横纹肌肉瘤中MDM2及p53基因表达的原位杂交检测
作者：赖日权 王卓才 折晓宁 李素凤 赖晃文 田野
单位：510010 广州军区广州总医院病理科[赖日权、王卓才、折晓宁、李素凤(后两位作者现在北京协和医院病理科 )、赖晃文、田野]
关键词：横纹肌肉瘤；基因，p53；原位杂交
中华病理学杂志980213 【摘要】 目的 观察MDM2、p53癌基因在横纹肌肉瘤(RMS)发病中的作用及其与临床病理、预后间的关系。方法 对确诊并有随访的31例RMS标本，用原位杂交技术进行MDM2、p53定位观察。结果 发现MDM2及p53癌基因表达阳性率分别为77.4%(24/31例)和66.7%(21/31例)，其阳性率与年龄、性别和RMS组织类型无明显关联(P>0.05)，但阳性率及其强度与RMS分化程度(Ⅰ级与Ⅲ级)，转移与否及存活率差异有显著性(P<0.05)。结论 MDM2、p53阳性检出率有助于判断RMS恶性程度及预测肿瘤的转移和预后。
, 百拇医药
Detection of MDM2 and p53 genes in rhabdomyosarcoma by in situ hybridization Lai Riquan, Wang Zhuocai, Zhe Xiaoning, et al. Department of Pathology, Guangzhou General Hospital of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To observe the correlation between MDM2, p53 genes and the pathogenesis, clinical pathology and prognosis in rhabdomyosarcoma (RMS).Methods Thirty one cases of MRS with follow-up history were covered for this study. MDM2 and p53 genes were detected by digoxigenin labeling in situ hybridizationtechnique.Results The positive rates for MDM2 and p53 genes were 77.4% (24/31) and 66.7%(21/31) respectively, regardless of age, sex and the histologioal typing of RMS, but there was remarkalbe difference in the positive rates and intensity between the well and poorly differentiated cases, metastastic and non-metastic cases as well as one year and three years survival period (P<0.05).Conclusions The detection of MDM2 and p53 gene is considered valuable in evaluating the maligant degree, predictable metastasis and prognosis of RMS.
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【Key words】 Rhabdomyosarcoma Genes, p53 In situ hybridization
我们曾用免疫组织化学方法对横纹肌肉瘤(RMS)中p53蛋白产物进行检测[1]。在此基础上，我们用原位杂交技术定位检测MDM2及p53在不同组织类型，不同分化程度的RMS中的分布，旨在探讨MDM2及p53癌基因mRNA水平上的表达在RMS发生过程中的变化规律及其与预后间的关系。
材料与方法
1.31例RMS取自作者已作研究并有随访的病例[1]。年龄最小1.5岁，最大42岁，平均14.7岁；男17例，女14例；其中胚胎型(ERMS)13例，葡萄状(bRMS)6例，腺泡状(ARMS)8例，多形性(PRMS)4例。分化程度：低分化(Ⅲ级)9例，中分化(Ⅱ级)14例，高分化(Ⅰ级)8例。有转移16例，无转移15例。随访小于1年13例，随访1～3年10例，随访大于3年8例。
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2.50例石蜡包埋RMS组织，常规HE染色，对其中31例已做p53蛋白免疫组化检测(20例阳性，11例阴性)的组织块，再做5 μm连续切片，分别用于MDM2及p53癌基因表达的原位杂交检测。取尸体解剖中正常横纹肌组织作阴性对照。
3.探针制备：MDM2及p53 cDNA探针由北京协和医院病理科提供。
4.原位杂交：具体步骤参照张雷等[2]方法。地高辛标记及检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。
结果
1.用MDM2及p53探针对31例不同部位的RMS石蜡包埋组织切片进行原位杂交，结果如下：MDM2表达阳性为24例(77.4%)，p53表达阳性为21例(67.7%)，阳性信号为紫蓝色颗粒或斑块，在RMS组织中呈弥漫片状或灶状分布，主要位于细胞核内，胞浆轻度着色(图1，2)。根据阳性细胞数，对阳性细胞进行半定量分级，每张切片中阳性细胞小于25%为：(+)，26%～49%为：(++)，大于50%为(+++)，并进行统计学分析。
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图1 分化差的胚胎性横纹肌肉瘤MDM2，强阳性信号见于瘤细胞核中，胞浆淡染 原位杂交×300 图2 分化差的腺泡状横纹肌肉瘤MDM2，阳性信号见于瘤细胞核中，胞浆淡染 原位杂交×300 MDM2及p53阳性信号强度：在8例高分化RMS组织中，+均为3例++分别为2例和1例，+++均为0；在9例低分化RMS组织中，阳性信号强度+均为0，++均为3例，+++均为6例。分化越差，阳性检出率越高，Ⅲ级与Ⅰ级相比，阳性检出率差异有显著性(P<0.05)。结果表明，MDM2及p53癌基因表达的阳性率虽在ARMS型中较高，但与其它类型相比，统计学差异并无显著性(P>0.05)，而与分化程度有关。
2.原位杂交MDM2及p53阳性检出率与肿瘤转移和预后的关系：本组31例RMS中，16例有血道和淋巴道转移，其MDM2及p53癌基因表达的阳性率均为93.8%，而无转移组15例中的MDM2及p53表达阳性率分别为60%和40%，两组间差异有显著性(P<0.05)；在31例RMS中，存活1年以内的病例其MDM2及p53表达阳性率均为84.6%，而存活3年以上的病例中，MDM2及p53表达阳性率分别为37.5%和25.0%，两组间差异有显著性(P<0.05)。
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3.在31例RMS中，MDM2及p53癌基因表达同时阳性为17例，占54.8%，同时阴性为3例，占9.7%，但在10例p53表达阴性的病例中，仍有7例MDM2表达呈阳性，表明RMS中MDM2及p53表达阳性率呈正相关，但MDM2癌基因表达阳性率高于p53癌基因。
4.正常横纹肌纤维及肿瘤旁组织的细胞核内有MDM2微弱阳性信号，而p53均为阴性。
讨论
MDM2癌基因位于染色体12q13-14，正常情况下横纹肌组织有一定量的MDM2表达，最近研究发现其在恶性肿瘤中有明显的扩增和表达，其表达产物p90与p53蛋白结合，使p53功能受到抑制或完全失活，促使肿瘤的发生和发展。近年来有研究表明，MDM2在一些软组织肉瘤中的扩增和表达与肿瘤的转移、复发有关[3～5]，但对MDM2与RMS的关系报告尚少。我们应用原位杂交方法对31例不同部位和不同组织类型的RMS进行检测，结果发现MDM2及p53基因表达与患者年龄，性别，肿瘤部位和组织学类型无明显关联(P>0.05)，而与肿瘤组织分化程度有关，低分化与高分化RMS的MDM2及p53表达阳性率之间差异有显著性(P<0.05)；阳性信号强度与分化程度密切相关，分化越低，阳性信号强度越高。阳性病例中阳性信号主要在分化差的幼稚细胞中，这可能是肿瘤细胞停滞于胚胎发育过程中的某一阶段，致使肿瘤细胞失去向横纹肌组织分化的能力，因而异常增生而形成肿瘤。我们也发现MDM2及p53表达阳性率及表达强度与肿瘤转移和低生存率呈正相关(P<0.05)，即阳性信号越强，肿瘤分化越差，转移率越高，存活期越短。此结果与Cordon-Cardo[4]关于成人软组织肉瘤的研究结果相似，提示其可作为判断MRS恶性程度及预后的指标之一。
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MDM2在肿瘤旁以及正常横纹肌纤维中有散在的微弱阳性信号，而p53均为阴性。与其明显不同的是，MDM2及p53两者在RMS中均有较高的表达，即使是在p53表达阴性的10例RMS中，仍有7例MDM2表达为阳性。阳性信号主要分布于分化较差，预后不良的肉瘤病例中，说明MDM2基因表达可能与横纹肌组织损伤，修复，增生有关。正常情况下MDM2基因处于被抑制状态，细胞失去增殖能力，而p53基因通过细胞增殖周期G1-S期旁路调节细胞增殖[6]，它在正常生理情况下起到抑制癌基因功能的作用，p53基因突变后，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表达相应蛋白p90，通过与p53蛋白结合，进一步使p53功能丧失，p53抑癌基因的失活及原癌基因MDM2的激活促使组织细胞停留于某一阶段并异常增殖，从而导致肿瘤的发生。
我们应用原位杂交方法检测p53表达阳性率为67.4%，作者以往[1]用免疫组化方法检测p53蛋白表达阳性率为72%，两组结果基本相符，但高于作者曾用PCR-SSCP法检测p53基因5～8外显子的基因突变率(23.6%的病例出现异常泳动带)，也高于Wurl等[7]用同样方法检测的26例肌源性肉瘤中p53突变率为23%，而Felix等[8]用cDNA探针做原位杂交发现6例RMS中有2例发生p53基因突变，5例RMS细胞株中有3株发现p53基因突变，总突变率为45.6%，与本文结果较为接近。应用cDNA探针进行原位杂交检测，不仅反映出p53突变型mRNA，而且也检测出仅占少量的野生型mRNA，而PCR-SSCP法仅检测p53基因5～8外显子的突变状况，这可能是PCR-SSCP法检测阳性率偏低的原因之一，同时，不同作者的检测手段、方法、条件、试剂好坏及标本保存方式及时间长短均对阳性检出率有一定影响。本实验应用原位杂交方法检测MDM2表达阳性率为77.4%，高于其它作者对MDM2扩增状况的检测结果，Oliner等[3]在47例肉瘤中检测发现有17例(36.3%)出现MDM2基因扩增，Reifenberger等[5]在人脑胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤中发现有8%～10%出现MDM2基因扩增，这与文献中报道的MDM2 mRNA或蛋白水平的表达不一定依赖于MDM2基因扩增这一结论是一致的。
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参考文献
1 赖日权，罗祝泉，安建成，等.p53、p21、p185蛋白表达横纹肉瘤分化及预后关系.中华病理学杂志，1997，26：35-37.
2 张雷，刘鸿瑞，王志永，等.肺癌中EB病毒的原位杂交检测.中华病理学杂志，1996，25：1-3.
3 Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, et al. Amplification of a gene encoding a p53-assocciated prostein in human sarcomas. Nature, 1992,358：80-83.
4 Cordon-Cardo C, Latres E, Drobnjak M, et al. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res, 1994,54：794-799.
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5 Reifenberger G, Liu L, Ichmura K, et al. Amplification and overexepression of the MDM2 gene in a subset of human malignat gliomas without p53 mutationns. Cancer Res，1993,53：2735-2739.
6 Meltzer PS. MDM2 and p53: a question of balance.J Nati Cancer Inst, 1994,86：1265-1266.
7 Wurl P, Taubert H. Bache M, et al. Fregaent occurrence of p53 mutations in rhabdomyosarcoma and leiomyosarcoma，but not in fibrosarcoma and malignant neural tumors. Int J Cancer, 1996,69：314-323.
8 Felix CA, Kapple CC, Mitsudomi T, et al. Freguency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma. Cancer Res, 1992,52：2243-2247.
(收稿：1997-06-19 修回：1997-12-12), http://www.100md.com
单位：510010 广州军区广州总医院病理科[赖日权、王卓才、折晓宁、李素凤(后两位作者现在北京协和医院病理科 )、赖晃文、田野]
关键词：横纹肌肉瘤；基因，p53；原位杂交
中华病理学杂志980213 【摘要】 目的 观察MDM2、p53癌基因在横纹肌肉瘤(RMS)发病中的作用及其与临床病理、预后间的关系。方法 对确诊并有随访的31例RMS标本，用原位杂交技术进行MDM2、p53定位观察。结果 发现MDM2及p53癌基因表达阳性率分别为77.4%(24/31例)和66.7%(21/31例)，其阳性率与年龄、性别和RMS组织类型无明显关联(P>0.05)，但阳性率及其强度与RMS分化程度(Ⅰ级与Ⅲ级)，转移与否及存活率差异有显著性(P<0.05)。结论 MDM2、p53阳性检出率有助于判断RMS恶性程度及预测肿瘤的转移和预后。
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Detection of MDM2 and p53 genes in rhabdomyosarcoma by in situ hybridization Lai Riquan, Wang Zhuocai, Zhe Xiaoning, et al. Department of Pathology, Guangzhou General Hospital of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To observe the correlation between MDM2, p53 genes and the pathogenesis, clinical pathology and prognosis in rhabdomyosarcoma (RMS).Methods Thirty one cases of MRS with follow-up history were covered for this study. MDM2 and p53 genes were detected by digoxigenin labeling in situ hybridizationtechnique.Results The positive rates for MDM2 and p53 genes were 77.4% (24/31) and 66.7%(21/31) respectively, regardless of age, sex and the histologioal typing of RMS, but there was remarkalbe difference in the positive rates and intensity between the well and poorly differentiated cases, metastastic and non-metastic cases as well as one year and three years survival period (P<0.05).Conclusions The detection of MDM2 and p53 gene is considered valuable in evaluating the maligant degree, predictable metastasis and prognosis of RMS.
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【Key words】 Rhabdomyosarcoma Genes, p53 In situ hybridization
我们曾用免疫组织化学方法对横纹肌肉瘤(RMS)中p53蛋白产物进行检测[1]。在此基础上，我们用原位杂交技术定位检测MDM2及p53在不同组织类型，不同分化程度的RMS中的分布，旨在探讨MDM2及p53癌基因mRNA水平上的表达在RMS发生过程中的变化规律及其与预后间的关系。
材料与方法
1.31例RMS取自作者已作研究并有随访的病例[1]。年龄最小1.5岁，最大42岁，平均14.7岁；男17例，女14例；其中胚胎型(ERMS)13例，葡萄状(bRMS)6例，腺泡状(ARMS)8例，多形性(PRMS)4例。分化程度：低分化(Ⅲ级)9例，中分化(Ⅱ级)14例，高分化(Ⅰ级)8例。有转移16例，无转移15例。随访小于1年13例，随访1～3年10例，随访大于3年8例。
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2.50例石蜡包埋RMS组织，常规HE染色，对其中31例已做p53蛋白免疫组化检测(20例阳性，11例阴性)的组织块，再做5 μm连续切片，分别用于MDM2及p53癌基因表达的原位杂交检测。取尸体解剖中正常横纹肌组织作阴性对照。
3.探针制备：MDM2及p53 cDNA探针由北京协和医院病理科提供。
4.原位杂交：具体步骤参照张雷等[2]方法。地高辛标记及检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。
结果
1.用MDM2及p53探针对31例不同部位的RMS石蜡包埋组织切片进行原位杂交，结果如下：MDM2表达阳性为24例(77.4%)，p53表达阳性为21例(67.7%)，阳性信号为紫蓝色颗粒或斑块，在RMS组织中呈弥漫片状或灶状分布，主要位于细胞核内，胞浆轻度着色(图1，2)。根据阳性细胞数，对阳性细胞进行半定量分级，每张切片中阳性细胞小于25%为：(+)，26%～49%为：(++)，大于50%为(+++)，并进行统计学分析。
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图1 分化差的胚胎性横纹肌肉瘤MDM2，强阳性信号见于瘤细胞核中，胞浆淡染 原位杂交×300 图2 分化差的腺泡状横纹肌肉瘤MDM2，阳性信号见于瘤细胞核中，胞浆淡染 原位杂交×300 MDM2及p53阳性信号强度：在8例高分化RMS组织中，+均为3例++分别为2例和1例，+++均为0；在9例低分化RMS组织中，阳性信号强度+均为0，++均为3例，+++均为6例。分化越差，阳性检出率越高，Ⅲ级与Ⅰ级相比，阳性检出率差异有显著性(P<0.05)。结果表明，MDM2及p53癌基因表达的阳性率虽在ARMS型中较高，但与其它类型相比，统计学差异并无显著性(P>0.05)，而与分化程度有关。
2.原位杂交MDM2及p53阳性检出率与肿瘤转移和预后的关系：本组31例RMS中，16例有血道和淋巴道转移，其MDM2及p53癌基因表达的阳性率均为93.8%，而无转移组15例中的MDM2及p53表达阳性率分别为60%和40%，两组间差异有显著性(P<0.05)；在31例RMS中，存活1年以内的病例其MDM2及p53表达阳性率均为84.6%，而存活3年以上的病例中，MDM2及p53表达阳性率分别为37.5%和25.0%，两组间差异有显著性(P<0.05)。
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3.在31例RMS中，MDM2及p53癌基因表达同时阳性为17例，占54.8%，同时阴性为3例，占9.7%，但在10例p53表达阴性的病例中，仍有7例MDM2表达呈阳性，表明RMS中MDM2及p53表达阳性率呈正相关，但MDM2癌基因表达阳性率高于p53癌基因。
4.正常横纹肌纤维及肿瘤旁组织的细胞核内有MDM2微弱阳性信号，而p53均为阴性。
讨论
MDM2癌基因位于染色体12q13-14，正常情况下横纹肌组织有一定量的MDM2表达，最近研究发现其在恶性肿瘤中有明显的扩增和表达，其表达产物p90与p53蛋白结合，使p53功能受到抑制或完全失活，促使肿瘤的发生和发展。近年来有研究表明，MDM2在一些软组织肉瘤中的扩增和表达与肿瘤的转移、复发有关[3～5]，但对MDM2与RMS的关系报告尚少。我们应用原位杂交方法对31例不同部位和不同组织类型的RMS进行检测，结果发现MDM2及p53基因表达与患者年龄，性别，肿瘤部位和组织学类型无明显关联(P>0.05)，而与肿瘤组织分化程度有关，低分化与高分化RMS的MDM2及p53表达阳性率之间差异有显著性(P<0.05)；阳性信号强度与分化程度密切相关，分化越低，阳性信号强度越高。阳性病例中阳性信号主要在分化差的幼稚细胞中，这可能是肿瘤细胞停滞于胚胎发育过程中的某一阶段，致使肿瘤细胞失去向横纹肌组织分化的能力，因而异常增生而形成肿瘤。我们也发现MDM2及p53表达阳性率及表达强度与肿瘤转移和低生存率呈正相关(P<0.05)，即阳性信号越强，肿瘤分化越差，转移率越高，存活期越短。此结果与Cordon-Cardo[4]关于成人软组织肉瘤的研究结果相似，提示其可作为判断MRS恶性程度及预后的指标之一。
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MDM2在肿瘤旁以及正常横纹肌纤维中有散在的微弱阳性信号，而p53均为阴性。与其明显不同的是，MDM2及p53两者在RMS中均有较高的表达，即使是在p53表达阴性的10例RMS中，仍有7例MDM2表达为阳性。阳性信号主要分布于分化较差，预后不良的肉瘤病例中，说明MDM2基因表达可能与横纹肌组织损伤，修复，增生有关。正常情况下MDM2基因处于被抑制状态，细胞失去增殖能力，而p53基因通过细胞增殖周期G1-S期旁路调节细胞增殖[6]，它在正常生理情况下起到抑制癌基因功能的作用，p53基因突变后，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表达相应蛋白p90，通过与p53蛋白结合，进一步使p53功能丧失，p53抑癌基因的失活及原癌基因MDM2的激活促使组织细胞停留于某一阶段并异常增殖，从而导致肿瘤的发生。
我们应用原位杂交方法检测p53表达阳性率为67.4%，作者以往[1]用免疫组化方法检测p53蛋白表达阳性率为72%，两组结果基本相符，但高于作者曾用PCR-SSCP法检测p53基因5～8外显子的基因突变率(23.6%的病例出现异常泳动带)，也高于Wurl等[7]用同样方法检测的26例肌源性肉瘤中p53突变率为23%，而Felix等[8]用cDNA探针做原位杂交发现6例RMS中有2例发生p53基因突变，5例RMS细胞株中有3株发现p53基因突变，总突变率为45.6%，与本文结果较为接近。应用cDNA探针进行原位杂交检测，不仅反映出p53突变型mRNA，而且也检测出仅占少量的野生型mRNA，而PCR-SSCP法仅检测p53基因5～8外显子的突变状况，这可能是PCR-SSCP法检测阳性率偏低的原因之一，同时，不同作者的检测手段、方法、条件、试剂好坏及标本保存方式及时间长短均对阳性检出率有一定影响。本实验应用原位杂交方法检测MDM2表达阳性率为77.4%，高于其它作者对MDM2扩增状况的检测结果，Oliner等[3]在47例肉瘤中检测发现有17例(36.3%)出现MDM2基因扩增，Reifenberger等[5]在人脑胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤中发现有8%～10%出现MDM2基因扩增，这与文献中报道的MDM2 mRNA或蛋白水平的表达不一定依赖于MDM2基因扩增这一结论是一致的。
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参考文献
1 赖日权，罗祝泉，安建成，等.p53、p21、p185蛋白表达横纹肉瘤分化及预后关系.中华病理学杂志，1997，26：35-37.
2 张雷，刘鸿瑞，王志永，等.肺癌中EB病毒的原位杂交检测.中华病理学杂志，1996，25：1-3.
3 Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, et al. Amplification of a gene encoding a p53-assocciated prostein in human sarcomas. Nature, 1992,358：80-83.
4 Cordon-Cardo C, Latres E, Drobnjak M, et al. Molecular abnormalities of mdm2 and p53 genes in adult soft tissue sarcomas. Cancer Res, 1994,54：794-799.
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5 Reifenberger G, Liu L, Ichmura K, et al. Amplification and overexepression of the MDM2 gene in a subset of human malignat gliomas without p53 mutationns. Cancer Res，1993,53：2735-2739.
6 Meltzer PS. MDM2 and p53: a question of balance.J Nati Cancer Inst, 1994,86：1265-1266.
7 Wurl P, Taubert H. Bache M, et al. Fregaent occurrence of p53 mutations in rhabdomyosarcoma and leiomyosarcoma，but not in fibrosarcoma and malignant neural tumors. Int J Cancer, 1996,69：314-323.
8 Felix CA, Kapple CC, Mitsudomi T, et al. Freguency and diversity of p53 mutations in childhood rhabdomyosarcoma. Cancer Res, 1992,52：2243-2247.
(收稿：1997-06-19 修回：1997-12-12), http://www.100md.com