微波EnVision免疫组织化学技术及其应用
作者：马大烈 郑青渝 李全华 黄玲 魏建丽
单位：200433 上海第二军医大学长海医院病理科
关键词：
EnVision是DAKO公司最近推出的一种两步法免疫组化新技术 EnVision是DAKO公司最近推出的一种两步法免疫组化新技术，具有简便、特异和敏感等特点。为使该法更具快速，利于临床病理快速诊断。我们将微波技术引入该法中，并应用72种单克隆和多克隆抗体对相应的良、恶性肿瘤进行了常规免疫组化标记，其中24种抗体与标准EnVision法，微波ABC法和SP法对照。结果显示该法是一种更快速而有效的方法，有着广阔的应用前景。
一、材料和方法
1.组织标本：本科1996年8月～1997年6月常规肿瘤活检标本，包括多种上皮源性肿瘤、间叶源性肿瘤、神经源性肿瘤、神经内分泌肿瘤和淋巴瘤等。所有标本均经10%中性福马林微波固定5分钟。常规脱水和石蜡包埋切片(厚4 μm)。
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2.试剂：72种单克隆和多克隆抗体购自DAKO、Sigma、Zymed、Santa Cruz等公司。EnVision为DAKO公司产品。ABC和SP试剂分别来自Vector和Zymed公司。
3.微波仪：ZD-Ⅱ医用微波仪(上海中达医学应用研究所生产)。
4.操作方法：组织切片常规脱蜡至水。微波抗原修复；雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和Ki-67切片入柠檬酸缓冲液95℃，10分钟；其余切片入PBS液80℃，3分钟。冷却后经TBS洗涤。每张切片分别滴加已稀释特异性抗体30～50 μl，微波中功率辐射55秒。PBS洗2分钟×2次 。滴加EnVision复合物30～50 μl，微波中～低功率辐射55秒。PBS洗2分钟×2次。常规DAB-H2O2显色10分钟。苏木素复染，吹干和封片。
附表 微波与标准EnVision方法时间比较
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流程
标准时间
微波法
标准法
抗原修复
5 min
5 min
第一抗体
55 s
30 min
EnVision
55 s
30 min
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DAB-H2O2
10 min
10 min
, 百拇医药
图1 结节性肝硬化，肝细胞浆内HBsAg强阳性表达 图2 乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达 图3 乳腺癌，癌细胞浆CA15-3强阳性表达 图4 颈部淋巴瘤，肿瘤细胞核PCNA高度表达 (图1～4均为微波EnVision法×400)
标准EnVision方法：特异性抗体室温孵育30分钟，EnVision试剂室温30分钟，其余步骤与微波法相同。
二、结果
微波EnVision染色结果总体观察，阳性染色较强，阳性颗粒定位性极佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色(图1～4)。部分标记(如L 26、T细胞、PR、ER和Ki-67等)微波法优于标准法，神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)有时则不如标准法强。微波EnVision法标记时间为17分钟，而标准法则需要75分钟(附表)。3种微波免疫组化相比，EnVision法染色最强，敏感性最高，其次为SP法，ABC法则相对较低。非特异背景染色EnVision最低，其次为ABC法，SP法背景稍高一些。就染色步骤而言，此法为两步，其余方法均需三步才能完成。
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三、讨论
本法之所以具有非常高的敏感性除了微波能修复和暴露抗原，在一定程度提高了敏感性外[1，2]，主要是EnVision复合物内含有较多的HRP分子，对抗原有显著的放大作用。采用该法可将第一抗体稀释度提高1～2倍，尤其对抗原表达较弱组织，ER、PR、Ki-67和某些癌基因，该法应视为最理想的方法之一。
由于EnVision复合物内含有多个抗兔或抗鼠IgG，不仅增强了复合物与特异性抗体的结合机会和能力，而且染色步骤只需两步即可完成。此外，抗原抗体反应在微波作用下，使反应速度大为加快，从而降低了非特异性染色反应[3]，因此，除血细胞较丰富的组织和坏死组织外，可省略内源性过氧化物封闭步骤。
该法整个标记流程在17分钟内即可完成，较标准法省时近60分钟，这对于临床快速病理诊断，细胞穿刺和冰冻切片中免疫组化标记具有重要意义。
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在使用该法时，抗原修复除ER、PR、Ki-67等少数几种核抗原外，修复温度不宜过高，在80～90℃为宜，否则会降低染色强度。由于EnVision试剂内蛋白含量较高，易于吸收微波，故应采用中～低功率，并在温盒内放250～300 ml微波吸收介质。
参考文献
1 Brown RW, Chirala R. Utility of microwave-citrate antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol, 1995, 8：515-520.
2 Leong AS. Microwaves in diagnostic immunohistochemistry. Eur J Morphol, 1996, 34：381-383.
3 马大烈，詹洲，黄玲.快速微波免疫组织化学染色技术.中华病理学杂志，1992；21：56.
(收稿：1997-02-05 修回：1997-11-04), http://www.100md.com
单位：200433 上海第二军医大学长海医院病理科
关键词：
EnVision是DAKO公司最近推出的一种两步法免疫组化新技术 EnVision是DAKO公司最近推出的一种两步法免疫组化新技术，具有简便、特异和敏感等特点。为使该法更具快速，利于临床病理快速诊断。我们将微波技术引入该法中，并应用72种单克隆和多克隆抗体对相应的良、恶性肿瘤进行了常规免疫组化标记，其中24种抗体与标准EnVision法，微波ABC法和SP法对照。结果显示该法是一种更快速而有效的方法，有着广阔的应用前景。
一、材料和方法
1.组织标本：本科1996年8月～1997年6月常规肿瘤活检标本，包括多种上皮源性肿瘤、间叶源性肿瘤、神经源性肿瘤、神经内分泌肿瘤和淋巴瘤等。所有标本均经10%中性福马林微波固定5分钟。常规脱水和石蜡包埋切片(厚4 μm)。
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2.试剂：72种单克隆和多克隆抗体购自DAKO、Sigma、Zymed、Santa Cruz等公司。EnVision为DAKO公司产品。ABC和SP试剂分别来自Vector和Zymed公司。
3.微波仪：ZD-Ⅱ医用微波仪(上海中达医学应用研究所生产)。
4.操作方法：组织切片常规脱蜡至水。微波抗原修复；雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和Ki-67切片入柠檬酸缓冲液95℃，10分钟；其余切片入PBS液80℃，3分钟。冷却后经TBS洗涤。每张切片分别滴加已稀释特异性抗体30～50 μl，微波中功率辐射55秒。PBS洗2分钟×2次 。滴加EnVision复合物30～50 μl，微波中～低功率辐射55秒。PBS洗2分钟×2次。常规DAB-H2O2显色10分钟。苏木素复染，吹干和封片。
附表 微波与标准EnVision方法时间比较
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流程
标准时间
微波法
标准法
抗原修复
5 min
5 min
第一抗体
55 s
30 min
EnVision
55 s
30 min
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DAB-H2O2
10 min
10 min
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图1 结节性肝硬化，肝细胞浆内HBsAg强阳性表达 图2 乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达 图3 乳腺癌，癌细胞浆CA15-3强阳性表达 图4 颈部淋巴瘤，肿瘤细胞核PCNA高度表达 (图1～4均为微波EnVision法×400)
标准EnVision方法：特异性抗体室温孵育30分钟，EnVision试剂室温30分钟，其余步骤与微波法相同。
二、结果
微波EnVision染色结果总体观察，阳性染色较强，阳性颗粒定位性极佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色(图1～4)。部分标记(如L 26、T细胞、PR、ER和Ki-67等)微波法优于标准法，神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)有时则不如标准法强。微波EnVision法标记时间为17分钟，而标准法则需要75分钟(附表)。3种微波免疫组化相比，EnVision法染色最强，敏感性最高，其次为SP法，ABC法则相对较低。非特异背景染色EnVision最低，其次为ABC法，SP法背景稍高一些。就染色步骤而言，此法为两步，其余方法均需三步才能完成。
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三、讨论
本法之所以具有非常高的敏感性除了微波能修复和暴露抗原，在一定程度提高了敏感性外[1，2]，主要是EnVision复合物内含有较多的HRP分子，对抗原有显著的放大作用。采用该法可将第一抗体稀释度提高1～2倍，尤其对抗原表达较弱组织，ER、PR、Ki-67和某些癌基因，该法应视为最理想的方法之一。
由于EnVision复合物内含有多个抗兔或抗鼠IgG，不仅增强了复合物与特异性抗体的结合机会和能力，而且染色步骤只需两步即可完成。此外，抗原抗体反应在微波作用下，使反应速度大为加快，从而降低了非特异性染色反应[3]，因此，除血细胞较丰富的组织和坏死组织外，可省略内源性过氧化物封闭步骤。
该法整个标记流程在17分钟内即可完成，较标准法省时近60分钟，这对于临床快速病理诊断，细胞穿刺和冰冻切片中免疫组化标记具有重要意义。
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在使用该法时，抗原修复除ER、PR、Ki-67等少数几种核抗原外，修复温度不宜过高，在80～90℃为宜，否则会降低染色强度。由于EnVision试剂内蛋白含量较高，易于吸收微波，故应采用中～低功率，并在温盒内放250～300 ml微波吸收介质。
参考文献
1 Brown RW, Chirala R. Utility of microwave-citrate antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol, 1995, 8：515-520.
2 Leong AS. Microwaves in diagnostic immunohistochemistry. Eur J Morphol, 1996, 34：381-383.
3 马大烈，詹洲，黄玲.快速微波免疫组织化学染色技术.中华病理学杂志，1992；21：56.
(收稿：1997-02-05 修回：1997-11-04), http://www.100md.com