肝细胞代偿性增生对二甲基亚硝胺致癌作用的影响
作者：陈旦洋 严瑞琪 叶燕丽 王莲桂 冯启胜 周昕熙
单位：510060 广州，中山医科大学肿瘤研究所病理研究室
关键词：肝肿瘤，实验性；增生；二甲基亚硝胺
中华病理学杂志980207 【摘要】 目的 探讨肝细胞代偿性增生对二甲基亚硝胺(NDMA)致大鼠肿瘤作用的影响。方法 对照组用NDMA处理，实验组首次NDMA处理前24小时行部分肝切除术。观察肿瘤发生情况及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GSTP)、增殖细胞核抗原(PCNA)和癌基因的表达。结果 实验组肝脏GGT和 GSTP灶的数量和面积高于对照组，GSTP的表达高于GGT，肾癌变过程中见GSTP的表达。实验组第56周肿瘤总发生率和第71周肿瘤总发生率及肝、肾肿瘤发生率高于对照组。PCNA阳性细胞数量与肝病变组织的增殖情况一致。胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)与c-myc、H-ras mRNA的表达在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和腺瘤较弱，肝组织未见c-jun mRNA表达。结论 肝细胞代偿性增生促进多次低剂量NDMA的致癌作用。IGF-Ⅱ与c-myc、H-ras 基因产物的过量表达在肝癌发生、发展中可能具有协同作用。
, 百拇医药
Influence of compensatory hepatocyte proliferation on the carcinogenesis of N-nitrosodimethylamine Chen Danyang, Yan Ruiqi, Ye Yanli, et al. Cancer Institute, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective To study the influence of compensatory hepatocyte proliferation on the N-nitrosodimethylamine (NDMA) carcinogenesis in rats. Methods NDMA was given to animals of the experimental group 24 hours after partial hepatectomy, and the control group was only treated with NDMA. Expression of γ-glutamyltransferase (GGT), glutathione S-transferase placental form (GSTP), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), insulin-like growth factor-Ⅱ (IGF-Ⅱ) and oncogenes was detected. Results The numbers and areas of GGT - and GSTP-foci in the experimental group were significantly increased in comparing with the control groups. The expression of GSTP was higher than that of GGT. The total tumor incidence of the experimental group was higher than that of the control by the end of the 56th week. Up to week 71, the incidnces of liver and other tumors were higher respectively in the experimental group. The amount of PCNA positive cells were corresponding with proliferative condition of the hepatic lesions. The expression of IGF-Ⅱ ,c-myc and H-ras mRNA increased in the altered hepatocyte foci and nodules, but markedly decreased in hepatocellular carcinoma and adenoma. No c-jun mRNA expression was detected in all the normal and abnormal tissues of liver. Conclusions The results suggest that compensatory hepatocyte proliferation enhances the carcinogenesis induced by multiple doses of NDMA, and the over expression of IGF-Ⅱ, c-myc, H-ras may play a synergetic role in NDMA-induced hepatocarcinogenesis.
, 百拇医药
【Key words】 Liver neoplasms, experimental Hyperplasia Dimethylnitrosamine
二甲基亚硝胺(NDMA)普遍存在于环境中，可能是肝癌等肿瘤的致病因素之一。人类在生物和化学等因素作用下可出现肝损伤后的代偿性增生过程，且不可避免地经常接触NDMA等环境致癌物。因此，模拟人类肿瘤发生情况，观察在肝细胞代偿性增生状况下长期接触低剂量NDMA后肿瘤发生的情况是必要的，目前尚缺乏此类研究。我们对此作了探讨并研究了NDMA致癌过程中标记酶和多种癌基因表达的变化。
材料与方法
1.材料：清洁级SD大鼠由本校实验动物中心提供。NDMA为Sigma公司产品。兔抗大鼠胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GSTP)抗体为Bioprep公司产品。猪抗兔免疫球蛋白和兔过氧化物酶抗过氧化物酶为DAKO公司产品。 小鼠抗大鼠胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)单克隆抗体为Uptate Biotechnology公司产品。 Immunostain SP试剂盒为Maxin公司产品。电脑化图形扫描分析系统，自行装配。用随机引物生物素标记法标记的c-myc、H-ras、c-jun cDNA探针，购自北京中山生物技术有限公司。
, http://www.100md.com
2.动物实验：雄性SD大鼠(73～120g)81只，置清洁级动物实验室饲养，随机分两组。对照组：40只，腹腔注射每次NDMA 6mg/kg体重，每周2次，共28次；实验组：41只，首次腹腔注射NDMA前24小时行部分肝切除术(PH)，NDMA给药方法同对照组。以实验观察期间发现首例肿瘤时存活的动物数为有效动物数。在实验第56和71周二组分别处死一批动物，取肝、肾、肺和疑有肿瘤的其它组织，用10%中性福马林和冷酒精、丙酮溶液固定。
3.形态学观察：肿瘤的组织学分类参照文献[1，2]进行。统计学方法为χ2检验或四格表的确切概率法。
4.γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、GSTP的检测和图像分析：GGT和GSTP的检测分别用组化和PAP法，参考文献[3，4]方法进行。图像分析方法：将切片放大10倍并将图形描绘在复印纸上；镜下观察切片以核对所绘制图形的准确性；用扫描仪将图形按1∶1扫描；用电子计算机测出平均每cm2肝切面中，GGT和GSTP灶的灶数(个/cm2)、灶面积(mm2/cm2)以及灶平均面积(mm2/个)。统计学方法为t检验。
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5.增殖细胞核抗原(PCNA)和IGF-Ⅱ的检测，用LSAB法，按说明书操作和判定结果。
6.c-myc、H-ras和c-jun mRNA检测：用c-DNA-RNA原位杂交技术。 结果
1.形态观察和肿瘤发生情况：各组动物肿瘤发生率、各类型肿瘤及其发生情况见表1～3和图1。
表1 各组动物肿瘤发生情况 组别
有效
动物
数(只)
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
, http://www.100md.com
肝脏
肾脏
肺脏
皮下结
缔组织
原发
转移
56周
对照组
9
0
0
0
0
, http://www.100md.com
0
0
实验组
11
4
2
0
1a
0
54.5*
71周
对照组
30
, 百拇医药
2
4b
2
0
0
26.7
实验组
26
9
11c
1
1a
2d
, 百拇医药
69.2**
注：a：肺转移性肾腺瘤；b：其中1例出现左、右肾肿瘤；c：其中1例出现2种类型肾肿瘤，3例同时出现肝肿瘤；d：为纤维瘤和纤维肉瘤，其中1例同时出现肝肿瘤，1例同时出现肾肿瘤.* P<0.05，** P<0.005表2 各组动物肝脏肿瘤发生情况 组别
动物
数(只)
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
肝细胞
腺瘤
, http://www.100md.com
肝细
胞癌
血管
瘤
血管
肉瘤
56周
对照组
9
0
0
0
0
0
, 百拇医药
实验组
11
2
0
0
2
36.4*
71周
对照组
30
0
1
0
, 百拇医药 1
6.7
实验组
26
2
5
1
1
34.6**
注：与对照组比较，* P>0.05，** P<0.01表3 各组动物肾脏肿瘤发生情况 组别
动物
数(只)
, 百拇医药
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
纤维
腺瘤
腺瘤
纤维
肉瘤
血管
肉瘤
56周
对照组
9
, 百拇医药 0
0
0
0
0
实验组
11
0
1
1
0
18.2*
71周
对照组
, 百拇医药
30
0
1
2
2
13.3
实验组
26
1
3
4
4
42.3**
, http://www.100md.com 注：对照组中1例同时出现左肾腺瘤、右肾纤维肉瘤；实验组中1例同时出现左肾血管肉瘤、右肾腺瘤，与对照组比较，* P>0.05，** P<0.05
2.肝组织GGT和GSTP的表达：肝GGT灶(>0.03 mm2)和GSTP灶(>0.06 mm2)的情况见表4、5。右前叶GGT和GSTP(>0.06 mm2)的比较见表6。
表4 肝细胞代偿性增生对NDMA致大鼠肝GGT灶的影响(
±s) 组别
动物数
(只)
灶数
, http://www.100md.com
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
56周
对照组
9
1.63±2.30
0.09±0.13
0.03±0.33
, http://www.100md.com
实验组
9
9.57±6.24**
1.06±1.33*
0.08±0.08*
71周
对照组
28
9.48±5.96
0.89±0.94
0.08±0.04
实验组
, 百拇医药
25
13.47±6.95**
2.44±2.40**
0.16±0.11**
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.01表5 肝细胞代偿性增生对NDMA致大鼠肝
右前叶GSTP灶的影响(
±s) 组别
动物数
(只)
灶数
, http://www.100md.com
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
56周
对照组
9
5.64±7.14
0.68±0.91
0.11±0.03
, 百拇医药
实验组
9
9.22±5.03*
2.78±2.99*
0.27±0.22*
71周
对照组
28
10.39±11.09
2.49±2.94
0.25±0.25
, http://www.100md.com 实验组
25
22.30±13.52**
7.33±7.23**
0.34±0.33*
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.01表6 大鼠右前叶两种标记酶阳性肝细胞灶的比较(±s) 标记酶
动物数
(只)
灶数
, 百拇医药
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
GGT
71
22.15±11.26
1.65±2.33
0.07±0.08
GSTP
, http://www.100md.com
71
32.16±23.47*
4.80±5.63*
0.15±0.18*
注：* 与GGT比较 P<0.01
变异肝细胞灶和结节可见表达一种或两种酶。变异肝细胞灶中GGT显示较多的回变,而GSTP罕见回变。肝血管肿瘤未见两种酶表达。肾皮质中增生的肾小管和纤维腺瘤的腺上皮有很强的GSTP表达。肺内支气管上皮细胞见GSTP阳性，而肺腺瘤未见GSTP表达。
3.肝组织PCNA检测结果：PCNA阳性细胞在变异肝细胞灶和结节、肝细胞癌和血管肉瘤多见，在肝细胞腺瘤和血管瘤少见，正常肝组织仅见单个散在分布的PCNA阳性细胞。
, 百拇医药
4.肝组织IGF-Ⅱ及癌基因mRNA的表达：IGF-Ⅱ及c-myc、H-ras mRNA的表达在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和肝腺瘤减弱，仅见散在分布或灶性分布的阳性细胞，上述病变周围的部分肝细胞也见表达(图2～4)，但肝血管肿瘤细胞未见明显表达。正常和病变组织未见c-jun mRNA明显表达。
图1 肝细胞癌 HE×400 图2 肝组织细胞显示IGF-Ⅱ阳性 LSAB法 苏木素复染×400 图3 肝组织变异肝细胞灶细胞c-myc mRNA呈阳性反应 cDNA-RNA原位杂交×400 图4 肝组织变异肝细胞灶细胞H-ras mRNA呈阳性反应 cDNA-RNA原位杂交×400讨论
, 百拇医药
肝细胞代偿性增生是NDMA致癌作用的主要影响因素之一。PH后经一次低剂量NDMA作用，观察至终生大鼠发生肝细胞癌[5]。多次低剂量NDMA多致大鼠肝间质肿瘤或腺瘤。本研究证实，PH对多次低剂量NDMA致肝、肾肿瘤发生有作用，实验模型具有潜伏时间较短、肝实质肿瘤发生率较高和较接近人类肿瘤发生的特点。PH后肝细胞代偿性增生促进NDMA致癌作用的机理可能是：PH后NDMA诱导的DNA加合物所致的碱基突变易于通过DNA合成而固定成为持久性的遗传学改变[5]；PH后免疫活性细胞的增殖受抑制，造成有利于肿瘤生长的机体环境[6]，但其机理有待进一步研究。
在NDMA致肝癌变中，GSTP表达较GGT高且稳定，并首次发现在NDMA致肾癌中可见GSTP表达，表明GSTP以其敏感、持续时间长、多组织表达且稳定的特点有较广泛的应用前景。
实验性肝癌变是一个多阶段和多基因参与的复杂过程，各阶段有其特异性基因表达[7]。在肝癌变早期变异肝细胞灶、结节和肝肿瘤中，IGF-Ⅱ有不同程度的表达。本研究结果显示，IGF-Ⅱ的表达在NDMA所致变异肝细胞灶和结节较高，与文献报道一致，但在肝细胞癌和腺瘤明显减弱，与文献报道不完全一致[8]。在化学致肝癌早期，可出现c-myc或H-ras mRNA的过量表达[9]。本研究发现IGF-Ⅱ和c-myc、H-ras mRNA的表达出现明显的一致性，在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和腺瘤较弱。表明这三种基因的过度表达在NDMA致肝肿瘤的发生发展中可能具有协同作用，对维持细胞的恶性表型起一定作用，但不是关键因素。这三种基因可能不是肝血管肿瘤的相关基因。近年发现在化学致肝癌变早期，癌前病变和单个肝细胞出现c-jun基因的过量表达[10]。我们发现在NDMA致肝癌变过程的后期，肝脏各种病变组织未见c-jun mRNA表达，表明c-jun基因在肝癌变的后期可能不起作用。
, 百拇医药
本课题受广东省青年自然科学基金(基金编号940223)和医药卫生青年科研基金资助(基金编号940178)
参考文献
1 Bannasch P, Zerban H. Pathology of tumours in laboratory animals. Tumours of the rat. Tumours of the liver. IARC Sci Publ, 1990, 99:199-240.
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3 Solt D, Farber E. New principle for the analysis of chemical carcinogenesis. Nature, 1976, 263:701-703.
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4 Lee VM, Cameron RG, Archer MC. The role of hepatocyte heterogeneity in the initiation of hepatocarcinogenesis. Carcinogenesis, 1993, 14: 1403-1408.
5 Craddock VM. Induction of liver tumours in rats by a single treatment with nitroso compounds given after partal hepatectomy. Nature, 1973, 245:386-388.
6 孙建华，伊藤寿记，张平，等. 肝部分切除和术中输血对肿瘤细胞生长的促进作用. 中华肿瘤杂志，1996, 18:113-115.
7 Pitot HC. Stage-specific gene expression during hepato carcinogenesis in the rat. J Cancer Res Clin Oncol, 1996, 122: 257-265.
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8 Ueno T, Takahashi K, Matsuguchi T, et al. Reactivation of rat insulin-like growth factor Ⅱ gene during hepatocarcinogenesis. Carcinogenesis, 1988, 9: 1779-1783.
9 Simile MM, Pascale R, De-Miglio MR, et al. Correlation between S-adenosyl-L-methionine confent and production of c-myc, c-Ha-ras, and c-ki-ras mRNA transcripts in the early stages of rat liver carcinogenesis. Cancer Lett, 1994, 79:9-16.
10 Nakano H, Hatayama I, Satoh K, et al. c-jun expression in single cells and preneoplastic foci induced by diethylnitrosamine in B6C3F1 mice. Carcinogenesis, 1994, 15:1853-1857.
(收稿：1996-12-20 修回：1997-06-06), 百拇医药
单位：510060 广州，中山医科大学肿瘤研究所病理研究室
关键词：肝肿瘤，实验性；增生；二甲基亚硝胺
中华病理学杂志980207 【摘要】 目的 探讨肝细胞代偿性增生对二甲基亚硝胺(NDMA)致大鼠肿瘤作用的影响。方法 对照组用NDMA处理，实验组首次NDMA处理前24小时行部分肝切除术。观察肿瘤发生情况及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GSTP)、增殖细胞核抗原(PCNA)和癌基因的表达。结果 实验组肝脏GGT和 GSTP灶的数量和面积高于对照组，GSTP的表达高于GGT，肾癌变过程中见GSTP的表达。实验组第56周肿瘤总发生率和第71周肿瘤总发生率及肝、肾肿瘤发生率高于对照组。PCNA阳性细胞数量与肝病变组织的增殖情况一致。胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)与c-myc、H-ras mRNA的表达在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和腺瘤较弱，肝组织未见c-jun mRNA表达。结论 肝细胞代偿性增生促进多次低剂量NDMA的致癌作用。IGF-Ⅱ与c-myc、H-ras 基因产物的过量表达在肝癌发生、发展中可能具有协同作用。
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Influence of compensatory hepatocyte proliferation on the carcinogenesis of N-nitrosodimethylamine Chen Danyang, Yan Ruiqi, Ye Yanli, et al. Cancer Institute, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective To study the influence of compensatory hepatocyte proliferation on the N-nitrosodimethylamine (NDMA) carcinogenesis in rats. Methods NDMA was given to animals of the experimental group 24 hours after partial hepatectomy, and the control group was only treated with NDMA. Expression of γ-glutamyltransferase (GGT), glutathione S-transferase placental form (GSTP), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), insulin-like growth factor-Ⅱ (IGF-Ⅱ) and oncogenes was detected. Results The numbers and areas of GGT - and GSTP-foci in the experimental group were significantly increased in comparing with the control groups. The expression of GSTP was higher than that of GGT. The total tumor incidence of the experimental group was higher than that of the control by the end of the 56th week. Up to week 71, the incidnces of liver and other tumors were higher respectively in the experimental group. The amount of PCNA positive cells were corresponding with proliferative condition of the hepatic lesions. The expression of IGF-Ⅱ ,c-myc and H-ras mRNA increased in the altered hepatocyte foci and nodules, but markedly decreased in hepatocellular carcinoma and adenoma. No c-jun mRNA expression was detected in all the normal and abnormal tissues of liver. Conclusions The results suggest that compensatory hepatocyte proliferation enhances the carcinogenesis induced by multiple doses of NDMA, and the over expression of IGF-Ⅱ, c-myc, H-ras may play a synergetic role in NDMA-induced hepatocarcinogenesis.
, 百拇医药
【Key words】 Liver neoplasms, experimental Hyperplasia Dimethylnitrosamine
二甲基亚硝胺(NDMA)普遍存在于环境中，可能是肝癌等肿瘤的致病因素之一。人类在生物和化学等因素作用下可出现肝损伤后的代偿性增生过程，且不可避免地经常接触NDMA等环境致癌物。因此，模拟人类肿瘤发生情况，观察在肝细胞代偿性增生状况下长期接触低剂量NDMA后肿瘤发生的情况是必要的，目前尚缺乏此类研究。我们对此作了探讨并研究了NDMA致癌过程中标记酶和多种癌基因表达的变化。
材料与方法
1.材料：清洁级SD大鼠由本校实验动物中心提供。NDMA为Sigma公司产品。兔抗大鼠胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GSTP)抗体为Bioprep公司产品。猪抗兔免疫球蛋白和兔过氧化物酶抗过氧化物酶为DAKO公司产品。 小鼠抗大鼠胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)单克隆抗体为Uptate Biotechnology公司产品。 Immunostain SP试剂盒为Maxin公司产品。电脑化图形扫描分析系统，自行装配。用随机引物生物素标记法标记的c-myc、H-ras、c-jun cDNA探针，购自北京中山生物技术有限公司。
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2.动物实验：雄性SD大鼠(73～120g)81只，置清洁级动物实验室饲养，随机分两组。对照组：40只，腹腔注射每次NDMA 6mg/kg体重，每周2次，共28次；实验组：41只，首次腹腔注射NDMA前24小时行部分肝切除术(PH)，NDMA给药方法同对照组。以实验观察期间发现首例肿瘤时存活的动物数为有效动物数。在实验第56和71周二组分别处死一批动物，取肝、肾、肺和疑有肿瘤的其它组织，用10%中性福马林和冷酒精、丙酮溶液固定。
3.形态学观察：肿瘤的组织学分类参照文献[1，2]进行。统计学方法为χ2检验或四格表的确切概率法。
4.γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、GSTP的检测和图像分析：GGT和GSTP的检测分别用组化和PAP法，参考文献[3，4]方法进行。图像分析方法：将切片放大10倍并将图形描绘在复印纸上；镜下观察切片以核对所绘制图形的准确性；用扫描仪将图形按1∶1扫描；用电子计算机测出平均每cm2肝切面中，GGT和GSTP灶的灶数(个/cm2)、灶面积(mm2/cm2)以及灶平均面积(mm2/个)。统计学方法为t检验。
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5.增殖细胞核抗原(PCNA)和IGF-Ⅱ的检测，用LSAB法，按说明书操作和判定结果。
6.c-myc、H-ras和c-jun mRNA检测：用c-DNA-RNA原位杂交技术。 结果
1.形态观察和肿瘤发生情况：各组动物肿瘤发生率、各类型肿瘤及其发生情况见表1～3和图1。
表1 各组动物肿瘤发生情况 组别
有效
动物
数(只)
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
, http://www.100md.com
肝脏
肾脏
肺脏
皮下结
缔组织
原发
转移
56周
对照组
9
0
0
0
0
, http://www.100md.com
0
0
实验组
11
4
2
0
1a
0
54.5*
71周
对照组
30
, 百拇医药
2
4b
2
0
0
26.7
实验组
26
9
11c
1
1a
2d
, 百拇医药
69.2**
注：a：肺转移性肾腺瘤；b：其中1例出现左、右肾肿瘤；c：其中1例出现2种类型肾肿瘤，3例同时出现肝肿瘤；d：为纤维瘤和纤维肉瘤，其中1例同时出现肝肿瘤，1例同时出现肾肿瘤.* P<0.05，** P<0.005表2 各组动物肝脏肿瘤发生情况 组别
动物
数(只)
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
肝细胞
腺瘤
, http://www.100md.com
肝细
胞癌
血管
瘤
血管
肉瘤
56周
对照组
9
0
0
0
0
0
, 百拇医药
实验组
11
2
0
0
2
36.4*
71周
对照组
30
0
1
0
, 百拇医药 1
6.7
实验组
26
2
5
1
1
34.6**
注：与对照组比较，* P>0.05，** P<0.01表3 各组动物肾脏肿瘤发生情况 组别
动物
数(只)
, 百拇医药
肿瘤发生例数
肿瘤发生率
(%)
纤维
腺瘤
腺瘤
纤维
肉瘤
血管
肉瘤
56周
对照组
9
, 百拇医药 0
0
0
0
0
实验组
11
0
1
1
0
18.2*
71周
对照组
, 百拇医药
30
0
1
2
2
13.3
实验组
26
1
3
4
4
42.3**
, http://www.100md.com 注：对照组中1例同时出现左肾腺瘤、右肾纤维肉瘤；实验组中1例同时出现左肾血管肉瘤、右肾腺瘤，与对照组比较，* P>0.05，** P<0.05
2.肝组织GGT和GSTP的表达：肝GGT灶(>0.03 mm2)和GSTP灶(>0.06 mm2)的情况见表4、5。右前叶GGT和GSTP(>0.06 mm2)的比较见表6。
表4 肝细胞代偿性增生对NDMA致大鼠肝GGT灶的影响(
±s) 组别动物数
(只)
灶数
, http://www.100md.com
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
56周
对照组
9
1.63±2.30
0.09±0.13
0.03±0.33
, http://www.100md.com
实验组
9
9.57±6.24**
1.06±1.33*
0.08±0.08*
71周
对照组
28
9.48±5.96
0.89±0.94
0.08±0.04
实验组
, 百拇医药
25
13.47±6.95**
2.44±2.40**
0.16±0.11**
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.01表5 肝细胞代偿性增生对NDMA致大鼠肝
右前叶GSTP灶的影响(
±s) 组别动物数
(只)
灶数
, http://www.100md.com
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
56周
对照组
9
5.64±7.14
0.68±0.91
0.11±0.03
, 百拇医药
实验组
9
9.22±5.03*
2.78±2.99*
0.27±0.22*
71周
对照组
28
10.39±11.09
2.49±2.94
0.25±0.25
, http://www.100md.com 实验组
25
22.30±13.52**
7.33±7.23**
0.34±0.33*
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.01表6 大鼠右前叶两种标记酶阳性肝细胞灶的比较(
±s) 标记酶动物数
(只)
灶数
, 百拇医药
(个/cm2)
灶面积
(mm2/cm2)
灶平均面积
(mm2/个)
GGT
71
22.15±11.26
1.65±2.33
0.07±0.08
GSTP
, http://www.100md.com
71
32.16±23.47*
4.80±5.63*
0.15±0.18*
注：* 与GGT比较 P<0.01
变异肝细胞灶和结节可见表达一种或两种酶。变异肝细胞灶中GGT显示较多的回变,而GSTP罕见回变。肝血管肿瘤未见两种酶表达。肾皮质中增生的肾小管和纤维腺瘤的腺上皮有很强的GSTP表达。肺内支气管上皮细胞见GSTP阳性，而肺腺瘤未见GSTP表达。
3.肝组织PCNA检测结果：PCNA阳性细胞在变异肝细胞灶和结节、肝细胞癌和血管肉瘤多见，在肝细胞腺瘤和血管瘤少见，正常肝组织仅见单个散在分布的PCNA阳性细胞。
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4.肝组织IGF-Ⅱ及癌基因mRNA的表达：IGF-Ⅱ及c-myc、H-ras mRNA的表达在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和肝腺瘤减弱，仅见散在分布或灶性分布的阳性细胞，上述病变周围的部分肝细胞也见表达(图2～4)，但肝血管肿瘤细胞未见明显表达。正常和病变组织未见c-jun mRNA明显表达。
图1 肝细胞癌 HE×400 图2 肝组织细胞显示IGF-Ⅱ阳性 LSAB法 苏木素复染×400 图3 肝组织变异肝细胞灶细胞c-myc mRNA呈阳性反应 cDNA-RNA原位杂交×400 图4 肝组织变异肝细胞灶细胞H-ras mRNA呈阳性反应 cDNA-RNA原位杂交×400讨论
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肝细胞代偿性增生是NDMA致癌作用的主要影响因素之一。PH后经一次低剂量NDMA作用，观察至终生大鼠发生肝细胞癌[5]。多次低剂量NDMA多致大鼠肝间质肿瘤或腺瘤。本研究证实，PH对多次低剂量NDMA致肝、肾肿瘤发生有作用，实验模型具有潜伏时间较短、肝实质肿瘤发生率较高和较接近人类肿瘤发生的特点。PH后肝细胞代偿性增生促进NDMA致癌作用的机理可能是：PH后NDMA诱导的DNA加合物所致的碱基突变易于通过DNA合成而固定成为持久性的遗传学改变[5]；PH后免疫活性细胞的增殖受抑制，造成有利于肿瘤生长的机体环境[6]，但其机理有待进一步研究。
在NDMA致肝癌变中，GSTP表达较GGT高且稳定，并首次发现在NDMA致肾癌中可见GSTP表达，表明GSTP以其敏感、持续时间长、多组织表达且稳定的特点有较广泛的应用前景。
实验性肝癌变是一个多阶段和多基因参与的复杂过程，各阶段有其特异性基因表达[7]。在肝癌变早期变异肝细胞灶、结节和肝肿瘤中，IGF-Ⅱ有不同程度的表达。本研究结果显示，IGF-Ⅱ的表达在NDMA所致变异肝细胞灶和结节较高，与文献报道一致，但在肝细胞癌和腺瘤明显减弱，与文献报道不完全一致[8]。在化学致肝癌早期，可出现c-myc或H-ras mRNA的过量表达[9]。本研究发现IGF-Ⅱ和c-myc、H-ras mRNA的表达出现明显的一致性，在变异肝细胞灶和结节较高，在肝细胞癌和腺瘤较弱。表明这三种基因的过度表达在NDMA致肝肿瘤的发生发展中可能具有协同作用，对维持细胞的恶性表型起一定作用，但不是关键因素。这三种基因可能不是肝血管肿瘤的相关基因。近年发现在化学致肝癌变早期，癌前病变和单个肝细胞出现c-jun基因的过量表达[10]。我们发现在NDMA致肝癌变过程的后期，肝脏各种病变组织未见c-jun mRNA表达，表明c-jun基因在肝癌变的后期可能不起作用。
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本课题受广东省青年自然科学基金(基金编号940223)和医药卫生青年科研基金资助(基金编号940178)
参考文献
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10 Nakano H, Hatayama I, Satoh K, et al. c-jun expression in single cells and preneoplastic foci induced by diethylnitrosamine in B6C3F1 mice. Carcinogenesis, 1994, 15:1853-1857.
(收稿：1996-12-20 修回：1997-06-06), 百拇医药