建立PCR产物的新检测体系
作者：钟镐镐 衡万杰 吴秉铨
单位：100083 北京医科大学病理学系
关键词：
中华病理学杂志980228 PCR技术，在遗传病的异常基因分析、肿瘤分子标志物的判定以及疾病病原体的检测上已广泛应用。在实践中我们发现有三个问题急待解决：(1)PCR产物的污染；(2)PCR产物自动化的检测手段；(3)PCR模板的定量。我们吸取国内外经验，研究和建立了一种新的PCR检测体系，使之能基本解决上述问题。
一、新检测体系的主要组成
1.在PCR反应体系上：(1)以dUTP代替普通PCR中的dTTP，(2)加入专门识别、切断双链上的dUTP的尿嘧啶N-糖基化酶(Uracil N-Glycosylase)；(3)所应用的特异引物是由生物素(biotin)标记的。
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2.杂交：PCR产物的杂交反应，在已包被特异探针的酶标盘上进行。
3.类似Elisa方法的检测系统：洗去杂交后酶标盘上的游离物质后，将卵白素(avidin)与辣根过氧化物酶的偶联液加入酶标盘，与因杂交而被固定在酶标盘底的biotin相结合，并与过氧化物和麝香草酚蓝(TMB)形成颜色复合物，经酶标仪测吸光度(A，曾称光密度)值定量。
二、操作的具体步骤
1.DNA模板制备：50 μl待检标本与200 μl提取液混匀，60℃ 30分钟，100℃ 30分钟(不能用水浴方式)。
2.PCR扩增：50 μl PCR液(尿嘧啶N-糖基化酶，Bio-引物，AUGC四种碱基，Taq酶，缓冲液)，加入50 μl模板，在50℃停留2分钟(尿嘧啶N-糖基化酶起作用)。随后进行常规PCR循环，但最后的停止温度为72℃(尿嘧啶N-糖基化酶不起作用)。
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3.杂交：(1)在72℃迅速加入变性液100 μl，使残存的尿嘧啶N-糖基化酶来不及识别双链上的DNA时，PCR产物已变性为单链，室温放置10分钟(2～8℃可存放一周)，为杂交做好准备。(2)准备包被好的酶标盘，加入100 μl杂交缓冲液。(3)加入25 μl已变性的PCR产物，37℃ 1小时后，洗液洗5次。(4)加入100 μl偶联液，37℃ 15分钟后，洗液洗5次。
4.显色：(1)加入100 μl底物(过氧化物和TMB)，室温避光10分钟。(2)以100 μl弱酸停止反应，酶标仪450 nm滤光片测A值。
5.RNA模板制备：(1)200 μl待检标本，加入600 μl裂解液，混匀，室温放置10分钟。(2)加入800 μl异丙醇，混匀，离心13 000转，15分钟，弃上清液。(3) 1 ml 70%酒精洗，离心13 000转，5分钟，弃上清液，空气干燥。(4)加入溶解液，待RT-PCR检测。
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三、讨论
1.PCR的污染：PCR的污染曾经困扰了许多使用PCR技术的人，它主要来自四个方面：(1)质粒的污染；(2)噬菌体DNA的污染；(3)待检标本之间的交叉污染；(4)PCR产物的污染。自从认识了PCR的污染源后，为了控制这些污染，制定了一些切断污染途径的严格措施，例如建立不同内容的工作间，严格区分、固定不同工作间的使用工具，一次性的消耗品等。这些措施确实有效地控制了PCR的几种污染源，但对PCR产物的污染(可散落于空气、水中)而造成的假阳性结果，一直没有有效的控制手段，唯一的解救方式只能依靠停止实验室工作2～3个月(甚至更长时间)，以时间的消耗等待PCR产物的降解。
自从在PCR体系中使用了dUTP和尿嘧啶N-糖基化酶，便结束了人工控制PCR产物污染的被动历史。其原理为，在PCR体系中加入尿嘧啶N-糖基化酶，并以dUTP代替dTTP，这样使得扩增的试管中除了原始模板，合成的PCR产物均由AUCG四种碱基组成。尿嘧啶N-糖基化酶可在特定的温度下专门识别并切掉双链DNA上的dUTP(单链则不识别)，使进入待检标本中的PCR产物因失去了dUTP而断链，断链的DNA当然不能再作为模板被扩增了。作为防污染的手段，对于大量检测同种病原体的实验室尤为有效和重要。当然，PCR污染不仅仅是产物的污染，其他的污染方式仍需使用严格的操作来阻断污染源。
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2.PCR产物的自动化检测手段：PCR扩增技术基本完成了自动化，但检测PCR产物的手段一直采用的是电泳方法，这种传统的手工操作，虽然在以PCR为手段的科研工作上一直沿用，但在大量的临床检测工作中就显得繁琐费时和较易受人为因素的影响。并且，以肉眼观察电泳结果，无法进行定量工作。新的检测方法中，使用酶标仪得到具体数据，如果再用已知拷贝数的模板作阳性内参照，PCR产物经酶标仪读数，通过公式计算可得到每毫升待检标本中的靶基因数。PCR定量在临床工作中尤其显得重要，相对精确地测量到病人血中致病因子的含量，可以在五个方面发挥重要作用：(1)判断药物治疗的疗效；(2)监视疾病的进展；(3)观察疫苗的效果；(4)作为耐药的标志物；(5)研究致病因子的传递，如母婴传播。
PCR产物新检测体系的应用已显示出优越性，它操作简单、省时，全过程只需6～7小时，尤其适用于临床检测大量同种靶基因。使用的所有试剂均可在2～8℃存放3～6个月。整个过程中每个标本加液最低量为25 μl，最大限度减少了人操作造成的误差，有效地防止了PCR产物的污染。已达到了PCR定量的基本目的。
(收稿：1997-07-31), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学病理学系
关键词：
中华病理学杂志980228 PCR技术，在遗传病的异常基因分析、肿瘤分子标志物的判定以及疾病病原体的检测上已广泛应用。在实践中我们发现有三个问题急待解决：(1)PCR产物的污染；(2)PCR产物自动化的检测手段；(3)PCR模板的定量。我们吸取国内外经验，研究和建立了一种新的PCR检测体系，使之能基本解决上述问题。
一、新检测体系的主要组成
1.在PCR反应体系上：(1)以dUTP代替普通PCR中的dTTP，(2)加入专门识别、切断双链上的dUTP的尿嘧啶N-糖基化酶(Uracil N-Glycosylase)；(3)所应用的特异引物是由生物素(biotin)标记的。
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2.杂交：PCR产物的杂交反应，在已包被特异探针的酶标盘上进行。
3.类似Elisa方法的检测系统：洗去杂交后酶标盘上的游离物质后，将卵白素(avidin)与辣根过氧化物酶的偶联液加入酶标盘，与因杂交而被固定在酶标盘底的biotin相结合，并与过氧化物和麝香草酚蓝(TMB)形成颜色复合物，经酶标仪测吸光度(A，曾称光密度)值定量。
二、操作的具体步骤
1.DNA模板制备：50 μl待检标本与200 μl提取液混匀，60℃ 30分钟，100℃ 30分钟(不能用水浴方式)。
2.PCR扩增：50 μl PCR液(尿嘧啶N-糖基化酶，Bio-引物，AUGC四种碱基，Taq酶，缓冲液)，加入50 μl模板，在50℃停留2分钟(尿嘧啶N-糖基化酶起作用)。随后进行常规PCR循环，但最后的停止温度为72℃(尿嘧啶N-糖基化酶不起作用)。
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3.杂交：(1)在72℃迅速加入变性液100 μl，使残存的尿嘧啶N-糖基化酶来不及识别双链上的DNA时，PCR产物已变性为单链，室温放置10分钟(2～8℃可存放一周)，为杂交做好准备。(2)准备包被好的酶标盘，加入100 μl杂交缓冲液。(3)加入25 μl已变性的PCR产物，37℃ 1小时后，洗液洗5次。(4)加入100 μl偶联液，37℃ 15分钟后，洗液洗5次。
4.显色：(1)加入100 μl底物(过氧化物和TMB)，室温避光10分钟。(2)以100 μl弱酸停止反应，酶标仪450 nm滤光片测A值。
5.RNA模板制备：(1)200 μl待检标本，加入600 μl裂解液，混匀，室温放置10分钟。(2)加入800 μl异丙醇，混匀，离心13 000转，15分钟，弃上清液。(3) 1 ml 70%酒精洗，离心13 000转，5分钟，弃上清液，空气干燥。(4)加入溶解液，待RT-PCR检测。
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三、讨论
1.PCR的污染：PCR的污染曾经困扰了许多使用PCR技术的人，它主要来自四个方面：(1)质粒的污染；(2)噬菌体DNA的污染；(3)待检标本之间的交叉污染；(4)PCR产物的污染。自从认识了PCR的污染源后，为了控制这些污染，制定了一些切断污染途径的严格措施，例如建立不同内容的工作间，严格区分、固定不同工作间的使用工具，一次性的消耗品等。这些措施确实有效地控制了PCR的几种污染源，但对PCR产物的污染(可散落于空气、水中)而造成的假阳性结果，一直没有有效的控制手段，唯一的解救方式只能依靠停止实验室工作2～3个月(甚至更长时间)，以时间的消耗等待PCR产物的降解。
自从在PCR体系中使用了dUTP和尿嘧啶N-糖基化酶，便结束了人工控制PCR产物污染的被动历史。其原理为，在PCR体系中加入尿嘧啶N-糖基化酶，并以dUTP代替dTTP，这样使得扩增的试管中除了原始模板，合成的PCR产物均由AUCG四种碱基组成。尿嘧啶N-糖基化酶可在特定的温度下专门识别并切掉双链DNA上的dUTP(单链则不识别)，使进入待检标本中的PCR产物因失去了dUTP而断链，断链的DNA当然不能再作为模板被扩增了。作为防污染的手段，对于大量检测同种病原体的实验室尤为有效和重要。当然，PCR污染不仅仅是产物的污染，其他的污染方式仍需使用严格的操作来阻断污染源。
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2.PCR产物的自动化检测手段：PCR扩增技术基本完成了自动化，但检测PCR产物的手段一直采用的是电泳方法，这种传统的手工操作，虽然在以PCR为手段的科研工作上一直沿用，但在大量的临床检测工作中就显得繁琐费时和较易受人为因素的影响。并且，以肉眼观察电泳结果，无法进行定量工作。新的检测方法中，使用酶标仪得到具体数据，如果再用已知拷贝数的模板作阳性内参照，PCR产物经酶标仪读数，通过公式计算可得到每毫升待检标本中的靶基因数。PCR定量在临床工作中尤其显得重要，相对精确地测量到病人血中致病因子的含量，可以在五个方面发挥重要作用：(1)判断药物治疗的疗效；(2)监视疾病的进展；(3)观察疫苗的效果；(4)作为耐药的标志物；(5)研究致病因子的传递，如母婴传播。
PCR产物新检测体系的应用已显示出优越性，它操作简单、省时，全过程只需6～7小时，尤其适用于临床检测大量同种靶基因。使用的所有试剂均可在2～8℃存放3～6个月。整个过程中每个标本加液最低量为25 μl，最大限度减少了人操作造成的误差，有效地防止了PCR产物的污染。已达到了PCR定量的基本目的。
(收稿：1997-07-31), 百拇医药