诱发大鼠肝癌过程中纤维连接蛋白的变化及其与MAD2的关系
作者：朱虹光 应越英 张月娥 张锦生
单位：200032 上海医科大学基础医学院病理学教研室
关键词：
中华病理学杂志980216 有许多学者观察到，在发生恶性转化的细胞中，其细胞表面纤维连接蛋白(FN)下降或消失。Parsons等发现FN的降解片段恶性疾病相关性DNA结合蛋白2(malignant diseaseassociated DNA-binding protein 2，MAD2)在肿瘤病人血清中升高。我们以二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌，观察肝组织癌变过程中FN和MAD2的动态变化，探讨血浆MAD2上升的病理学基础。
一、材料与方法
1.动物模型：体重110～210 g F-344雄性大鼠由北京中国医学科学院提供清洁级种鼠，本校实验动物房繁殖，(1)实验组120只，腹腔注射DEN(本校生化教研室合成)，200 mg/kg体重；2周后改喂含0.02% 2-乙酰氨基芴(2-AFF，Sigma公司)混合饲料2周，以后喂普通饲料至40周末。在投用2-AAF 1周后，对大鼠行1/3肝切除术，并在第15周加一次DEN腹腔注射(150 mg/kg)。从实验第二周末始，每2周断头处死大鼠4只，取出肝脏，在各叶肝取平均面积为0.5 cm×0.5 cm×3 cm的组织4块，用10%缓冲福马林固定制成蜡块。(2)对照组30只，喂普通饲料，每2周处死2只，处理同上。
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2.血浆MAD2浓度的测定：从实验0周起至30周，每2周在乙醚麻醉下从大鼠尾静脉采血0.4 ml，分离血浆后，经DNA-纤维素层析柱提取(DNA-binding protein，DBP)后，用ELISA法测定MAD2的浓度[1]。
3.免疫组织化学染色：将蜡块切成厚4 μm的连续切片，相邻切片分别作HE染色和FN、MAD2的PAP免疫组化染色[2]。第一抗体参考Parsons法自制[1]。
二、结果
1.大鼠肝脏的形态改变：实验组中因麻醉意外或自行死亡35例未取到肝脏标本，存活者于23周后共发生肝癌32例。切肝前，肝脏无明显变化；切肝1周后，肝脏中出现了大量弥漫分布的灰红色结节，直径1～4 mm之间，以后这种结节逐渐减少，到第15周第二次注射DEN前肉眼已很少见。第二次注射DEN 2周后(实验第17周末)，肝脏内再次出现散在分布的灰白色结节，于实验第23周末开始出现肝癌。所有肝癌均发生于无硬化背景的肝组织中，多为单结节型。对照组大鼠肝脏中无明显病变。
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2.大鼠血浆MAD2的动态变化：实验6周之内，实验组与对照组血浆MAD2浓度差别无显著性(P>0.05)。从第8周末开始实验组血浆MAD2浓度明显上升，其曲线与对照组发生分离(P<0.001)，10周以后上升速度减慢直到18周，20周和22周上升速度又突然加快。而对照组MAD2浓度在6周后基本保持原有水平(附图)。
附图 化学致癌实验大鼠血浆MAD2动态变化
3.大鼠肝脏组织学及免疫组织化学的观察：实验组的大鼠肝脏在诱癌第5周时，肝组织内充满了大量的嗜酸细胞结节、透明细胞结节和混合结节，但这些结节内的细胞核与正常肝细胞相似。以后，大部分结节逐渐向正常肝组织过渡，但仍有少数嗜酸细胞结节持续存在。第二次注射DEN 4周后(诱癌第19周末)，肝组织中原有的嗜酸细胞结节内出现了嗜碱性小细胞增生灶；此外，尚可见到一种胞浆嗜伊红但细胞核大、深染、核膜厚、核仁清晰的嗜酸细胞结节，并出现个别核分裂相。在32例肝癌中，我们参考Edmonson的肝癌4级分类法，根据其分化程度分为3类，即高分化(Ⅰ级)12例，中度分化(Ⅱ、Ⅲ级)15例，低分化(Ⅳ级)5例。在第二次注射DEN出现具有异形细胞核的增生结节以前，肝组织和早期增生结节中FN和MAD2的分布情况一致，均分布于血窦壁和汇管区结缔组织中。在肝癌组织中，FN与MAD2的分布则不一致，在部分高分化肝癌中，窦壁FN仍然阳性，但MAD2已经消失；另外，在12例高分化、15例中度分化、5例低分化肝癌中，分别有3例、9例、4例出现了在正常肝组织中及增生结节中不存在的细胞表面型FN，但细胞表面却无MAD2的存在。细胞表面型FN的出现率与肝癌细胞的分化程度呈负相关(r=-0.988，直线回归)，即分化程度越低，细胞表面型FN的出现率越高。
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三、讨论
1.诱发大鼠肝癌过程中血浆MAD2的动态变化：本结果提示，正是这些性质已经发生了重大变化的增生结节中的肝细胞和癌细胞，造成了第二次血浆MAD2浓度的大幅度上升。MAD2浓度的上升发生在癌前病变向癌转化之际，即发生在大鼠肝脏癌变三阶段，启动(initiation)-促动(promotion)-演进(progression)的最后一个阶段，所以MAD2的应用价值可能存在于血清AFP低度持续阳性的人群中[3]，以用MAD2动态变化来监测、捕捉肝脏癌变的演进阶段，有可能使肝癌的诊断提高到癌前期诊断水平。
2.关于诱发大鼠肝癌过程中组织内FN和MAD2的变化：本实验中肝组织内FN和MAD2的变化有二点：(1)部分肝癌细胞表面出现了细胞表面型FN，这一分布特性在正常肝细胞表面和增生结节的细胞表面从未见到过。肝癌细胞分化越差，细胞表面型FN的出现率越高。这一结果与Okushin等[4]在人肝癌中的发现一致。(2)在正常肝组织和早期增生结节中与FN分布一致的MAD2，在部分晚期结节，特别是在肝癌组织中与FN的分布出现了分离现象。根据Proctor的模式图[5]，可将FN的每个亚基从氨基端到羧基端分为9个功能区域。根据分离MAD2时使用DNA-纤维素层析柱及gelatin-sepharose-4B层析柱的流程[1]，可以推论出MAD2必须同时含有Proctor模式中的第4(DNA-binding)和第2(gelatin-binding)二个功能区域，即MAD2是FN分子中靠近氨基端的片段，而FN分子的与细胞联接功能区却靠近羧基端，因而MAD2应是FN分子上的靠近氨基端一侧的非细胞联接片段。根据上述推论和本实验中发现的肝癌组织中出现FN与MAD2分布不一致的现象，我们认为：正常肝细胞表面可能有极微量的FN完整分子存在，它对维持肝细胞的正常形态及功能发挥着重要的作用。
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本项目受美国中华医学基金会基金资助(基金编号：93583)
参考文献
1 朱虹光，张月娥，张锦生，等.纤维联接蛋白的DNA结合片段的分离及抗体制备.上海医科大学学报，1997，24：49-51.
2 张月娥，张秀荣，朱世能.纤维联接蛋白与组织器官硬化的关系Ⅰ.纤维联接蛋白在正常组织内分布情况.中华病理学杂志，1985，14：95-98.
3 赵景民，翟为溶，张月娥，等.肝细胞癌整合蛋白α5β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志，1997，26：65-69.
4 Okushin H, Yamada G, Nagashima H. Immunohistochemical study of fibronectin, lysozyme, and alpha-fetoprotein (AFP) in human hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Jpn, 1987,22：44-54.
5 Proctor RA. Fibronectin: a brief overview of its structure, function, and physiology. Rev Infect Dis, 1987,9(suppl 4)：s317-321.
(收稿：1996-12-18 修回：1997-10-07), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学基础医学院病理学教研室
关键词：
中华病理学杂志980216 有许多学者观察到，在发生恶性转化的细胞中，其细胞表面纤维连接蛋白(FN)下降或消失。Parsons等发现FN的降解片段恶性疾病相关性DNA结合蛋白2(malignant diseaseassociated DNA-binding protein 2，MAD2)在肿瘤病人血清中升高。我们以二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌，观察肝组织癌变过程中FN和MAD2的动态变化，探讨血浆MAD2上升的病理学基础。
一、材料与方法
1.动物模型：体重110～210 g F-344雄性大鼠由北京中国医学科学院提供清洁级种鼠，本校实验动物房繁殖，(1)实验组120只，腹腔注射DEN(本校生化教研室合成)，200 mg/kg体重；2周后改喂含0.02% 2-乙酰氨基芴(2-AFF，Sigma公司)混合饲料2周，以后喂普通饲料至40周末。在投用2-AAF 1周后，对大鼠行1/3肝切除术，并在第15周加一次DEN腹腔注射(150 mg/kg)。从实验第二周末始，每2周断头处死大鼠4只，取出肝脏，在各叶肝取平均面积为0.5 cm×0.5 cm×3 cm的组织4块，用10%缓冲福马林固定制成蜡块。(2)对照组30只，喂普通饲料，每2周处死2只，处理同上。
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2.血浆MAD2浓度的测定：从实验0周起至30周，每2周在乙醚麻醉下从大鼠尾静脉采血0.4 ml，分离血浆后，经DNA-纤维素层析柱提取(DNA-binding protein，DBP)后，用ELISA法测定MAD2的浓度[1]。
3.免疫组织化学染色：将蜡块切成厚4 μm的连续切片，相邻切片分别作HE染色和FN、MAD2的PAP免疫组化染色[2]。第一抗体参考Parsons法自制[1]。
二、结果
1.大鼠肝脏的形态改变：实验组中因麻醉意外或自行死亡35例未取到肝脏标本，存活者于23周后共发生肝癌32例。切肝前，肝脏无明显变化；切肝1周后，肝脏中出现了大量弥漫分布的灰红色结节，直径1～4 mm之间，以后这种结节逐渐减少，到第15周第二次注射DEN前肉眼已很少见。第二次注射DEN 2周后(实验第17周末)，肝脏内再次出现散在分布的灰白色结节，于实验第23周末开始出现肝癌。所有肝癌均发生于无硬化背景的肝组织中，多为单结节型。对照组大鼠肝脏中无明显病变。
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2.大鼠血浆MAD2的动态变化：实验6周之内，实验组与对照组血浆MAD2浓度差别无显著性(P>0.05)。从第8周末开始实验组血浆MAD2浓度明显上升，其曲线与对照组发生分离(P<0.001)，10周以后上升速度减慢直到18周，20周和22周上升速度又突然加快。而对照组MAD2浓度在6周后基本保持原有水平(附图)。
附图 化学致癌实验大鼠血浆MAD2动态变化
3.大鼠肝脏组织学及免疫组织化学的观察：实验组的大鼠肝脏在诱癌第5周时，肝组织内充满了大量的嗜酸细胞结节、透明细胞结节和混合结节，但这些结节内的细胞核与正常肝细胞相似。以后，大部分结节逐渐向正常肝组织过渡，但仍有少数嗜酸细胞结节持续存在。第二次注射DEN 4周后(诱癌第19周末)，肝组织中原有的嗜酸细胞结节内出现了嗜碱性小细胞增生灶；此外，尚可见到一种胞浆嗜伊红但细胞核大、深染、核膜厚、核仁清晰的嗜酸细胞结节，并出现个别核分裂相。在32例肝癌中，我们参考Edmonson的肝癌4级分类法，根据其分化程度分为3类，即高分化(Ⅰ级)12例，中度分化(Ⅱ、Ⅲ级)15例，低分化(Ⅳ级)5例。在第二次注射DEN出现具有异形细胞核的增生结节以前，肝组织和早期增生结节中FN和MAD2的分布情况一致，均分布于血窦壁和汇管区结缔组织中。在肝癌组织中，FN与MAD2的分布则不一致，在部分高分化肝癌中，窦壁FN仍然阳性，但MAD2已经消失；另外，在12例高分化、15例中度分化、5例低分化肝癌中，分别有3例、9例、4例出现了在正常肝组织中及增生结节中不存在的细胞表面型FN，但细胞表面却无MAD2的存在。细胞表面型FN的出现率与肝癌细胞的分化程度呈负相关(r=-0.988，直线回归)，即分化程度越低，细胞表面型FN的出现率越高。
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三、讨论
1.诱发大鼠肝癌过程中血浆MAD2的动态变化：本结果提示，正是这些性质已经发生了重大变化的增生结节中的肝细胞和癌细胞，造成了第二次血浆MAD2浓度的大幅度上升。MAD2浓度的上升发生在癌前病变向癌转化之际，即发生在大鼠肝脏癌变三阶段，启动(initiation)-促动(promotion)-演进(progression)的最后一个阶段，所以MAD2的应用价值可能存在于血清AFP低度持续阳性的人群中[3]，以用MAD2动态变化来监测、捕捉肝脏癌变的演进阶段，有可能使肝癌的诊断提高到癌前期诊断水平。
2.关于诱发大鼠肝癌过程中组织内FN和MAD2的变化：本实验中肝组织内FN和MAD2的变化有二点：(1)部分肝癌细胞表面出现了细胞表面型FN，这一分布特性在正常肝细胞表面和增生结节的细胞表面从未见到过。肝癌细胞分化越差，细胞表面型FN的出现率越高。这一结果与Okushin等[4]在人肝癌中的发现一致。(2)在正常肝组织和早期增生结节中与FN分布一致的MAD2，在部分晚期结节，特别是在肝癌组织中与FN的分布出现了分离现象。根据Proctor的模式图[5]，可将FN的每个亚基从氨基端到羧基端分为9个功能区域。根据分离MAD2时使用DNA-纤维素层析柱及gelatin-sepharose-4B层析柱的流程[1]，可以推论出MAD2必须同时含有Proctor模式中的第4(DNA-binding)和第2(gelatin-binding)二个功能区域，即MAD2是FN分子中靠近氨基端的片段，而FN分子的与细胞联接功能区却靠近羧基端，因而MAD2应是FN分子上的靠近氨基端一侧的非细胞联接片段。根据上述推论和本实验中发现的肝癌组织中出现FN与MAD2分布不一致的现象，我们认为：正常肝细胞表面可能有极微量的FN完整分子存在，它对维持肝细胞的正常形态及功能发挥着重要的作用。
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本项目受美国中华医学基金会基金资助(基金编号：93583)
参考文献
1 朱虹光，张月娥，张锦生，等.纤维联接蛋白的DNA结合片段的分离及抗体制备.上海医科大学学报，1997，24：49-51.
2 张月娥，张秀荣，朱世能.纤维联接蛋白与组织器官硬化的关系Ⅰ.纤维联接蛋白在正常组织内分布情况.中华病理学杂志，1985，14：95-98.
3 赵景民，翟为溶，张月娥，等.肝细胞癌整合蛋白α5β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志，1997，26：65-69.
4 Okushin H, Yamada G, Nagashima H. Immunohistochemical study of fibronectin, lysozyme, and alpha-fetoprotein (AFP) in human hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Jpn, 1987,22：44-54.
5 Proctor RA. Fibronectin: a brief overview of its structure, function, and physiology. Rev Infect Dis, 1987,9(suppl 4)：s317-321.
(收稿：1996-12-18 修回：1997-10-07), 百拇医药