人肝癌组织肿瘤浸润淋巴细胞穿孔素、Fas配体表达的研究
作者：钱其军 吴孟超 曲增强 方石岗 王华菁 曹惠芳 贾随旺 郭亚军
单位：
关键词：肝肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；配体；穿孔素
New Page 1 【摘要】 目的 研究肝癌组织肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的穿孔素及Fas配体(Fas-L)表达情况。方法 应用原位杂交及免疫组化ABC方法检测20例病人原发性肝细胞癌组织的TIL中穿孔素及Fas-L的mRNA及其蛋白的表达情况。结果 20例肝癌病人中16例(占80%)肝癌组织中TIL表达穿孔素及Fas-L，其中1例病人的绝大多数TIL表达穿孔素及Fas-L，该例病人手术后1年6个月仍未复发，除该例以外，其余15例肝癌组织中TIL的穿孔素及Fas-L表达率<10%。结论 绝大多数肝癌组织中存在着具有杀伤活性的TIL细胞，然而，这种具有杀伤活性TIL细胞仅占总TIL细胞的极少一部分，需要体内或体外进一步扩增。
, 百拇医药
Perforin and Fas-ligand expression of tumor infiltrating lymphocytes in human hepatocellular carcinoma Qian Qijun, Wu Mengchao, Qu Zengqiang, et al. Tumor Immunology and Gene Therapy Center, Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate perforin and Fas-ligand (Fas-L) expression of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) in human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Expression of perforin and Fas-L of TIL was studied in 20 HCC cases using in situ hybridization and immunohistochemistry. Results Expression of perforin and Fas-L gene were detected in TIL in 80% of the cases studied. Among them, one patient (no. 14) in whom expression of perforin and Fas-L were noticed in the majority of the TIL, had no recurrence of HCC for one and one half (1.5) year after tumor resection. It indicates that presence of large number of activated T cells might be beneficial for the tumor therapy. In the remaining cases, only 10% of TIL were obtained able to express perforin and Fas-L indicating that only a few TIL were activated and cytotoxic to HCC. Conclusions Even there were a multitude of T cells infiltrating in HCC, only few of them were immunoactived and to be cytotoxic to HCC. It seems important to adopt measures in order to promote further proliferation of these activated T cells either in vitro or in vivo.
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【Key words】 Liver neoplasms Lymphocytes, tumor-infiltrating Ligands Perforin
对肿瘤的杀伤主要通过细胞毒T细胞(CTL)。CTL对肿瘤的杀伤主要通过两条途径[1，2]：(1) 穿孔素途径，当CTL细胞的T细胞受体与肿瘤细胞的MHC抗原结合后，释放颗粒，其颗粒中含有穿孔素及颗粒酶，穿孔素使肿瘤细胞形成孔，然后颗粒酶进入细胞，使肿瘤细胞死亡。(2) Fas配体(Fas-L)途径：T细胞激活后，产生Fas-L，将与肿瘤细胞表面的Fas抗原结合，直接诱导肿瘤细胞死亡。尽管我国已开始应用TIL治疗肿瘤，并研究了TIL的表型如CD3、CD4及CD8等[3]，但尚未见到研究T细胞直接起杀伤作用两个基因穿孔素及Fas-L mRNA及其表达产物的报道，为此，我们研究肝癌组织中TIL的穿孔素Fas-L表达情况，这有利于了解在肝癌组织中是否存在有杀伤功能的T细胞，为体内或体外分离及扩增这种T细胞提供实验基础。
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材料与方法
1.材料：所有标本取自东方肝胆外科医院1994年1月至6月手术切除的原发性肝癌标本，共20例，经病理证实为肝细胞癌，病人男性16例，女性4例，年龄25～64岁，平均年龄47岁，17例伴肝硬化，3例不伴肝硬化，用作对照3例取自肝血管瘤周围的正常肝组织。新鲜正常肝，肝癌组织离体后半小时内液氮速冻，然后转至-70℃冰箱超低温冷藏，标本分别用于各项检查。取少许癌与癌旁交界处组织，OCT包埋，-20℃连续恒温冰冻切片数张6 μm)，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水后，-70℃保存，冰冻切片分别用于HE染色，原位杂交及免疫组化研究。人Fas-L cDNA由日本Osaka Bioscience研究所Nagata博士惠赠。人穿孔素cDNA由澳大利亚Austin研究所Kevin Y.T.Thia博士惠赠。兔抗人Fas-L多抗购于美国Santa Cruz生物技术公司。鼠抗人穿孔素单抗由美国Miami大学医学院Eckhard R Padack博士惠赠。地高辛标记及检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。链霉亲合素一生物放大系统免疫组化试剂盒由德国WAK公司生产。
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图1 TIL浸润，主要存在于肝癌间质中，肝癌实质内也广泛存在 HE×100 图2 肝癌组织中TIL穿孔素免疫组织化学染色强阳性 ABC法×100 图3 肝癌组织中TIL Fas-L免疫组织化学染色强阳性 ABC法×100 (图1～3均为NO.14病人的同一视野拍摄) 2.方法：(1) HE染色。(2) 原位分子杂交：探针标记按Boehringer Mannheim公司地高辛试剂盒提供的随机引物法进行。原位杂交探针操作流程参照文献[3]。杂交探针浓度为1×103 μg/L。镜下观察细胞出现蓝色颗粒为阳性。(3) 免疫组织化学以ABC方法进行DAB显色、免疫组化结果判断，镜下观察细胞出现棕黄色颗粒为阳性。
结果
1.HE染色及免疫组化：3例正常肝组织中仅见少量淋巴细胞，其中淋巴细胞中穿孔素及Fas-L均阴性，19例肝癌组织中，可见不同程度TIL浸润，绝大多数TIL细胞存在于肝癌间质中，肝实质中相对少见。而另1例病人(No.14)TIL细胞除存在于肝癌间质外，还广泛出现在肝实质中，应用免疫组织化学检测发现该例肝癌组织中TIL细胞绝大多数均出现穿孔素及Fas-L阳性(图1～3)，经随访该例病人手术后1年6个月，仍末见复发。15例病人TIL细胞中出现穿孔素及Fas-L阳性，其阳性率<10%。而另4例病人尽管在肝癌间质中存在着不同程度的TIL细胞浸润，但TIL细胞无穿孔素及Fas-L阳性。在肝癌组织中TIL细胞的数量与穿孔素及Fas-L阳性率无明显关系。
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2.原位杂交：3例正常肝中无穿孔素及Fas-L的杂交阳性信号。在肝癌标本中，1例(No.14)TIL的穿孔素和Fas-L均出现广泛性强阳性杂交信号，15例病人TIL细胞出现少量阳性，4例为阴性。与免疫组化结果相似，这表明在肝癌组织TIL的穿孔素和Fas-L的转录水平与蛋白水平相一致。
讨论
TIL是主要存在于肿瘤间质内的T细胞为主的一个异质性淋巴细胞群体。早在1907年人们就发现了在肿瘤组织中存在着浸润淋巴细胞，并推测淋巴细胞浸入到肿瘤组织内就是体内免疫系统对肿瘤的抵抗现象，随后研究发现肿瘤部位的淋巴细胞浸润程度愈高，患者预后愈好[4]。早年对TIL的研究主要为TIL的表型。近年来的研究表明，T细胞杀伤肿瘤细胞主要通过穿孔素及Fas-L途径，因此研究肿瘤组织中TIL细胞中穿孔素及Fas-L表达情况可直接了解肿瘤组织TIL是否具有杀伤力。1994年Leger-Ravet等[5]在10例滤泡性淋巴瘤中均发现少量TIL细胞表达穿孔素及颗粒酶B。我们研究20例肝癌标本，发现16例TIL中有不同程度穿孔素和Fas-L表达，4例阴性，这表明绝大多数肝癌病人存在着细胞毒性T淋巴细胞，其中1例病人在肝癌间质及实质中均大量存在表达Fas-L及穿孔素的TIL，该例病人随访1年6个月仍未复发，提示大量具有杀伤活性的T淋巴细胞存在有利于肝癌的治疗；除上述1例以外，其余19例标本中TIL细胞穿孔素及Fas-L阳性率均不足10%，这表明绝大多数TIL均处于免疫抑制状态。这可能是因为：(1)肝癌缺乏第二信号B7基因表达，难以激活T淋巴细胞。(2)激活T细胞由于同时存在Fas及Fas-L高表达，可导致自身凋亡[6，7]。因此，在体内或体外扩增这种具有杀伤活性的T细胞有望提高肿瘤的疗效。
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本课题受国家自然科学基金(基金编码39500082)和国家教委及上海市博士后基金资助
参考文献
1 Kagi D, Vignaux F, Ledermann B, et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell mediated-cytotoxicity. Science, 1994, 265：528-530.
2 Lowin B, Hahne M, Mattmann C, et al. Cytolytic T-cell cytotoxicity is mediated through perforin and Fas lytic pathways. Nature, 1994, 370：650-652.
3 郭亚军，吴孟超，孔宪涛，等.原发性肝癌及其癌周围组织免疫反应研究.中华实验外科杂志，1987，4：545-547.
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4 Lipponen PK, Eskelinen MJ, Jakhiainen K, et al. Tumor infiltrating lymphocytes as an independent prognostic factor in transitional cell bladder cancer. Eur J Cancer, 1992, 29：69-75.
5 Leger-Ravet M, Devergne O, Peuchmaur M, et al. In situ detection of activated cytotoxic cells in follicular lymphomas. Am J Pathol, 1994, 144：492-499.
6 Dhein J, Walczak H, B
umler C, et al. Autocrine T-cell suicide medated by APO-1/(Fas/CD95). Nature, 1995, 373：438-441.
7 Alderson MR, Tough TW, Davis-Smith T, et al. Fas ligand mediates activationinduced cell death in human T lymphocytes. J Exp Med, 1995, 181：71-77.
(收稿：1997-02-17 修回：1997-11-18), http://www.100md.com
单位：
关键词：肝肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；配体；穿孔素
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Perforin and Fas-ligand expression of tumor infiltrating lymphocytes in human hepatocellular carcinoma Qian Qijun, Wu Mengchao, Qu Zengqiang, et al. Tumor Immunology and Gene Therapy Center, Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate perforin and Fas-ligand (Fas-L) expression of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) in human hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Expression of perforin and Fas-L of TIL was studied in 20 HCC cases using in situ hybridization and immunohistochemistry. Results Expression of perforin and Fas-L gene were detected in TIL in 80% of the cases studied. Among them, one patient (no. 14) in whom expression of perforin and Fas-L were noticed in the majority of the TIL, had no recurrence of HCC for one and one half (1.5) year after tumor resection. It indicates that presence of large number of activated T cells might be beneficial for the tumor therapy. In the remaining cases, only 10% of TIL were obtained able to express perforin and Fas-L indicating that only a few TIL were activated and cytotoxic to HCC. Conclusions Even there were a multitude of T cells infiltrating in HCC, only few of them were immunoactived and to be cytotoxic to HCC. It seems important to adopt measures in order to promote further proliferation of these activated T cells either in vitro or in vivo.
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【Key words】 Liver neoplasms Lymphocytes, tumor-infiltrating Ligands Perforin
对肿瘤的杀伤主要通过细胞毒T细胞(CTL)。CTL对肿瘤的杀伤主要通过两条途径[1，2]：(1) 穿孔素途径，当CTL细胞的T细胞受体与肿瘤细胞的MHC抗原结合后，释放颗粒，其颗粒中含有穿孔素及颗粒酶，穿孔素使肿瘤细胞形成孔，然后颗粒酶进入细胞，使肿瘤细胞死亡。(2) Fas配体(Fas-L)途径：T细胞激活后，产生Fas-L，将与肿瘤细胞表面的Fas抗原结合，直接诱导肿瘤细胞死亡。尽管我国已开始应用TIL治疗肿瘤，并研究了TIL的表型如CD3、CD4及CD8等[3]，但尚未见到研究T细胞直接起杀伤作用两个基因穿孔素及Fas-L mRNA及其表达产物的报道，为此，我们研究肝癌组织中TIL的穿孔素Fas-L表达情况，这有利于了解在肝癌组织中是否存在有杀伤功能的T细胞，为体内或体外分离及扩增这种T细胞提供实验基础。
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材料与方法
1.材料：所有标本取自东方肝胆外科医院1994年1月至6月手术切除的原发性肝癌标本，共20例，经病理证实为肝细胞癌，病人男性16例，女性4例，年龄25～64岁，平均年龄47岁，17例伴肝硬化，3例不伴肝硬化，用作对照3例取自肝血管瘤周围的正常肝组织。新鲜正常肝，肝癌组织离体后半小时内液氮速冻，然后转至-70℃冰箱超低温冷藏，标本分别用于各项检查。取少许癌与癌旁交界处组织，OCT包埋，-20℃连续恒温冰冻切片数张6 μm)，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水后，-70℃保存，冰冻切片分别用于HE染色，原位杂交及免疫组化研究。人Fas-L cDNA由日本Osaka Bioscience研究所Nagata博士惠赠。人穿孔素cDNA由澳大利亚Austin研究所Kevin Y.T.Thia博士惠赠。兔抗人Fas-L多抗购于美国Santa Cruz生物技术公司。鼠抗人穿孔素单抗由美国Miami大学医学院Eckhard R Padack博士惠赠。地高辛标记及检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。链霉亲合素一生物放大系统免疫组化试剂盒由德国WAK公司生产。
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图1 TIL浸润，主要存在于肝癌间质中，肝癌实质内也广泛存在 HE×100 图2 肝癌组织中TIL穿孔素免疫组织化学染色强阳性 ABC法×100 图3 肝癌组织中TIL Fas-L免疫组织化学染色强阳性 ABC法×100 (图1～3均为NO.14病人的同一视野拍摄) 2.方法：(1) HE染色。(2) 原位分子杂交：探针标记按Boehringer Mannheim公司地高辛试剂盒提供的随机引物法进行。原位杂交探针操作流程参照文献[3]。杂交探针浓度为1×103 μg/L。镜下观察细胞出现蓝色颗粒为阳性。(3) 免疫组织化学以ABC方法进行DAB显色、免疫组化结果判断，镜下观察细胞出现棕黄色颗粒为阳性。
结果
1.HE染色及免疫组化：3例正常肝组织中仅见少量淋巴细胞，其中淋巴细胞中穿孔素及Fas-L均阴性，19例肝癌组织中，可见不同程度TIL浸润，绝大多数TIL细胞存在于肝癌间质中，肝实质中相对少见。而另1例病人(No.14)TIL细胞除存在于肝癌间质外，还广泛出现在肝实质中，应用免疫组织化学检测发现该例肝癌组织中TIL细胞绝大多数均出现穿孔素及Fas-L阳性(图1～3)，经随访该例病人手术后1年6个月，仍末见复发。15例病人TIL细胞中出现穿孔素及Fas-L阳性，其阳性率<10%。而另4例病人尽管在肝癌间质中存在着不同程度的TIL细胞浸润，但TIL细胞无穿孔素及Fas-L阳性。在肝癌组织中TIL细胞的数量与穿孔素及Fas-L阳性率无明显关系。
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2.原位杂交：3例正常肝中无穿孔素及Fas-L的杂交阳性信号。在肝癌标本中，1例(No.14)TIL的穿孔素和Fas-L均出现广泛性强阳性杂交信号，15例病人TIL细胞出现少量阳性，4例为阴性。与免疫组化结果相似，这表明在肝癌组织TIL的穿孔素和Fas-L的转录水平与蛋白水平相一致。
讨论
TIL是主要存在于肿瘤间质内的T细胞为主的一个异质性淋巴细胞群体。早在1907年人们就发现了在肿瘤组织中存在着浸润淋巴细胞，并推测淋巴细胞浸入到肿瘤组织内就是体内免疫系统对肿瘤的抵抗现象，随后研究发现肿瘤部位的淋巴细胞浸润程度愈高，患者预后愈好[4]。早年对TIL的研究主要为TIL的表型。近年来的研究表明，T细胞杀伤肿瘤细胞主要通过穿孔素及Fas-L途径，因此研究肿瘤组织中TIL细胞中穿孔素及Fas-L表达情况可直接了解肿瘤组织TIL是否具有杀伤力。1994年Leger-Ravet等[5]在10例滤泡性淋巴瘤中均发现少量TIL细胞表达穿孔素及颗粒酶B。我们研究20例肝癌标本，发现16例TIL中有不同程度穿孔素和Fas-L表达，4例阴性，这表明绝大多数肝癌病人存在着细胞毒性T淋巴细胞，其中1例病人在肝癌间质及实质中均大量存在表达Fas-L及穿孔素的TIL，该例病人随访1年6个月仍未复发，提示大量具有杀伤活性的T淋巴细胞存在有利于肝癌的治疗；除上述1例以外，其余19例标本中TIL细胞穿孔素及Fas-L阳性率均不足10%，这表明绝大多数TIL均处于免疫抑制状态。这可能是因为：(1)肝癌缺乏第二信号B7基因表达，难以激活T淋巴细胞。(2)激活T细胞由于同时存在Fas及Fas-L高表达，可导致自身凋亡[6，7]。因此，在体内或体外扩增这种具有杀伤活性的T细胞有望提高肿瘤的疗效。
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本课题受国家自然科学基金(基金编码39500082)和国家教委及上海市博士后基金资助
参考文献
1 Kagi D, Vignaux F, Ledermann B, et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell mediated-cytotoxicity. Science, 1994, 265：528-530.
2 Lowin B, Hahne M, Mattmann C, et al. Cytolytic T-cell cytotoxicity is mediated through perforin and Fas lytic pathways. Nature, 1994, 370：650-652.
3 郭亚军，吴孟超，孔宪涛，等.原发性肝癌及其癌周围组织免疫反应研究.中华实验外科杂志，1987，4：545-547.
, 百拇医药
4 Lipponen PK, Eskelinen MJ, Jakhiainen K, et al. Tumor infiltrating lymphocytes as an independent prognostic factor in transitional cell bladder cancer. Eur J Cancer, 1992, 29：69-75.
5 Leger-Ravet M, Devergne O, Peuchmaur M, et al. In situ detection of activated cytotoxic cells in follicular lymphomas. Am J Pathol, 1994, 144：492-499.
6 Dhein J, Walczak H, B
umler C, et al. Autocrine T-cell suicide medated by APO-1/(Fas/CD95). Nature, 1995, 373：438-441.7 Alderson MR, Tough TW, Davis-Smith T, et al. Fas ligand mediates activationinduced cell death in human T lymphocytes. J Exp Med, 1995, 181：71-77.
(收稿：1997-02-17 修回：1997-11-18), http://www.100md.com