48 TCC patients
HE Xiao-wen LI Jun JIN Xiao qing
(Naval Medical Research Institute, New Drug Center, Shanghai 200433, China)
【Abstract】 Objective To determine the value of detection of H-ras oncogene mutation in urine exfoliated cells as clinical indicator of tumor presence, recurrence and stage.Methods Point mutation at codon 12 of H-ras gene was assayed by polymerase chain reaction followed by analysis of single strand conformation polymorphism in urine exfoliated cells from 48 patients with transitional cell carcinoma before operation and 28 patients with non urothelial cancer or normal individuals. The mutation was further confirmed by dideoxy-mediated chain-termination method of DNA sequencing. Cytology analysis was carried out simultaneously. Bladder tumor specimens were obtained from 48 patients during operation, and histologically elevated for tumor content and grading.Results 48%(23 of 48) of the patients were detected by their aberrant band in SSCP. All aberrant bands displayed a mutant H-ras sequence, where 15% (7 of 48) of the patients displayed, apositive cytological analysis. Analysis of abnormalities with tumor stage revealed that the greater detection of high pathological stage (Ⅲ Ⅳ) compared with low stage (Ⅰ Ⅱ) was related to the recurrence of transitional cell carcinoma.Conclusion Our results suggest that the detection of H-ras mutations may be of clinical value in the detection of TCC.
, http://www.100md.com
【Key words】 Bladder neoplasms;Genes, ras;Polymorphism, single-stranded conformational;Epithelial cells
目前临床上对膀胱移行上皮细胞癌(TCC)的诊断还依赖于膀胱镜检查、B超检查和尿液脱落细胞学检查，前两者不易普及，而且不能发现早期的无症状TCC，后者虽为无损伤性、常规检查手段，但这种方法不仅检出率低，且易受感染、结石、放化疗等因素的影响，假阴性率、假阳性率还很高。大量研究表明，在TCC的发生、发展过程中，伴随着癌基因ras发生突变。由于尿液取材方便，人们设想通过尿液检查来无创伤性地早期诊断膀胱癌及监测其复发。我们利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)银染色法检测TCC患者晨尿脱落细胞ras癌基因突变，并且结合本组病例临床和病理资料分析，旨在探讨ras基因突变与TCC生物学行为的关系，及该方法的临床应用价值。
材料和方法
, 百拇医药
一、临床资料
以48份经手术病理证实的TCC患者术前晨尿脱落细胞为研究组，患者年龄46～73岁(平均55.8岁)，男35例，女13例；以14份正常健康者和14份非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的晨尿脱落细胞为对照组，对照组年龄45～82岁(平均63岁)，男18例，女10例。48例TCC按国际癌症防治联合会(UICC)和WHO评定标准，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤分别为32、9和7例；Ptis、PTa、PT1、PT2、PT3～4期肿瘤分别为5、9、18、8和8例。
二、晨尿的收集与处理
分别收取TCC患者术前晨尿和对照组每人晨尿200 ml，4℃，15 000 g离心收集尿脱落细胞。加入500 μl DNA抽提液(10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，100 mg/L蛋白酶K)，58℃过夜，酚-氯仿法抽提每份尿脱落细胞基因组DNA，用TE溶解，测定A260/A280比值，确定其浓度和含量，保存备用。每例TCC患者同时做尿脱落细胞学检查。
, 百拇医药
三、主要试剂与研究方法
1.PCR引物：根据基因库人ras癌基因的基因组序列，对其突变热点外显子1设计引物：引物1：5′-GACGGAATATAAGCTGGTGG-3′，引物2：5′-TGGATG-GTCAGCGCACTCTT-3′ (由上海生工生物技术公司合成)。PCR扩增产物长度为63 bp。
2.PCR-SSCP：PCR试剂盒购自Promega公司。以尿脱落细胞基因DNA为模板，PCR扩增ras基因外显子1特异性片断。PCR反应条件：94℃预变性6 min，然后94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，反应循环38次，72℃延伸7 min。以pBR322 DNA/Hae Ⅲ为分子量标准，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。最后取PCR产物10 μl，加二甲基亚砜变性缓冲液5 μl，95℃变性10 min，立即置于冰中，取变性后的PCR产物上样，至99份丙烯酰胺：1份N， N′-亚甲双丙烯酰胺的6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温、恒压200 v，电泳2～3 h，银染法染色。在灯箱上进行SSCP结果分析[1]。
, 百拇医药
3.二次PCR，低溶点琼脂糖凝胶回收目的片段：把有泳动变位片段的PCR产物50～100μl 与正常对照8μl再次在同样条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从银染的聚丙烯酰胺凝胶中割下有泳动变位的片段，加400 μl TE室温浸泡过夜，沸水煮20 min，自然冷却后于12 000 r/min离心10 min，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀。作二次PCR扩增模板。将二次PCR扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶上，电泳1～2 h，用1%低溶点琼脂糖凝胶回收目的条带，酚-氯仿再次抽提，无水乙醇沉淀，以这步回收的DNA为测序模板。
4.用Sanger双脱氧链终止法测定DNA扩增产物的序列：测序试剂盒购自GENE基因有限公司，γ-P32购自北京亚辉生物工程公司。
四、统计学处理
采用配对计数资料χ2检验及四格表直接概率计算法。
, 百拇医药
结果
8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，ras基因外显子1 PCR扩增产物的大小与设计值相符(图1)。利用SSCP技术，分析了48例TCC患者晨尿脱落细胞ras癌基因外显子1上是否存在基因突变。对每份待检标本，都分别作二次PCR-SSCP检测，以确定方法稳定性。电泳分析表明，银染-SSCP能清晰地分辨出单链DNA迁移率的改变。对照组织无异常条带出现。发现23例TCC患者的ras癌基因外显子1在尿脱落细胞标本中存在着泳动变位，占48%(23/48)。
泳道1、4：pBR322 DNA/HaeⅢ；泳道2、3：TCC患者尿脱落细胞DNA H-ras外显子1 PCR扩增产物
图1 8%非变性PAGE鉴定PCR扩增产物
, 百拇医药
图2 泳动变位的DNA测序结果
为了证实泳动变位的DNA是否确实存在着基因突变，我们对其进行了基因测序，结果表明，所有存在泳动变位的DNA片段均有基因突变发生，突变的位点有22份标本位于第12密码子上(G→T)(图2)，有1份标本位于第13密码子上(G→T)(图3)。结合临床及病理资料分析，SSCP法、脱落细胞学检查对各级的TCC不同的检出率见表1，对照组及TCC患者尿脱落细胞ras癌基因与临床参数的关系见表2。
图3 泳动变位的DNA测序
表1 SSCP法和脱落细胞学法检测ras基因对TCC分级的检出情况 分级
例数
SSCP法
, 百拇医药
细胞学法
阳性
阴性
阳性
阴性
G1
32
16
16
1
31
G2
9
, 百拇医药
4
5
1
8
G3
7
3
4
5
2
合计
48
23
25
, http://www.100md.com
7
41
表2 SSCP检测TCC患者尿脱落细胞ras基因与临床分期及复发的关系 临床
例数
SSCP阳性数
百分率(%)
Tis-T1期
32
12
37.5
T2-T4期
, 百拇医药
16
11
(11/16)
复发
29
19
65.5
未复发
19
4
(4/19)
讨论
当PCR产物小于200 bp时，SSCP分析能检测70%～95%的点突变，其敏感性随PCR产物长度的增加而降低，所以，我们通过针对ras的癌基因突变热点来扩增较短的DNA片段，以提高检出率，同时我们还对SSCP 的实验参数(如凝胶浓度，电压，电泳恒温，变性剂成分及浓度)作了一系列的优化，来消除假阳性。由于尿脱落细胞中可能会混杂正常组织来源的细胞，在SSCP和测序时会同时出现正常或异常条带，影响结果的判断。为此，我们经SSCP发现异常条带后，先从聚丙烯酰胺胶上割下含异常条带的凝胶，回收后再次扩增，再纯化回收扩增产物后测序，使测序模板尽可能多地含有变异的DNA片断，以尽可能减少测序时的条带，并提高检测的阳性率和准确性。
, 百拇医药
本研究的阳性检出率48%(23/48)与James等[2]的结果相近(44%，44/100)。分析可能由于ras癌基因点突变的肿瘤细胞在肿瘤组织只占少部分，在肿瘤组织检查中易于漏检。国内学者在包埋组织标本、手术标本中有62%、36%的不同检出率的报道，这种差异可能由于检查的例数差异、临床病理资料差异所致，也可能是检查方法上存在一定的假阳性，因其对可能的基因突变尚缺乏DNA测序来鉴定[3,4]。
在本研究中，我们注意到，ras的癌基因1外显子这个肿瘤标记物对TCC的检出率(48%)要显著高于脱落细胞学检查(15%)，尤其在高分化的TCC标记中，SSCP法对人ras癌基因的检出率(50%)要大大高于脱落细胞学检查(6%)，但脱落细胞学检查对低分化的TCC的检出率较高。有研究表明，脱落细胞学检查对TCC原位癌诊断有特别的意义，在12例原位癌的TCC标本中发现9例阳性。我们结合临床分析，发现该基因突变与临床分期呈明显正相关，T2-T4期基因突变率明显高于Tis-T1期(P<0.05)，而且复发组突变率明显高于原发组(P<0.01)。这说明该基因突变可能在膀胱癌发生、发展过程中较为重要，有望作为判断肿瘤恶性程度、进展及预后的一个监测性的肿瘤标志物应用于临床。
, 百拇医药
TCC的发生发展及预后是涉及多基因多步骤的复杂事件，对其诊断仅依赖于一项肿瘤标志，显然是不够现实。多选择几个临床可行的肿瘤标志物，多参数、多层面地提高对TCC的检出率，应是今后该领域的研究方向。如对TCC患者同时做尿脱落细胞端粒酶活性和脱落细胞学检查，则可使TCC早期率较单纯脱落细胞学检查提高5.6倍[5]。
参考文献
1，牛文彦，石建党，张伟，等. 聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛选胰岛素受体基因突变. 中华医学检验杂志，1999，22:87-89.
2，James M, Nirasha R, Kimberly R, et al. Identification of H-ras mutation in urine sediments complements cytology in the detection of bladder tumors. J Nat Cancer Inst, 1995, 87:129-133.
, 百拇医药
3，邹炼，韩骅. ras癌基因点突变与膀胱癌关系的研究. 中华泌尿外科杂志， 1996, 17:216-218.
4，陈钦忠，赵温利，徐祗顺，等. H-ras, p53基因变异与膀胱癌预后关系的探讨. 山东医科大学学报，1998,12:282-285.
5，Kazuhiro Y, Takashi S, Hidetoshi T. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection exforliated cancer cell in urine. Cancer, 1997, 79:362-369.
(收稿日期：2000-03-09), http://www.100md.com
单位：何晓文 李峻 靳小青 钮燕 陆翠琴(海军医学研究所新药研究中心 上海，200433)；卢建(第二军医大学基础医学部病理生理教研室)；马小兵(海军411医院泌尿外科)；孙民(检验科)
关键词：膀胱肿瘤；基因ras；多态现象；单链构象；上皮细胞
中华检验医学杂志000601 【摘要】 目的 评价尿脱落细胞ras癌基因突变作为肿瘤标记物诊断膀胱移行上皮细胞癌(TCC)的临床价值。方法用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)银染色法检测48例TCC患者晨尿脱落细胞中ras癌基因外显子1突变，同时对其做尿脱落细胞学检查。对所有泳动变位的DNA片段进行Sanger双脱氧链终止法测序。结果 发现健康者尿脱落细胞和非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的尿脱落细胞均无ras癌基因突变，而48例TCC患者尿脱落细胞存在ras癌基因突变。利用PCR-SSCP发现的ras癌基因突变这个指标，对Ⅰ(32份)，Ⅱ(9份)，Ⅲ(7份)级TCC的检出分别为16份，4份，3份，均约占1/2。测序结果证实，所有泳动变位的DNA片段均存在基因点突变，突变的位点：22例位于第12密码子上(G→T)、有1例位于第13密码子上(G→T)。结合临床和病理资料分析，发现该基因突变与临床分期呈明显正相关，而且复发组突变率明显高于原发组。结论 尿脱落细胞ras癌基因突变有望作为一种检测TCC的灵敏的标记物应用于临床诊断。
, 百拇医药
Detection of H-ras mutation in urine exfoliated cells complements cytology in 48 TCC patients
HE Xiao-wen LI Jun JIN Xiao qing
(Naval Medical Research Institute, New Drug Center, Shanghai 200433, China)
【Abstract】 Objective To determine the value of detection of H-ras oncogene mutation in urine exfoliated cells as clinical indicator of tumor presence, recurrence and stage.Methods Point mutation at codon 12 of H-ras gene was assayed by polymerase chain reaction followed by analysis of single strand conformation polymorphism in urine exfoliated cells from 48 patients with transitional cell carcinoma before operation and 28 patients with non urothelial cancer or normal individuals. The mutation was further confirmed by dideoxy-mediated chain-termination method of DNA sequencing. Cytology analysis was carried out simultaneously. Bladder tumor specimens were obtained from 48 patients during operation, and histologically elevated for tumor content and grading.Results 48%(23 of 48) of the patients were detected by their aberrant band in SSCP. All aberrant bands displayed a mutant H-ras sequence, where 15% (7 of 48) of the patients displayed, apositive cytological analysis. Analysis of abnormalities with tumor stage revealed that the greater detection of high pathological stage (Ⅲ Ⅳ) compared with low stage (Ⅰ Ⅱ) was related to the recurrence of transitional cell carcinoma.Conclusion Our results suggest that the detection of H-ras mutations may be of clinical value in the detection of TCC.
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【Key words】 Bladder neoplasms;Genes, ras;Polymorphism, single-stranded conformational;Epithelial cells
目前临床上对膀胱移行上皮细胞癌(TCC)的诊断还依赖于膀胱镜检查、B超检查和尿液脱落细胞学检查，前两者不易普及，而且不能发现早期的无症状TCC，后者虽为无损伤性、常规检查手段，但这种方法不仅检出率低，且易受感染、结石、放化疗等因素的影响，假阴性率、假阳性率还很高。大量研究表明，在TCC的发生、发展过程中，伴随着癌基因ras发生突变。由于尿液取材方便，人们设想通过尿液检查来无创伤性地早期诊断膀胱癌及监测其复发。我们利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)银染色法检测TCC患者晨尿脱落细胞ras癌基因突变，并且结合本组病例临床和病理资料分析，旨在探讨ras基因突变与TCC生物学行为的关系，及该方法的临床应用价值。
材料和方法
, 百拇医药
一、临床资料
以48份经手术病理证实的TCC患者术前晨尿脱落细胞为研究组，患者年龄46～73岁(平均55.8岁)，男35例，女13例；以14份正常健康者和14份非恶性肿瘤泌尿系统其他疾病患者的晨尿脱落细胞为对照组，对照组年龄45～82岁(平均63岁)，男18例，女10例。48例TCC按国际癌症防治联合会(UICC)和WHO评定标准，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤分别为32、9和7例；Ptis、PTa、PT1、PT2、PT3～4期肿瘤分别为5、9、18、8和8例。
二、晨尿的收集与处理
分别收取TCC患者术前晨尿和对照组每人晨尿200 ml，4℃，15 000 g离心收集尿脱落细胞。加入500 μl DNA抽提液(10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，100 mg/L蛋白酶K)，58℃过夜，酚-氯仿法抽提每份尿脱落细胞基因组DNA，用TE溶解，测定A260/A280比值，确定其浓度和含量，保存备用。每例TCC患者同时做尿脱落细胞学检查。
, 百拇医药
三、主要试剂与研究方法
1.PCR引物：根据基因库人ras癌基因的基因组序列，对其突变热点外显子1设计引物：引物1：5′-GACGGAATATAAGCTGGTGG-3′，引物2：5′-TGGATG-GTCAGCGCACTCTT-3′ (由上海生工生物技术公司合成)。PCR扩增产物长度为63 bp。
2.PCR-SSCP：PCR试剂盒购自Promega公司。以尿脱落细胞基因DNA为模板，PCR扩增ras基因外显子1特异性片断。PCR反应条件：94℃预变性6 min，然后94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，反应循环38次，72℃延伸7 min。以pBR322 DNA/Hae Ⅲ为分子量标准，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。最后取PCR产物10 μl，加二甲基亚砜变性缓冲液5 μl，95℃变性10 min，立即置于冰中，取变性后的PCR产物上样，至99份丙烯酰胺：1份N， N′-亚甲双丙烯酰胺的6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温、恒压200 v，电泳2～3 h，银染法染色。在灯箱上进行SSCP结果分析[1]。
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3.二次PCR，低溶点琼脂糖凝胶回收目的片段：把有泳动变位片段的PCR产物50～100μl 与正常对照8μl再次在同样条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从银染的聚丙烯酰胺凝胶中割下有泳动变位的片段，加400 μl TE室温浸泡过夜，沸水煮20 min，自然冷却后于12 000 r/min离心10 min，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀。作二次PCR扩增模板。将二次PCR扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶上，电泳1～2 h，用1%低溶点琼脂糖凝胶回收目的条带，酚-氯仿再次抽提，无水乙醇沉淀，以这步回收的DNA为测序模板。
4.用Sanger双脱氧链终止法测定DNA扩增产物的序列：测序试剂盒购自GENE基因有限公司，γ-P32购自北京亚辉生物工程公司。
四、统计学处理
采用配对计数资料χ2检验及四格表直接概率计算法。
, 百拇医药
结果
8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，ras基因外显子1 PCR扩增产物的大小与设计值相符(图1)。利用SSCP技术，分析了48例TCC患者晨尿脱落细胞ras癌基因外显子1上是否存在基因突变。对每份待检标本，都分别作二次PCR-SSCP检测，以确定方法稳定性。电泳分析表明，银染-SSCP能清晰地分辨出单链DNA迁移率的改变。对照组织无异常条带出现。发现23例TCC患者的ras癌基因外显子1在尿脱落细胞标本中存在着泳动变位，占48%(23/48)。
泳道1、4：pBR322 DNA/HaeⅢ；泳道2、3：TCC患者尿脱落细胞DNA H-ras外显子1 PCR扩增产物
图1 8%非变性PAGE鉴定PCR扩增产物
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图2 泳动变位的DNA测序结果
为了证实泳动变位的DNA是否确实存在着基因突变，我们对其进行了基因测序，结果表明，所有存在泳动变位的DNA片段均有基因突变发生，突变的位点有22份标本位于第12密码子上(G→T)(图2)，有1份标本位于第13密码子上(G→T)(图3)。结合临床及病理资料分析，SSCP法、脱落细胞学检查对各级的TCC不同的检出率见表1，对照组及TCC患者尿脱落细胞ras癌基因与临床参数的关系见表2。
图3 泳动变位的DNA测序
表1 SSCP法和脱落细胞学法检测ras基因对TCC分级的检出情况 分级
例数
SSCP法
, 百拇医药
细胞学法
阳性
阴性
阳性
阴性
G1
32
16
16
1
31
G2
9
, 百拇医药
4
5
1
8
G3
7
3
4
5
2
合计
48
23
25
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7
41
表2 SSCP检测TCC患者尿脱落细胞ras基因与临床分期及复发的关系 临床
例数
SSCP阳性数
百分率(%)
Tis-T1期
32
12
37.5
T2-T4期
, 百拇医药
16
11
(11/16)
复发
29
19
65.5
未复发
19
4
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讨论
当PCR产物小于200 bp时，SSCP分析能检测70%～95%的点突变，其敏感性随PCR产物长度的增加而降低，所以，我们通过针对ras的癌基因突变热点来扩增较短的DNA片段，以提高检出率，同时我们还对SSCP 的实验参数(如凝胶浓度，电压，电泳恒温，变性剂成分及浓度)作了一系列的优化，来消除假阳性。由于尿脱落细胞中可能会混杂正常组织来源的细胞，在SSCP和测序时会同时出现正常或异常条带，影响结果的判断。为此，我们经SSCP发现异常条带后，先从聚丙烯酰胺胶上割下含异常条带的凝胶，回收后再次扩增，再纯化回收扩增产物后测序，使测序模板尽可能多地含有变异的DNA片断，以尽可能减少测序时的条带，并提高检测的阳性率和准确性。
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本研究的阳性检出率48%(23/48)与James等[2]的结果相近(44%，44/100)。分析可能由于ras癌基因点突变的肿瘤细胞在肿瘤组织只占少部分，在肿瘤组织检查中易于漏检。国内学者在包埋组织标本、手术标本中有62%、36%的不同检出率的报道，这种差异可能由于检查的例数差异、临床病理资料差异所致，也可能是检查方法上存在一定的假阳性，因其对可能的基因突变尚缺乏DNA测序来鉴定[3,4]。
在本研究中，我们注意到，ras的癌基因1外显子这个肿瘤标记物对TCC的检出率(48%)要显著高于脱落细胞学检查(15%)，尤其在高分化的TCC标记中，SSCP法对人ras癌基因的检出率(50%)要大大高于脱落细胞学检查(6%)，但脱落细胞学检查对低分化的TCC的检出率较高。有研究表明，脱落细胞学检查对TCC原位癌诊断有特别的意义，在12例原位癌的TCC标本中发现9例阳性。我们结合临床分析，发现该基因突变与临床分期呈明显正相关，T2-T4期基因突变率明显高于Tis-T1期(P<0.05)，而且复发组突变率明显高于原发组(P<0.01)。这说明该基因突变可能在膀胱癌发生、发展过程中较为重要，有望作为判断肿瘤恶性程度、进展及预后的一个监测性的肿瘤标志物应用于临床。
, 百拇医药
TCC的发生发展及预后是涉及多基因多步骤的复杂事件，对其诊断仅依赖于一项肿瘤标志，显然是不够现实。多选择几个临床可行的肿瘤标志物，多参数、多层面地提高对TCC的检出率，应是今后该领域的研究方向。如对TCC患者同时做尿脱落细胞端粒酶活性和脱落细胞学检查，则可使TCC早期率较单纯脱落细胞学检查提高5.6倍[5]。
参考文献
1，牛文彦，石建党，张伟，等. 聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛选胰岛素受体基因突变. 中华医学检验杂志，1999，22:87-89.
2，James M, Nirasha R, Kimberly R, et al. Identification of H-ras mutation in urine sediments complements cytology in the detection of bladder tumors. J Nat Cancer Inst, 1995, 87:129-133.
, 百拇医药
3，邹炼，韩骅. ras癌基因点突变与膀胱癌关系的研究. 中华泌尿外科杂志， 1996, 17:216-218.
4，陈钦忠，赵温利，徐祗顺，等. H-ras, p53基因变异与膀胱癌预后关系的探讨. 山东医科大学学报，1998,12:282-285.
5，Kazuhiro Y, Takashi S, Hidetoshi T. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection exforliated cancer cell in urine. Cancer, 1997, 79:362-369.
(收稿日期：2000-03-09), http://www.100md.com